专利名称：多孔树脂珠粒及使用其制造核酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种多孔树脂珠粒。更说明地，本发明涉及含有第一芳族单乙烯基 化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯腈-第二芳族单乙烯基化合物共聚物的多孔树脂 珠粒。所述多孔树脂珠粒在合成核酸时特别有用。
背景技术：
使用亚磷酰胺法的固相合成方法被广泛用于核酸如DNA寡核苷酸和RNA的化 学合成。在所述方法中，例如，首先通过可切割的连接体如琥珀酰基，将成为待合成的 核酸的3’ -末端的核苷预先负载到固相合成载体上，并且将所述载体放入反应柱中且安 置在自动核酸合成仪上。之后，例如，以下列根据所述自动核酸合成仪的合成程序的方 式，将合成试剂注入所述反应柱中。(1)通过三氯乙酸/ 二氯甲烷溶液、二氯乙酸/甲苯 溶液等对核苷5’ -OH基进行脱保护，( 通过核苷亚磷酰胺(核酸单体)/乙腈溶液和 活化剂(四唑等)/乙腈溶液，使阿米迪特(amidite)与5’ -OH基进行偶联反应；(3)通 过乙酸酐/吡啶/甲基咪唑/THF等对未反应的5’ -OH基进行封端，以及⑷通过碘/ 水/吡啶等对亚磷酸酯进行氧化。
通过重复所述合成循环，合成了具有预期序列的核酸。通过用氨、甲胺等对可 切割的连接体进行水解，将最后合成的核酸从所述固相合成载体中切出(参见非专利文 献1) O
作为在核酸合成中待使用的固相合成载体，迄今已使用CPG(可控孔度玻璃)、 硅胶等无机粒子，但是近年来，已经开始使用能够增加每重量固相合成载体的合成核酸 量的树脂珠粒，以便以合适的价格和大量来进行合成。作为这种树脂珠粒，例如可提及 高交联且不溶胀的多孔聚苯乙烯珠粒(参见专利文献1)、低交联且溶胀的多孔聚苯乙烯 珠粒(参见专利文献幻等。
然而，当将作为合成起点的核苷连接体的负载量增加至太高水平，以便进一步 增加每重量固相合成载体的合成核酸量时，会造成阿米迪特的偶联效率变差且获得的核 酸纯度显著降低的问题。例如，可商购的固相合成载体的核苷连接体负载量的上限迄今 最多为约200 μ mol/g,所述负载量的核苷连接体能够以高纯度合成20个碱基的DNA寡 核苷酸。
已通过使用丙烯腈抑制多孔树脂珠粒在各种有机溶剂中的溶胀比波动来进行尝 试以改进核酸合成能力(参见专利文献幻。然而，尽管该文献中使用的多孔树脂珠粒在 各种有机溶剂中多孔树脂珠粒的溶胀比波动小，但是对核酸合成能力还需要进一步的改进。
专利文献1 JP-A-3-68593
专利文献2 JP-A-2005-325272
专利文献3 JP-A-2008-74979
非专利文献1:核酸化学的当前规程O000)，第3.6单元，未改性寡核苷酸的合成(Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry (2000), UNIT 3.6 Synthesis of Unmodified Oligonucleotides)。发明内容
本发明的目的是提供一种用于以高合成量和高纯度来合成核酸的多孔树脂珠 粒。
本发明人已首次出乎其意料地发现，在含有第一芳族单乙烯基化合物-二乙烯 基化合物_(甲基)丙烯腈-第二芳族单乙烯基化合物共聚物的多孔树脂珠粒中，当在核 酸合成中使用其中
(1)所述第二芳族单乙烯基化合物含有能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基 团，并且
(2)在乙腈中的溶胀体积为3至6ml/g，
