用于检测黄曲霉毒素的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽药残留分析和免疫学技术领域，具体涉及一种能识别黄曲霉毒素 81、82、61、62的单克隆抗体和一种用于检测黄曲霉毒素81、82、61、62的酶联免疫方法 (ELISA)及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌的次级代谢产物，是一类结构相似的 化合物，都含有二呋喃环和香豆素，其有20多种，目前分离鉴定的有12种，常见的主要为黄 曲霉毒素8132、61、62、]?1、]\12。黄曲霉毒素主要污染农作物和饲料。使用了污染黄曲霉毒素 的饲料，可引起猪只产死胎和木乃伊胎，并可引起鸡产蛋率下降和口腔溃疡。经研究发现， 黄曲霉毒素具有明显的"三致"作用，人误食了污染了黄曲霉毒素的食物会引起中毒，甚至 死亡。
[0003] 目前检测黄曲霉毒素的方法主要为仪器方法和免疫学方法。仪器方法虽然灵敏、 准确、分离度高并且可进行多残留检测的定性、定量研究，但是需要昂贵的仪器、繁琐的前 处理、熟练的专业操作员。如果采用仪器分析法进行大批量样品的检测，其成本将非常高， 而且在目前的国家检测机构中大部分只有省市级才配备有精密的分析仪器。免疫化学分析 法特别是酶联免疫吸附分析技术具有快速、灵敏度高、操作简单、适应性强等优点，适合高 通量样品筛选，因此对于快速检测黄曲霉毒素的残留，ELISA方法更具优势。而制备较高灵 敏度的抗体是ELISA方法的根本，只有制备出较高灵敏度的抗体，才能制备出具有竞争性的 ELISA试剂盒。王雄等（2008)利用ELISA方法检测饲料中的黄曲霉毒素 B1，抗体的最低检测 限为0.05ng/mL，标准曲线的线性范围为0.05~2.00ng/mL，其抗体灵敏度不高，且使用的样 品前处理过程较为复杂，不便于在基层使用;王磊等(2012)制备了抗黄曲霉毒素 B1抗体，该 抗体的IC50值为2.58ng/mL;李敏等（2015)采用异源包被的抗原建立了 ELI SA方法，其抗体 灵敏度由1.6ng/mL提高到了0.3ng/mL，同时成功建立了 ELISA方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种能识别黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的单克隆抗体，以 提高识别的灵敏度和特异性;本发明的另一个目的是提供一种用于检测黄曲霉毒素 B1、B2、 G1、G2的酶联免疫方法及试剂盒，以提高检测的灵敏度、准确度和精密度，同时简化操作程 序。
[0005] 上述目的是通过以下技术方案实现的：
[0006] -种能识别黄曲霉毒素81、82、61、62的单克隆抗体，它是由杂交瘤细胞株六?81/ 3B9所分泌的。
[0007]所述的杂交瘤细胞株AFB1/3B9,保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC N0:C201558。
[0008]所述的单克隆抗体，它是以黄曲霉毒素 B2(AFB2)与羧甲基羟胺半盐酸盐(CM0)反 应生成黄曲霉毒素 B2肟(AFB20)，AFB20再与载体蛋白偶联得到的偶联物作为免疫原制备得 到的。本发明优选的免疫原载体蛋白是血蓝蛋白（KLH)。
[0009]所述的单克隆抗体可用于建立检测黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的ELISA方法。
[0010]所述的单克隆抗体可用于制备检测黄曲霉毒素趴』2、61、62的酶联免疫试剂盒。 [0011] 一种检测黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的ELISA方法，包括免疫原、包被原和抗体的制 备，间接竞争ELISA方法的建立，其步骤如下：
[0012] (1)将AFB2与CM0反应得到的半抗原AFB20;
[0013] (2)将AFB20与载体蛋白偶联，得到免疫原AFB20-DCC-KLH;
[0014] (3)将AFB20与载体蛋白偶联，得到包被原AFB20-EDC-BSA;
[0015] (4)用步骤(2)得到的免疫原获得保藏号CCTCC N0:C201558的杂交瘤细胞株AFB1/ 3B9；
