A-EDC-0VA的固相载体(酶标板）；
[0082] 2)甲砜霉素标准溶液6 瓶，浓度分别为1 · 6yg/L、0 · 8yg/L、0 · 4yg/L、0 · 2yg/L、0 · 1μ g/L、0yg/L;
[0083] 3)保藏号为CCTCC N0:C201549的杂交瘤细胞株TAP/5F4分泌的单克隆抗体；
[0084] 4)辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠 IgG抗体工作液；
[0085] 5)浓缩磷酸盐缓冲液:恥(：180.(^，1012?〇42.(^，恥2册〇4.12!12〇29.(^，1((：12.0 8， 加双蒸水至l〇〇〇mL;
[0086] 6)浓缩洗涤液:恥(：180.(^，1012?〇42.(^，恥2册〇4.12!12〇29.(^，1((：12.(^，了￥661120 5mL，加双蒸水至1000mL;
[0087] 7)底物液A: 3，3 '，5 '，5-四甲基联苯二胺(TMB) 200mg，无水乙醇100mL，加双蒸水至 1000mL；
[0088] 8)底物液B: Na2HP〇U4.6g，梓檬酸9.3g，0.75 %过氧化氢尿素6.4mL，加双蒸水至 lOOOmL，调节 pH至5 · 0~5 · 4;
[0089] 9)终止液:2111〇1/1硫酸溶液。
[0090] 4.2酶标板的制备
[0091] 用包被液将FFA-EDC-0VA稀释成lmg/L，每孔加入100uL，4°C过夜，倾去包被液，每 孔加入250yL洗涤液洗涤3次，拍干，然后每孔加入封闭液250yL，37°C孵育60min，倾去孔内 液体，洗涤液洗涤3次，拍干，用锡箱纸真空密封保存。
[0092] 实施例5本发明的酶联免疫试剂盒的测定程序
[0093] 5.1试剂的配制
[0094] 1)样品稀释液:将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲液用三蒸水稀释10倍后使用。
[0095] 2)洗涤液:将试剂盒中提供的洗涤液用三蒸水稀释10倍后使用。
[0096] 3)底物混合液:根据每次所需用量，将配制的底物液A和底物液B按体积1:1混匀， 现配现用。
[0097] 5.2样品前处理
[0098] 猪肉、鸡肉、鱼肉、猪肝和鸡肝的前处理：
[0099] 1)称取2.00±0.02g可食性动物组织匀质样品于50mL离心管中，加8mL乙酸乙酯， 震荡 5min，室温4000r/min 离心 5min;
[0100] 2)取上清2mL氮气吹干，用正己烷2mL复溶，涡旋30s，再加入PBS lmL混合，室温 4000r/min离心5min，取下层水相供试剂盒测定，本处理对组织样品的稀释倍数为2。
[0101] 5.3测定步骤
[0102] 1)加样：向酶标板微孔中加入一系列浓度甲砜霉素标准溶液或样品溶液50yL，然 后加入单克隆抗体工作液50yL，置于湿盒中，37°C恒温孵育30min;
[0103] 2)洗涤:倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250yL洗涤3次并拍干；
[0104] 3)加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠 IgG抗体工作液:每孔中加入辣根过氧化 物酶(HRP)标记的羊抗鼠 IgG抗体工作液1 OOyL，置于湿盒中，37°C恒温孵育30min;
[0105] 4)洗涤:倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250yL，洗涤3次并拍干；
[0106] 5)加底物:每孔中加入底物混合液100yL，置于湿盒中，37°C恒温孵育15min;
[0107] 6)加终止液:每孔中加入终止液50yL;
[0108] 7)测定:用酶标仪在450nm处测定每孔的光密度值(0D值）。
[0109] 5.4结果判断 [0110] 标准曲线：
[0111] 以所测定的标准品0D值除以"零"孔0D值(Β/Β0)为纵坐标，甲砜霉素浓度的对数值 为横坐标作标准曲线，并进行线性回归，给出回归方程。
[0112] 组织中甲砜霉素药物浓度计算：
[0113] 计算样品的抑制率(所获得的样品的0D值除以"零"孔0D值），代入标准曲线的回归 方程中，计算出组织中甲砜霉素浓度(yg/kg)。