的多孔树脂珠粒作为固相合成载体时，提高了获得的核酸合成量并提高了其纯度。
基于这些发现，本发明人已进一步进行深入研究，结果完成了本发明。
因此，本发明涉及下列多孔树脂珠粒，用于制造核酸的方法等。
(1) 一种多孔树脂珠粒，所述多孔树脂珠粒包含第一芳族单乙烯基化合物-二乙 烯基化合物_(甲基)丙烯腈-第二芳族单乙烯基化合物共聚物，其中所述第二芳族单乙 烯基化合物含有能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团，并且其中所述多孔树脂珠粒 在乙腈中具有3至6ml/g的溶胀体积。
(2)在(1)中所述的多孔树脂珠粒，其中所述能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团是选自氨基、氨烷基、羟基和羟烷基的基团。
(3)在⑴或⑵中所述的多孔树脂珠粒，其中源自所述(甲基)丙烯腈的结构 单元的量为1至6mmol/g。
(4)在⑴至(3)中任一项所述的多孔树脂珠粒，其中基于单体的总量，所述二 乙烯基化合物的量为2至10mol%。
(5)在⑴至(4)中任一项所述的多孔树脂珠粒，其中所述二乙烯基化合物是二乙炼基苯。
(6) 一种制造核酸的方法，所述方法包含将核苷或核苷酸通过可切割的连接体顺 序结合至(1)至(5)中任一项所述的多孔树脂珠粒，由此获得寡核苷酸。
本发明的多孔树脂珠粒具有高核酸合成量和核酸合成纯度。因此，当使用本发 明的多孔珠粒时，与使用常规多孔树脂珠粒的情况相比，能够有效地进行核酸合成。
具体实施方式
本发明的多孔树脂珠粒含有第一芳族单乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基) 丙烯腈-第二芳族单乙烯基化合物共聚物。在本文中，术语“第一芳族单乙烯基化合 物-二乙烯基化合物_(甲基)丙烯腈-第二芳族单乙烯基化合物共聚物”是指含有如下 结构单元的共聚物，所述结构单元各自分别源自第一芳族单乙烯基化合物、二乙烯基化 合物、(甲基)丙烯腈和第二芳族单乙烯基化合物。换言之，术语“第一芳族单乙烯基化合物-二乙烯基化合物_(甲基)丙烯腈-第二芳族单乙烯基化合物共聚物”是指通过 将作为单体的第一芳族单乙烯基化合物、二乙烯基化合物、(甲基)丙烯腈和第二芳族单 乙烯基化合物共聚而获得的共聚物。
提供本发明多孔树脂珠粒的结构单元(即，第一芳族单乙烯基化合物-二乙烯基 化合物_(甲基)丙烯腈-第二芳族单乙烯基化合物共聚物的结构单元)之一的“第一芳族 单乙烯基化合物”是指苯乙烯或其取代产物。作为苯乙烯的取代产物，例如可以提及这 样的化合物，在所述化合物中，利用碳原子数为1至5的烷基(例如，甲基、乙基、正丙 基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基或叔戊基)、 卤原子、羧基、磺酸酯基、氰基、碳原子数为1至5的烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基、 丙氧基、丁氧基或戊氧基)、硝基、酰基(例如，乙酰氧基或苯甲酰氧基)等来取代苯乙 烯的一个以上氢原子。
作为这种第一芳族单乙烯基化合物，例如例示性地可以提及苯乙烯；作为苯 环部分被取代的苯乙烯的“核烷基取代的苯乙烯”，如邻甲基苯乙烯、间甲基苯乙烯、 对甲基苯乙烯、2，4-二甲基苯乙烯、乙基苯乙烯、三甲基苯乙烯和对叔丁基苯乙烯；“α-烷基取代的苯乙烯”，如α-甲基苯乙烯和α-甲基对甲基苯乙烯；作为苯环部分 被卤代的苯乙烯的“核卤代苯乙烯”，如氯苯乙烯、二氯苯乙烯、氟苯乙烯、五氟苯乙 烯、溴苯乙烯；“卤代烷基苯乙烯”，如氯甲基苯乙烯和氟甲基苯乙烯；“酰氧基苯乙 烯”，如羟基苯乙烯、羟甲基苯乙烯、苯甲酸乙烯酯、苯乙烯磺酸钠、氰基苯乙烯、甲 氧基苯乙烯、乙氧基苯乙烯、丁氧基苯乙烯、硝基苯乙烯、乙酰氧基苯乙烯和苯甲酰氧 基苯乙烯等，然而不限于此。优选作为第一芳族单乙烯基化合物的是苯乙烯。
