专利名称：一种表面有pei膜层的基片及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基片表面修饰方法及其修饰后的产物和应用，具体涉及一种表面有PEI (超枝化聚合物二甲亚胺)膜层的基片及其制备方法和应用。
背景技术：
根据现有的报道，可以有效抑制细菌感染的材料有聚阳离子、抗菌肽、抗生素、酶和纳米材料(如银、二氧化钛、二氧化硅、氧化镁、氧化铜、氧化锌、硒化镉/碲化镉纳米粒子或单壁碳纳米管)等，其中，可作为抗菌性涂层的含有聚阳离子基团的聚乙烯亚胺及其衍生物，由于其具有稳定性好、无耐药性、细胞毒性小和广谱抗菌性等优势，而已被广泛修饰到不同类型的基底表面上。
根据抑制细菌感染的方法不同，抗菌性涂层主要分为缓释型和接触型这两种，传统的利用物理吸附方法制备的抗菌涂层，虽可以通过缓释途径来发挥作用，但由于其吸附力不强，容易丧失抗菌能力，相比之下，共价偶联的抗菌涂层，由于其良好的稳定性，可以在多次使用后仍保留其抗菌性能。因此，研究出长期稳定的抗菌涂层，对于解决发生在食品工业，医院或公共场所的微生物感染具有重要意义。发明内容
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种表面有PEI膜层的基片，以使其具有较强的抗菌能力，稳定的抗菌性能。本发明的另一目的是提供上述基片的制备方法。本发明还有一目的是提供一种上述基片的用途。
技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下一种表面有PEI膜层的基片，在基片表面通过戊二醛交联有超枝化聚合物二甲亚胺膜层；所述基片为表面上含有羟基的基片，或为表面经处理后可形成羟基的基片，例如玻片； 该膜层不少于一层，优选为2飞层。
基片可以为玻片、硅橡胶、氧化硅、金属。当为玻片时，常用的处理方法为将玻片放入98%浓硫酸和30%双氧水H2A (3:1，V/V)混合溶液中，室温15min，后用去离子水冲洗干净。
—种制备表面有PEI膜层的基片的方法，包括以下步骤(1)将基片浸入体积比为3 1的98%浓硫酸和30%双氧水混合溶液中，室温反应15min， 取出，用去离子水洗净；然后将基片浸泡在体积比为1%的APTES水溶液中lh，用去离子水冲洗基片，再用N2吹干，110°C下干燥30min，制得APTES改性的APTES-glass ；(2)将APTES-glass浸入体积比为5%的戊二醛水溶液中，室温反应池，用去离子水洗净；再浸入体积比为1%的PEI水溶液中，室温反应池，用去离子水洗净；再浸泡在IM NaBH4 水溶液中池，用去离子水洗净，制得表面有单层PEI膜层的基片Gl. Ο-ΡΕΙ-glass ；(3)将Gl.Ο-ΡΕΙ-glass重复η次步骤(2)的操作，制得表面有多层PEI膜层的基片 Gn-PEI-glass，其中 η 不小于 1。3
表面有PEI膜层的基片在广谱杀菌中的应用。
有益效果与现有的抗菌性涂层相比，本发明的表面有PEI膜层的基片具有的突出优点包括通过在基片表面通过枝状偶联完成氨基放大，制得的基片性能稳定，具有良好的广谱杀菌效果。将基片浸入到PBS缓冲溶液中，37°C培养30d，用FTHR分析其降解率小于10%。在基片表面含一层膜层时，E. coli吸附量是5. IOXlO4个/cm2 ；当为5层时，E. coli吸附量增加到1. IOXlO7个/cm2。通过接触抗菌能力进行了检测，结果显示可在Smin 之内快速杀死吸附在基片上的代表革兰氏阴性菌的五coli,同时对像枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌也有很好的抗菌效果。具有很好的实用性，能够产生较好的经济效益和社会效■、Λfrff. ο
图1是修饰不同PEI层数基片的27001885011-1和观85 3100CHT1处的红外吸光度图；此图用于说明-CH2-的红外吸收峰的强度和PEI层数之间关系，图中-■-为不对称伸缩振动，-O-为对称伸缩振动；图2是LCSM表征大肠杆菌在Gn-PEI-glass上的附着图； 图3是激光共聚焦显微镜下观察基片表面大肠杆菌的吸附量结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
