专利名称：：一种从鸡蛋中同时提取甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法
技术领域：
：本发明涉及兽药残留检测领域，具体涉及一种鸡蛋中甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺同时提取、净化及浓縮的方法。
背景技术：
：在对食品残留物进行检测时，如果能同时对多种物质进行检测，那么将大大提高工作效率，但只有同时能将多种残留物同时从样本中提取出来，才可能建立起高效的检测方法。氟苯尼考微溶于水，溶于有机溶剂。代谢物氟苯尼考胺极性强，易溶于水，国内外关于甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的提取方法有许多报道。提取剂一般为乙酸乙酯、乙腈、丙酮等。国内外对鸡蛋中该三种药物同时提取的方法未见报道。
发明内容为了解决现有技术不能同时从鸡蛋中提取甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的问题，本发明提供了一种同时提取、净化及浓縮方法，该方法简单、方便、快速，回收率高。本发明所采用的技术方案是一种同时从鸡蛋中提取甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法，是将鸡蛋制成匀浆后，加入30%_50%乙腈溶液中混匀，再用体积比49:49:2的乙酸乙酯-乙腈-氨水提取。所说的乙酸乙酯-乙腈-氨水提取是用乙酸乙酯_乙腈_氨水振荡萃取，离心，将上清液移出，重复萃取3-4次，合并上清液，即得提取液。上述所说的提取液在氮吹仪上吹干，用乙腈溶解残渣，用经纯乙腈饱和的正己烷重复脱脂两次，然后氮吹仪上再次吹干，用30%_35%乙腈溶液溶解残渣，离心，过滤，得滤液，即浓縮液。采用本发明方法能将鸡蛋中的甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺同时提取出来，并经净化、浓縮步骤得到的浓縮液可以供HPLC检测用。本发明比较了不同的提取剂对回收率的影B向，结果表明乙腈、丙酮提取效率较差，回收率较低，均小于40%，乙酸乙酯提取效率虽高，但提取的组织内源性物质较多，同时又不能有效提取氟苯尼考代谢物氟苯尼考胺，因为氟苯尼考胺只有在碱性条件下才能溶于有机溶剂，所以本实验采用乙酸乙酯-乙腈-氨水(49:49:2)作为提取剂，三种药物的提取效率都很高，均达到86%以上，碱性的乙酸乙酯-乙腈可有效提取氟苯尼考胺，且不影响其他两种药物的提取；乙腈可有效去除部分蛋白质，减少内源性杂质，有利于样品净化。筛选出鸡蛋中甲砜霉素、氟苯尼考和代谢物氟苯尼考胺残留的最佳前处理方法。该方法简单、方便、快速，回收率高，平均回收率均在86%以上，日内和日间RSD均分别低于5.7%和9.8%，符合AOAC残留测定要求。具体实施例方式本发明中所涉及的试剂的百分浓度，除特别说明外均指质量百分浓度。1.实验鸡的饲养、给药和样品采集1.l实验鸡选择及分组选取28周龄京海黄鸡175只，体重1.75±0.20kg，随机分成7组，每组25只，单笼饲养。A、B、C组为甲砜霉素试验组，D、E、F组为氟苯尼考试验组，G组为空白对照组。给药前分别称重、编号。试验前预饲1周，饲喂不含任何抗菌药物的全价饲料，自由饮水。1.2给药剂量、途径及样品采集各试验组产蛋鸡投药剂量如表l所示。给药前先将甲砜霉素和氟苯尼考灌注于空心胶囊中，然后分别直接投入到鸡的嗉囊中。试验组每天给药一次，给药时间均在上午8:00-9:00，连续5d，自给药日起至停药后15d内收集每天的鸡蛋。表l给药方案甲讽霉素(Thiamhenicol)氟苯尼考(Forfenicol)对照组组别A组B组C组D组E组F组G组药量(mg/kg.b.w)10.020.050.025.050.0100.00.02(1)本发明提取、净化与浓縮步骤①用匀桨机将鸡蛋制成匀桨；②准确称取2.0-3.0g鸡蛋匀浆样品，放于30-50mL具塞离心管中；③加入1-1.5mL30%-50%乙腈溶液置漩涡混合器上混匀；④加入4-6mL乙酸乙酯-乙腈-氨水(49:49:2，V/V)，旋涡振荡混匀1-2min，再用超声波振荡萃取15min;⑤6000-8000r/min离心10-15min，上清液转移至20_25mL玻璃管中；⑥重复提取3-4次，合并上清液；⑦在35-55t:水浴中，用氮气吹干；⑧加入1.OmL-l.5mL乙腈溶解，涡旋振荡混匀1-2min;⑨加3.0-5.OmL饱和正己烷(用纯乙腈饱和)脱脂，弃去上层正己烷，重复脱脂2次；在35-55t:水浴中，用氮气吹干；冷冻保存；上机前用1.OmL30%_35%乙腈溶解，转移至1.5mL离心管中；⑩12000-13400r/min离心15分钟，上清液经0.22ym滤膜过滤，滤液供HPLC测定。