提供本发明多孔树脂珠粒的结构单元之一的“二乙烯基化合物”是指芳族二乙 烯基化合物、二(甲基)丙烯酸酯或其取代产物。作为芳族二乙烯基化合物的取代产物 或二(甲基)丙烯酸酯的取代产物，可以提及例如，其中将所述芳族二乙烯基化合物或 二(甲基)丙烯酸酯的一个以上氢原子用下列基团取代的化合物碳原子数为1至5的烷 基；卤原子；羧基；磺酸酯基；氰基；碳原子数为1至5的烷氧基；和硝基。
作为这样的二乙烯基化合物，例示性地例如可以提及芳族二乙烯基化合物如 二乙烯基苯、甲基二乙烯基苯、二乙烯基甲苯和二乙烯基萘；二(甲基)丙烯酸酯化合 物如乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、二甘醇二(甲基)丙烯酸酯、三甘醇二(甲基)丙烯酸 酯、四甘醇二(甲基)丙烯酸酯，另外的多羟基乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、丙二醇二 (甲基)丙烯酸酯、二丙二醇二(甲基)丙烯酸酯，另外的多羟基丙二醇二(甲基)丙烯 酸酯、1，2-丁二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，3-丁二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，4-丁二 醇二(甲基)丙烯酸酯、1，5-戊二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，6-己二醇二(甲基)丙 烯酸酯、1，9-壬二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，10-癸二醇二(甲基)丙烯酸酯、2-甲 基-1，8-辛二醇二(甲基)丙烯酸酯以及1，4-环己二醇二(甲基)丙烯酸酯；等。优 选作为本发明二乙烯基化合物的是二乙烯基苯。关于所述二乙烯基苯，优选使用邻、间 或对二乙烯基苯或其混合物作为提供所述结构单元的化合物。在它们之中，特别优选间 或对二乙烯基苯。所述二乙烯基化合物在本发明的多孔树脂珠粒中起交联剂的作用。由 于存在当交联剂的量小时多孔树脂珠粒易于溶胀，并且当交联剂的量大时其溶胀比降低 的趋势，所以所述二乙烯基化合物的量可有助于增加溶胀比。
提供本发明多孔树脂珠粒的结构单元之一的“(甲基)丙烯腈”是指“丙烯腈” 或“甲基丙烯腈”，或“丙烯腈和甲基丙烯腈两者”。即，关于源自本发明多孔树脂珠 粒中含有的(甲基)丙烯腈的结构单元，可以各自独立地含有源自丙烯腈的结构单元或源 自甲基丙烯腈的结构单元或者可以含有这些单元两者。
提供本发明多孔树脂珠粒的结构单元之一的“第二芳族单乙烯基化合物”是指 含有“能够通过脱水缩合反应与羧基结合的官能团”的苯乙烯或其取代产物。因此， 在合成目标核酸的情况下，将核苷与所述多孔树脂珠粒连接，并且当在所述情况下的连 接体中存在羧基时，能够容易地将连接体的羧基与所述多孔树脂珠粒连接，因而从能够 有效地进行核酸合成的观点来看是有利的。作为这种“能够通过脱水缩合反应与羧基结 合的官能团”，可提及氨基、氨烷基、羟基、羟烷基等。更优选地，可提及伯胺基、氨 甲基、羟基、羟甲基等。优选的是，将所述“能够通过脱水缩合反应与羧基结合的官能 团”布置在乙烯基的对位，但也可以是邻位或间位。