[0016] (5)用保藏号为CCTCC N0:C201558的杂交瘤细胞株AFB1/3B9制备单克隆抗体；
[0017] (6)用步骤(3)得到的包被原包被固相载体；
[0018] (7)样品处理:准确称取饲料样品1 ±0.05g于50mL离心管中，加入4mL乙腈、lmL丙 酮，混合均匀，4000r/min离心5min，取上清lmL吹干，加入2mL的PBS缓冲溶液溶解，作为待测 样品溶液；
[0019] (8)对步骤(7)中的待测样品溶液进行酶联免疫检测。
[0020] 优选地，免疫原载体蛋白是血蓝蛋白（KLH)，包被原载体蛋白是牛血清白蛋白 (BSA)〇
[0021] 本发明的有益效果是：
[0022] (1)本发明在制备单克隆抗体时，采用黄曲霉毒素 B2肟为半抗原，将该半抗原与载 体蛋白偶联后得到免疫原，由该免疫原制备的单克隆抗体可特异性地识别黄曲霉毒素 B1、 B2、G1、G2，而且识别灵敏度高于现有的单克隆抗体，其中对黄曲霉毒素 B1的IC50值达到了 46.32ng/L；
[0023] (2)本发明建立的ELISA方法和试剂盒可以同时检测黄曲霉毒素价、82、61、62四种 毒素，不仅具有检测灵敏度、准确度高，精密度好等特点，而且样品处理和操作程序简单，具 有检测成本低、周期短等优点。
【附图说明】
[0024]图1为本发明的技术路线图。
【具体实施方式】
[0025]下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。
[0026]实施例1免疫原和包被原的制备
[0027] 1.1免疫原 AFB20-DCC-KLH 的制备
[0028] 取2mL浓度为lmg/mL的AFB2甲醇溶液，加入3mg的羧甲基羟胺半盐酸盐(CM0)和5mg 的碳酸钠，在室温下搅拌反应24h，然后用氮气吹干，加入0.05mol/L的盐酸2mL，将其充分溶 解，加入2mL的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层，重复3次;将取得的液体在氮气下吹干，即得到 半抗原黄曲霉毒素 B2肟(AFB20)。
[0029]用DMF将得到半抗原溶解，并加入12mg的DCC和5mg的NHS，活化12h，为A液;将2mL的 KLH溶于5mL的PBS溶液中，为B液。然后将A液缓慢加入B液中，在冰浴条件下反应12h;待反应 完全后，经其装入透析袋中，于PBS溶液中透析3~5天，每天换液3次。即得到完全抗原 AFB20-DCC-KLH。
[0030] 1 · 2包被原 AFB20-EDC-BSA的制备
[0031] 将得到的半抗原AFB20溶于DMF中，加入12mg的EDC和5mg的NHS，活化4h，为A液；将 16mg的牛血清白蛋白（BSA)溶于5mL的PBS溶液中，为B液;然后将A液缓慢加入B液中，在冰浴 条件下反应12h;待反应完全后，经其装入透析袋中，于PBS溶液中透析3~5天，每天换液3 次。即得到完全抗原AFB20-EDC-BSA。
[0032]实施例2单克隆抗体的制备 [0033] 2.1动物免疫
[0034]利用发明人所在的国家兽药残留基准实验室制备的免疫原(AFB20-DCC-KLH)免疫 Balb/C小鼠（购自湖北省医学科学院实验动物中心）。免疫程序是取含AFB20-DCC-KLH偶联 物50~80yg的蛋白溶液与佐剂等量混合后注入小鼠体内，使其产生特异性血清。
[0035] 2.2细胞融合和克隆化
[0036]参照杨汉春《动物免疫学》，利用发明人所在国家兽药残留基准实验室制备的 AFB20-DCC-KLH免疫原免疫Balb/C小鼠（购自湖北省疾病预防控制中心实验动物中心），免 疫程序为:基础免疫将免疫原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠背部皮下多点注射， 以后每间隔2周加强免疫一次，换用不完全佐剂乳化。最后于融合前三天(最好于免疫结束 后休整1月）腹腔注射，强化免疫，抗原量加倍，不加佐剂。
[0037] 融合时，取经最后强化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性 血清），在75%酒精中浸泡5min消毒。无菌取出小鼠脾脏，分离出脾细胞，与新鲜制备的SP2/ 〇骨髓瘤细胞(SP2/0骨髓瘤细胞