[0114] 组织中氟苯尼考药物浓度计算：
[0115] 计算样品的抑制率(所获得的样品的0D值除以"零"孔0D值），代入标准曲线的回归 方程中，按照公式2折算成氟苯尼考药物浓度。
[0117] 实施例6本发明试剂盒的灵敏度、精密度、准确度、重复性试验
[0118] 6.1本发明试剂盒的灵敏度试验
[0119] 以标准曲线的IC5Q值和组织最低检测限(L0D)作为本发明检测试剂盒的灵敏度指 标。将甲砜霉素标准品稀释成为 1 · 6yg/L、Ο · 8yg/L、Ο · 4yg/L、Ο · 2yg/L、Ο · lyg/L、Oyg/L 6 个 浓度，每个浓度5个复孔，按照间接竞争ELI SA方法重复测定5次，取5次测定的IC5Q的平均值。 LOD通过以下步骤决定，测定20份空白组织样品的OD值，根据标准曲线的回归方程计算出相 应的甲砜霉素浓度，然后计算出甲砜霉素浓度的平均值和标准差（SD)，根据公式 L0D= 7十3SD计算出组织中的最低检测限。本发明的I-值为〇. 35±0.03yg/L，甲砜霉素 和氟苯尼考在动物组织中的最低检测线详见表5。
[0120]表5动物组织中的最低检测限
[0122] 6.2本发明试剂盒的精密度试验
[0123] 将甲砜霉素标准品稀释成 1 · 6yg/L、0 · 8yg/L、0 · 4yg/L、0 · 2yg/L、0 · lyg/L、Oyg/L 6 个浓度，每浓度5个重复，按照间接竞争ELISA方法重复测定5次，应用标准曲线的回归方程 计算出各浓度甲砜霉素标准溶液的测定值，计算板内和板间变异系数，结果见表6。
[0124] 表6标准曲线的板内及板间变异系数
[0126] 6.3本发明试剂盒的准确度、重复性试验
[0127] 本研究分别将三个浓度的甲砜霉素和氟苯尼考添加到猪肉、鸡肉、鱼肉、猪肝脏和 鸡肝脏样品中，其添加回收率在72.8 %~113.4%之间，批内与批间变异系数< 15 %，测定 结果见表7~11。
[0129]表7猪肉中添加回收率
【主权项】
1. 一种能识别甲砜霉素和氟苯尼考的单克隆抗体，其特征在于:它是由保藏号为CCTCC NO: C201549的杂交瘤细胞株TAP/5F4所分泌的。2. 权利要求1中所述的杂交瘤细胞株TAP/5F4，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏 号为CCTCC N0:C201549。3. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于:它是以氟苯尼考胺与琥珀酸酐反应 后得到的氟苯尼考胺半琥珀酸酯与载体蛋白偶联后作为免疫原制备得到的。4. 权利要求1或3所述的单克隆抗体在制备检测甲砜霉素和氟苯尼考的酶联免疫试剂 盒中的应用。5. 包含权利要求1或3所述单克隆抗体的试剂盒。6. 根据权利要求5所述的试剂盒，该试剂盒是检测甲砜霉素和氟苯尼考药物残留的酶 联免疫试剂盒。7. 权利要求5所述的试剂盒在甲砜霉素和氟苯尼考药物残留非诊断目的检测中的应 用。8. -种甲砜霉素和氟苯尼考药物残留的非诊断目的酶联免疫检测方法，其步骤如下： (1) 将氟苯尼考胺与载体蛋白偶联得到包被原； (2) 用保藏号为CCTCC NO:C201549的杂交瘤细胞株TAP/5F4制备单克隆抗体； (3) 用步骤(1)的包被原包被固相载体； (4) 样品的处理和检测。
【专利摘要】本发明公开了一种能特异性识别甲砜霉素和氟苯尼考的单克隆抗体,它是由杂交瘤细胞株TAP/5F4所分泌的，所述的杂交瘤细胞株TAP/5F4，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC？NO:C201549。本发明还公开了检测甲砜霉素和氟苯尼考的酶联免疫方法及其试剂盒。与现有技术相比，本发明制备的单克隆抗体灵敏度较高，检测的准确度高，精密度好，具有简便、快速、易操作等优点。CCTCC NO: C20154920150424
【IPC分类】C07K16/44, G01N33/577, C12N5/20, C12R1/91
【公开号】CN105524174
【申请号】CN201610050859
【发明人】袁宗辉, 彭大鹏, 安玲玲, 王玉莲, 潘源虎, 陈冬梅, 周琪, 冯亮
【申请人】华中农业大学
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2016年1月26日