作为这种第二芳族单乙烯基化合物，例如例示性地可以提及氨基苯乙烯单体 或其取代产物如氨基苯乙烯；氨烷基苯乙烯单体或其取代产物如氨甲基苯乙烯；羟基 苯乙烯单体或其取代产物如羟基苯乙烯；羟烷基苯乙烯单体或其取代产物如羟甲基苯乙 烯；等，在其中优选对氨基苯乙烯、对氨甲基苯乙烯、对羟基苯乙烯和对羟甲基苯乙 火布。
作为羟基苯乙烯单体或氨基苯乙烯单体的“取代产物”，可以提及其中除“能 够通过脱水缩合反应与羧基结合的官能团”之外的一个以上氢原子被下列基团取代的那 些化合物碳原子数为1至5的烷基；卤原子；羧基；磺酸酯基；氰基；甲氧基；硝基；等。
可通过直接使用在制造初期含有“能够通过脱水缩合反应与羧基结合的官能 团”的第二芳族单乙烯基化合物来制造本发明的多孔树脂珠粒(在下文中描述制造方 法)，但是其也可以通过由悬浮共聚合等一次合成多孔树脂珠粒、然后引入“能够通过脱 水缩合反应与羧基结合的官能团”来制造。特别地，当将具有羟基作为所述“能够通过 脱水缩合反应与羧基结合的官能团”的第二芳族单乙烯基化合物作为提供本发明多孔树 脂珠粒的结构单元的单体引入时(即，将羟基苯乙烯作为提供本发明多孔树脂珠粒的结 构单元的单体引入)，优选通过后一制造方法来制造珠粒，因为所述羟基苯乙烯本身是非 常不稳定的单体，原因在于其倾向于引起聚合且因此不易对其进行操作和保存。
根据这种制造过程，作为成为本发明“第二芳族单乙烯基化合物”基础的芳族 单乙烯基化合物，可以提及例如酰氨基苯乙烯如乙酰氨基苯乙烯；酰氧基苯乙烯如乙 酰氧基苯乙烯、乙酰氧基苯乙烯(ethanoyloxystyrene)和苯甲酰氧基苯乙烯；卤烷基苯乙 烯如氯甲基苯乙烯；等。
可将通过悬浮共聚合等合成的多孔树脂珠粒中源自酰氧基苯乙烯或酰氨基苯乙 烯的结构单元，通过用碱或酸水解，转化为作为本发明多孔树脂珠粒结构单元的“源自 第二芳族单乙烯基化合物的结构单元”，例示性地为源自羟基苯乙烯、氨基苯乙烯等的 结构单元。而且，可将源自卤烷基苯乙烯的结构单元，通过与邻苯二甲酰亚胺和胼、 氨、氢氧化钠等的反应转化为作为本发明多孔树脂珠粒结构单元的“源自第二芳族单 乙烯基化合物的结构单元”，例示性地为源自氨烷基苯乙烯、羟烷基苯乙烯等的结构单元。即，可通过与邻苯二甲酰亚胺和胼、氨等的反应，将源自卤烷基苯乙烯的结构单元 转化为源自氨烷基苯乙烯的结构单元，并且可通过与氢氧化钠等的反应，将源自卤烷基 苯乙烯的结构单元转化为源自羟烷基苯乙烯的结构单元。优选的是，将被转化成为所述 “能够通过脱水缩合反应与羧基结合的官能团”的酰氧基、酰氨基、卤烷基等布置在乙 烯基的对位，但也可以是邻位或间位。
或者，可以对通过悬浮共聚合等合成的包含第一芳族单乙烯基化合物-二乙烯 基化合物_(甲基)丙烯腈化合物共聚物的多孔树脂珠粒进行后处理，从而将卤烷基引入 源自第一芳族单乙烯基化合物的结构单元的芳环中，随后将其转化为源自氨烷基苯乙烯 或羟烷基苯乙烯的结构单元。例如，通过向包含第一芳族单乙烯基化合物-二乙烯基化 合物_(甲基)丙烯腈化合物共聚物的多孔树脂珠粒分散体中加入氯甲基醚和氯化锌并使 它们发生反应来引入氯甲基。接下来，经由通过使所述共聚物与氨反应来引入氨甲基， 从而引入“源自第二芳族单乙烯基化合物的结构单元”。即使通过这种制造过程也能够 获得本发明的多孔树脂珠粒。优选的是，将卤烷基布置在乙烯基的对位，但也可以是邻 位或间位。