(2)乙腈提取、净化与浓縮步骤①用匀桨机将鸡蛋制成匀桨；②准确称取2.0g鸡蛋匀浆样品，放于50mL具塞离心管中；4③加入lmL35%乙腈溶液置漩涡混合器上混匀；加入4mL乙腈，涡旋振荡混匀l-2min，再用超声波振荡萃取15min;⑤6000-8000r/min离心10-15min，上清液转移至25mL玻璃管中；⑥重复提取3-4次，合并上清液；⑦在35-55t:水浴中，用氮气吹干；⑧加入1.OmL乙腈溶解，旋涡振荡混匀1-2min;⑨加3.OmL饱和正己烷(用纯乙腈饱和)脱脂，弃去上层正己烷，重复脱脂2次；在35-55t:水浴中，用氮气吹干；冷冻保存；上机前用1.OmL35%乙腈溶解，转移至1.5mL离心管中；12000-13400r/min离心15分钟，上清液经0.22ym滤膜过滤，滤液供HPLC测定。(3)丙酮提取、净化与浓縮步骤①用匀桨机将鸡蛋制成匀桨；②用匀桨机将鸡蛋制成匀桨；③准确称取2.0g鸡蛋匀浆样品，放于50mL具塞离心管中；加入2mLpH7.0的磷酸盐缓冲液，旋涡振荡混匀1-2min;⑤加入4mL丙酮旋涡振荡混匀1-2min，再用超声波振荡萃取15min;⑥6000-8000r/min离心5min;⑦将溶液转移到另一支15mL离心管中；⑧再向溶液中加入3mL二氯甲烷，旋涡振荡混匀lmin，再用超声波振荡萃取15minj⑨6000-8000r/min离心5min;⑩弃去上层水相，置45t:氮吹仪上吹干；(11)用lmL35%乙腈溶解残渣，涡旋振荡混匀lmin;(12)加入3mL正己烷(用纯丙酮饱和)涡旋振荡混匀lmin，脱脂，弃去上层正己烷，重复脱脂2次；(13)水相转移至1.5mL离心管，上清液经0.22ym滤膜过滤，滤液供HPLC测定。3回收率的测定3.Og匀浆后的空白鸡蛋匀浆液，置50mL聚丙烯离心管中，添加不同浓度的标准工作液，使得空白空白蛋液中甲砜霉素添加量分别为0.015mg/kg、0.05mg/kg、0.50mg/kg;氟苯尼考添加量分别为0.015mg/kg、0.05mg/kg、0.50mg/kg;氟苯尼考胺添加量分别为0.005mg/kg、0.05mg/kg、0.50mg/kg。每个添加量设6个平行，经上述样品的提取、净化和浓縮后，进样80iiL作HPLC检领U。HPLC检测条件色谱柱为C18，5iim，250mmX4.6mm;流动相为乙腈NaH2P04溶液(0.01mol/L，含0.005mol/L十二烷基硫酸钠和0.10%三乙胺)=3035:7065(V/V)，用85%H3P04调pH至4.5-4.8;荧光检测器，激发波长225nm，发射波长285nm;流速1.01.2mL/min;柱温2530°C。根据峰面积计算添加回收率。本发明方法提取样品的结果见表2。乙腈、丙酮提取样品的结果见表3、表4。表2鸡蛋中甲砜霉素(TAP)、氟苯尼考(FF)和氟苯尼考(FFA)的添加回收率及变异系数(n=6)5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表4鸡蛋中甲砜霉素(TAP)、氟苯尼考(FF)和氟苯尼考(FFA)的添加回收率及变异系数(n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>4精密度的测定将检测回收率剩余的样品按药物浓度高低分别混合成3份，得到高、中、低三种药物浓度的样品，在同日内6次重复测定高、中、低三种药物浓度的样品，求得日内(批内)精密度。在一周内不同日6次重复测定高、中、低三种药物浓度的样品，密度。其结果见表2。权利要求一种同时从鸡蛋中提取甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法，其特征在于，将鸡蛋制成匀浆后，加入30％-50％乙腈溶液中混匀，再用体积比49∶49∶2的乙酸乙酯-乙腈-氨水提取。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的用乙酸乙酯-乙腈-氨水提取是用乙酸乙酯_乙腈_氨水振荡萃取，离心，将上清液移出，重复萃取3-4次，合并上清液，即得提取液。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，提取液在氮吹仪上吹干，用乙腈溶解残渣，再用经纯乙腈饱和的正己烷重复去脂，然后氮吹仪上再次吹干，用30%_35%乙腈溶液溶解残渣，离心，过滤，得滤液，即浓縮液。全文摘要本发明涉及一种从鸡蛋中同时提取甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法。该方法具体是将鸡蛋制成匀浆后，加入30％-50％乙腈溶液中混匀，再用体积比49∶49∶2的乙酸乙酯-乙腈-氨水提取，提取液再经饱和正己烷脱脂，最后用氮吹仪吹干。采用本发明方法能将鸡蛋中的甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺同时提取出来，简单、方便、快速，回收率高。文档编号C07C317/32GK101747246SQ20091026444公开日2010年6月23日申请日期2009年12月22日优先权日2009年12月22日发明者姚宜林,徐东,李洋静,裴燕,谢恺舟,谢星,陈书琴申请人:扬州大学