尽管基于本发明多孔树脂珠粒的结构单元的总量，源自第一单乙烯基化合物的 结构单元(也可以称作“第一单乙烯基化合物结构单元”)的量不受特殊限制，但是对于 每重量多孔树脂珠粒，其占有量优选为3.0至8.3mmol/g，更优选为4.5至8.0mmol/g。 进一步优选为5.0至7.5mmol/g。
当源自第一单乙烯基化合物的结构单元的量小于上述范围时，所述多孔树脂珠 粒的耐溶剂性、热稳定性和多孔性可能不充分，从而当被用于核酸的固相合成时，几乎 不能预期所需的效果。而且，当源自第一单乙烯基化合物的结构单元的量大于上述范 围时，在有机溶剂中的溶胀度降低，从而当被用于核酸的固相合成时，核酸的合成量变 小，并且进一步地，核酸纯度也减小。
尽管基于本发明多孔树脂珠粒的结构单元的总量，源自二乙烯基化合物的结构 单元(也可以称作“二乙烯基化合物结构单元”)的量不受特殊限制，但是对于每重量多 孔树脂，其占有量优选为0.2至l.Ommol/g，更优选为0.25至0.8mmol/g，进一步优选为 0.3 至 0.7mmol/g。
当源自二乙烯基化合物的结构单元的量小于上述范围时，多孔树脂珠粒的耐溶 剂性、热稳定性和多孔性可能不充分，从而当被用于核酸的固相合成时，几乎不能预期 所需的效果。而且，当源自二乙烯基化合物的结构单元的量大于上述范围时，在有机溶 剂中的溶胀度降低，从而当被用于核酸的固相合成时，核酸的合成量可能变小，并且进 一步地，核酸纯度也可能减小。
当被浸泡在有机溶剂中时，本发明的多孔树脂珠粒溶胀并改变其体积。尽管有 机溶剂不受特殊限制，但是优选乙腈或甲苯，并更优选乙腈。
当将本发明的多孔树脂珠粒浸泡在乙腈中时，溶胀体积优选为3至6ml/g，更优 选为3.2至5.5ml/g，进一步优选为3.4至5.0ml/g。另外，当将本发明的多孔树脂珠粒浸 泡在甲苯中时，溶胀体积优选为5至8ml/g，更优选为5.2至7.7ml/g，进一步优选为5.4 至 7.4ml/g。
由于本发明的多孔树脂珠粒在有机溶剂中显示大的溶胀比，因此能够扩大使用有机溶剂的核酸合成的反应范围，由此能够改进核酸合成的反应性。因此，根据本发 明，能够获得用于固相合成载体中的多孔树脂珠粒，与用于核酸合成应用的常规多孔树 脂珠粒相比，所述多孔树脂珠粒能够合成同时具有高的合成量及合成纯度的核酸。
因此，为了将本发明多孔树脂珠粒在有机溶剂中的溶胀体积调整在上述范围 内，有必要考虑基于多孔树脂珠粒结构单元的总量，源自(甲基)丙烯腈的结构单元(也 可以称作“(甲基)丙烯腈结构单元”)的量。
基于本发明的多孔树脂珠粒结构单元的总量，源自(甲基)丙烯腈的结构单元的 量为1至6mmol/g，优选为1.5至4mmol/g，进一步优选为1.8至3mmol/g。
当源自(甲基)丙烯腈的结构单元的量小于上述范围时，几乎不能获得所需的多 孔树脂珠粒，并且当将其用于核酸的固相合成时几乎不能预期所需的效果。而且，当所 述量大于上述范围时，几乎不能形成多孔树脂珠粒自身。另外，当所述量大于6mm0l/g 时，则存在以下趋势合成的核酸量降低，与在两种以上溶剂中溶胀比的小变化无关。
通过全氮分析来测定本发明多孔树脂珠粒中源自(甲基)丙烯腈的结构单元的 量。例示性地，这是通过将样品放入钼盘，在微量天平上对其进行称重，然后通过微量 全氮分析仪TN-110 (由三菱化学株式会社制造)来测定氮的量，并由源自(甲基)丙烯 腈的结构单元的分子量计算而得到。
尽管不受特殊限制，但是基于本发明多孔树脂珠粒的结构单元的总重量，源自 第二芳族单乙烯基化合物的结构单元(也可以称作“第二芳族单乙烯基化合物结构单 元”)的量优选为0.05至1.5mmol/g，更优选为0.1至1.0mmol/g，进一步优选为0.2至 0.8mmol/g。
这是因为当源自第二芳族单乙烯基化合物的结构单元的量小于上述范围时，几 乎不能获得其效果，而当所述量大于上述范围时几乎不能形成多孔树脂珠粒本身。
在本发明多孔树脂珠粒中，关于源自第二芳族单乙烯基化合物的结构单元所具 有的“能够通过脱水缩合反应与羧基结合的官能团”的量，例如在氨基、氨烷基、羟基 或羟烷基的情况下，对于每重量多孔树脂珠粒，“能够通过脱水缩合反应与羧基结合的 官能团”的占有量优选为0.05至1.5mmol/g，更优选为0.1至l.Ommol/g，进一步优选为 0.2 至 0.8mmol/g。
当所述“能够通过脱水缩合反应与羧基结合的官能团”的量小于上述范围时， 则存在以下趋势当被用作核酸固相合成的载体时，核酸的合成量变小。而且，当所 述量大于上述范围时，则存在以下趋势当被用作核酸固相合成的载体时，核酸纯度降 低。
在本发明多孔树脂珠粒中，关于源自第二芳族单乙烯基化合物的结构单元具有 的“能够通过脱水缩合反应与羧基结合的官能团”的量，例如在氨基、氨烷基、羟基或 羟烷基的情况下，通过基于JIS K 0070的滴定来对其进行测定。例示性地，可使用已知 量的乙酰化试剂(乙酸酐/吡啶)，通过对目标固相合成载体的羟基进行乙酰化，然后通 过氢氧化钾滴定来测定乙酰化未消耗的乙酸酐的量，从而能够计算所述官能团的量。
用于制造本发明多孔树脂珠粒的方法不受特殊限制，并且可以提及，例如
(1)用于制造多孔树脂珠粒的方法，所述方法包括使用有机溶剂和水，使第一芳 族单乙烯基化合物、二乙烯基化合物、(甲基)丙烯腈和含有能够通过脱水缩合反应与羧基结合的官能团的第二芳族单乙烯基化合物进行悬浮共聚合；
(2)用于制造多孔树脂珠粒的方法，所述方法包括通过悬浮共聚合等合成多孔树 脂珠粒，然后将能够通过脱水缩合反应与羧基结合的官能团引入到源自第二芳族单乙烯 基化合物等的结构单元中。
在进行所述悬浮共聚合时，基于第一芳族单乙烯基化合物、二乙烯基化合物、(甲基)丙烯腈和第二芳族单乙烯基化合物的总量，所述第一芳族单乙烯基化合物的量 (给料量)优选为31至85mol%，更优选为45至82mol%，进一步优选为53至76mol%。
在进行所述悬浮共聚合时，基于第一芳族单乙烯基化合物、二乙烯基化合物、(甲基)丙烯腈和第二芳族单乙烯基化合物的总量，所述二乙烯基化合物的量(给料量) 优选为2至10mol%，更优选为2.5至8mol%，进一步优选为3至7mol%。
在进行所述悬浮共聚合时，基于第一芳族单乙烯基化合物、二乙烯基化合物、(甲基)丙烯腈和第二芳族单乙烯基化合物的总量，所述(甲基)丙烯腈的量(给料量) 优选为10至60mol%，更优选为13至40mol%，进一步优选为18至30mol%。
在进行所述悬浮共聚合时，基于第一芳族单乙烯基化合物、二乙烯基化合物、(甲基)丙烯腈和第二芳族单乙烯基化合物的总量，所述第二芳族单乙烯基化合物的量 (给料量)优选为0.5至15mol%，更优选为1至10mol%，进一步优选为2至8mol%。 在包括通过悬浮共聚合等一次合成多孔树脂珠粒，然后引入“能够通过脱水缩合反应与 羧基结合的官能团”的制造方法的情况下，上述量对于成为第二芳族单乙烯基化合物的 基础的芳族单乙烯基化合物是相同的。
通过搅拌和使上述各化合物(在下文中有时将待进行悬浮共聚合的本发明多孔 树脂珠粒的各个组成成分(即，第一芳族单乙烯基化合物、二乙烯基化合物、(甲基)丙 烯腈和第二芳族单乙烯基化合物)称作“单体”)和有机溶剂的混合物在水中乳化来进行悬浮共聚合。
在进行悬浮共聚合中的有机溶剂是指在悬浮共聚合体系中除了水之外的溶剂， 合适地使用烃和醇。例示性地，作为所述烃，可使用脂肪族饱和或不饱和烃或者芳族 烃，其中优选碳原子数为5至12的脂肪族烃，并且更优选地，可以提及正己烷、正庚 烷、正辛烷、异辛烷、十一烷、十二烷等。另外，优选使醇共存，以便增加在此时(在 下文中，将以增加多孔性为目的而使用的醇称作“成孔剂”)获得的珠粒的多孔性。作 为依据本发明的醇，例如可提及脂肪醇，并且其碳原子数优选为5至9。作为这种醇，例 示性地，可提及2-乙基己醇、戊醇(例如，叔戊醇)、壬醇、2-辛醇、环己醇等。
取决于烃和醇的例示性组合，可任选地改变待用于悬浮共聚合中的烃和醇的重 量比，从而能够增加固相合成载体的比表面积。烃和醇的优选混合比为以重量比计1 9 至 6 4。
在悬浮共聚合时，基于上述各单体的总重量，有机溶剂的重量优选为0.5至2.5 倍，更优选为0.8至2.2倍，进一步优选为1.0至2.0倍。当该值大于或小于上述值时， 所得多孔树脂珠粒的比表面积变小，并且通过使用珠粒的化学反应的合成反应产物的量变小。
根据本发明，可通过应用常规的已知方法来进行用于进行悬浮共聚合的方法本 身。
在悬浮共聚合中待使用的分散体稳定剂不受特殊限制，并且可使用常规已知的 聚乙烯醇、聚丙烯酸、明胶、淀粉、羧甲基纤维素等亲水保护性胶体试剂，以及碳酸 钙、碳酸镁、磷酸钙、硫酸安定(valium sulfate)、硫酸钙、膨润土等微溶性粉末等。尽 管分散体稳定剂的量不受特殊限制，但是优选基于悬浮共聚合体系中水的重量，分散体 稳定剂的量为0.01至10重量％。当该值较小时，可能破坏悬浮共聚合的分散稳定性，并 且可能形成大量聚集体。当该值较大时，可能形成大量的微小珠粒。
在进行悬浮共聚合时待使用的聚合引发剂不受特殊限制，并且可使用常规已知 的过氧化二苯甲酰、过氧化二月桂酰、过氧化二硬脂酰、1，1-二(叔丁基过氧化)-2-甲 基环己烷、1，1-二(叔己基过氧化)_3，3，5-三甲基环己烷、1，1-二(叔己基过氧 化)环己烷、1，1-二(叔丁基过氧化)_环己烷、二叔己基过氧化物、叔丁基异丙苯基过 氧化物、二叔丁基过氧化物、1，1，3，3-四甲基丁基过氧化-2-乙基己酸酯、叔己基过 氧化-2-乙基己酸酯、叔丁基过氧化-2-乙基己酸酯、叔丁基过氧化异丙基一碳酸酯和类 似的过氧化物、以及2，2’ -偶氮双异丁腈、2，2’ -偶氮双-2-甲基丁腈、2，2’ -偶 氮双-2，4-二甲基戊腈和类似的偶氮化合物。聚合引发剂的添加量不受特殊限制，并且 可以由本领域技术人员选择合适的量。
可任选地设定进行悬浮共聚合的反应条件，例如可以提及在60至90°C下搅拌30 分钟至48小时。例如，搅拌速率为IOOrpm至l,000rpm，优选为200rpm至500rpm。通过悬浮共聚合，能够获得第一芳族单乙烯基化合物-二乙烯基化合物_(甲基)丙烯腈-第 二芳族单乙烯基化合物共聚物。
可任选地对这样获得的共聚物进行洗涤、干燥、分级等处理。另外，在通过悬 浮共聚合等合成多孔树脂珠粒之后，可以将能够通过脱水缩合反应与羧基结合的官能团 引入源自第二芳族单乙烯基化合物的结构单元中。引入方法如前文中所述。
通过上述处理可获得本发明的多孔树脂珠粒。可将该多孔树脂珠粒用作固相合 成载体。
本发明的“多孔树脂珠粒”并不总是必须显示严格的球形，并且其至少可以为 粒状。然而，从能够增加其填充固相合成反应柱的效率并且其几乎不会破碎的观点来 看，本发明的多孔树脂珠粒(用于固相合成的载体)优选为球形。
本发明多孔树脂珠粒的溶胀体积不仅受源自(甲基)丙烯腈的结构单元的量影 响，而且还受中值粒径和中值孔径的影响。
通过激光衍射散射法测定的本发明多孔树脂珠粒的中值粒径不受特殊限制，但 是优选为1至1,000 μ m，更优选为10至500 μ m，进一步优选为20至300 μ m。通过激 光衍射散射法来测定本发明多孔树脂珠粒的中值粒径。例示性地，使用50体积％的乙醇 水溶液作为分散介质，通过激光衍射散射型粒径分布分析仪LA_950(由日本堀场株式会 社制造)测定粒径来计算平均粒径。
中值粒径取决于在悬浮聚合的情况下在聚合开始前的搅拌条件、成孔剂的种类 和量以及在进行悬浮聚合时的分散体稳定剂的浓度。因此，通过调整这些条件，可以将 中值粒径调整在所需范围内，结果能够将本发明多孔树脂珠粒的溶胀体积调整在所需范 围内。作为成孔剂，可提及上述的醇。另外，在溶胀条件下中值粒径的增大有助于增加 多孔树脂珠粒的溶胀比。
通过压汞法测定的本发明多孔树脂珠粒的中值孔径不受特殊限制，但是优选为 1至l,000nm，更优选为5至500nm，进一步优选为10至300nm，并且最优选为20至 IOOnm0
通过压汞法来测定本发明多孔树脂珠粒的中值孔径。例示性地，将0. 多孔树 脂珠粒放入水银测孔仪PoreMastereO-GT中(由康塔仪器公司制造)，并在140°的汞接 触角和480dyn/cm的汞表面张力的条件下通过压汞法来测定。
使用量筒来测定本发明多孔树脂珠粒的溶胀体积。例示性地，将l.OOg多孔树 脂珠粒放入IOml容量的量筒中并将过量的乙腈或甲苯加入其中，且使其在室温下静置M 小时，然后测定表观体积。
可将本发明的多孔树脂珠粒用作各种化学合成反应的载体，并且可将其特别有 效地用在核酸合成中。
关于使用本发明多孔树脂珠粒的核酸合成，可以应用常规已知的方法。例如， 将下列的核苷琥珀酰基连接体
权利要求
1.一种多孔树脂珠粒，所述多孔树脂珠粒包含第一芳族单乙烯基化合物-二乙烯基化 合物-(甲基)丙烯腈-第二芳族单乙烯基化合物共聚物，其中所述第二芳族单乙烯基化 合物含有能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团，并且其中所述多孔树脂珠粒在乙腈 中具有3至6ml/g的溶胀体积。
2.权利要求1中所述的多孔树脂珠粒，其中所述能够通过脱水缩合反应与羧基结合的 基团是选自氨基、氨烷基、羟基和羟烷基的基团。
3.权利要求1或2中所述的多孔树脂珠粒，其中源自所述(甲基)丙烯腈的结构单元 的量为1至6mmol/g。
4.权利要求1至3中任一项所述的多孔树脂珠粒，其中基于单体的总量，所述二乙烯 基化合物的量为2至IOmol%。
5.权利要求1至4中任一项所述的多孔树脂珠粒，其中所述二乙烯基化合物是二乙烯 基苯。
6.一种制造核酸的方法，所述方法包含将核苷或核苷酸通过可切割的连接体顺序结 合至权利要求1至5中任一项所述的多孔树脂珠粒，由此获得寡核苷酸。
全文摘要
本发明涉及一种多孔树脂珠粒及使用其制造核酸的方法，所述多孔树脂珠粒含有第一芳族单乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯腈-第二芳族单乙烯基化合物共聚物，其中所述第二芳族单乙烯基化合物含有能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团，并且其中所述多孔树脂珠粒在乙腈中具有3至6ml/g的溶胀体积。
文档编号C08F212/10GK102020812SQ20101028742
公开日2011年4月20日 申请日期2010年9月17日 优先权日2009年9月17日
发明者前田惠里, 小西达也, 森健二郎 申请人:日东电工株式会社