以下实施例所使用的药品和仪器为普通载玻片，3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES) (Sigma, USA)，戊二醛(Aldrich，USA), 异硫氰酸荧光素(FITC) (Sigma, USA), FITC-BSA (北京博奥森生物科技有限公司，中国)， LIVE/DEAD BacLight bacterial viability Kit (L13152, molecular probes), 1-芘甲胺盐酸盐(I-PAM) (Sigma, USA)，硼氢化钠(NaBH4) (Aldrich, USA)，聚二甲亚胺(PEI) (Μ. W. 60000，Sigma, USA), LB 培养基(1% 胰化蛋白胨，0. 5% 酵母提取物，1% NaCl, pH=7. 2)， 牛肉膏蛋白胨培养基(0. 5%牛肉膏，1%胰化蛋白胨，0. 5% NaCl, pH=7. 2)，PBS缓冲溶液(去离子水为溶剂(电阻大于 >18MQ/cm)，8. Og/L NaCl，0.2g/L KCl，1.2g/L Na2HPO4,0. 2g/L KH2PO4, pH=7. 2)), L - agar固体培养基的制作方法是将琼脂(1% (w/w))加入到LB培养基中，高温灭菌后冷却形成固体培养基。
仪器透射红外光谱的测定运用分辨率为0.25 cm—1的Bruker Vertex 70光谱仪。
实施例1(1)将玻片放入98%浓硫酸H2SO4和30%双氧水HA (3:1，V/V)混合溶液中，室温15min， 后用去离子水冲洗干净。然后把干净的玻片浸泡在APTES水溶液(1%，ν/ν，ρΗ=5.5)中lh， 用去离子水冲洗基片3遍，以除去物理吸附，再用高纯N2吹干，放入110°C烘箱30min，制得 APTES 改性的样品 APTES-glass。
(2)将APTES-glass浸入戊二醛溶液(5%，v/v，pH=9. 5)中，室温反应2h ；用去离子水反复冲洗，再浸入PEI水溶液(1%，ν/ν，ρΗ=9.5)中，室温反应》1;用去离子水反复冲洗， 玻璃基片浸泡在NaBHjK溶液中池，反应后玻璃基片用乙醇或去离子水冲洗多次，从而确保玻片上的物理吸附全部清除，制得Gl. 0-PEI-glass, Gl. Ο-ΡΕΙ-glass为表面有1层PEI膜层的基片。
制备Gn-PEI-glass时，只需将Gl. O-PEI-glass重复步骤(2)，重复1次可增加1 层PEI膜；进行多次重复，可制得多层PEI膜基片，即(in-PEI-glass，其中η代表膜层数。
按照上述方法，制备出膜层数为1、2、3、4和5的(in-PEI-glass样品。用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)表征检测Gn-PEI-glass，在3393 cm"\3300 cnT1 (N _ H键区域)和 2937 cm"\2850 cm—1 (-CH2-区域)有一个逐渐的上升过程，因此Gn-PEI-glass为多层嫁接形成。
对Gn-PEI-glass进行AFM的表征，基片水相的接触角出现从63. 2°到56. 1° 的逐渐下降的过程，通过AFM对各循环基片的表征，可以看出，对比干净光滑的基片，在 Gl. Ο-ΡΕΙ-glass和G5. Ο-ΡΕΙ-glass表面有同类型分散的隆起纳米聚合物，取相同大小区域，基片RMS粗糙度分别为1. 6nm, 2. lnm,9. Onm, 12. 2nm，可以看出整体粗糙度随循环的增多而升高。在Gl.O-PEI-glass基片表面，纳米聚合物隆起直径130士40nm，高度32nm。但是G5.0-PEI-glaSS，直径扩大到190士60nm，高度增加到64nm。从大小范围和强度可以看出，这些隆起纳米聚合物的形成是由于超枝状PEI的原因。为了定量基片表面PEI分子的覆盖程度，检测了 2700^2885cm^和2885 3100cm—1处的红外吸光度(-CH2 -区域)，如图1 所示。在图1中可以看到，随着PEI循环的增加，吸光度也随之直线上升，这是由于PEI在交联基片表面的每个循环中起到关键的作用。此外，为了检测G5. O-PEI-glass基片聚合膜的稳定性，把其放入PBS缓冲溶液中连续浸泡30天，追踪-CH2-基团红外吸光度的变化。 可以看出，在第1天大约5%的PEI分子由于物理吸附的脱落而流失，在之后的30天中，PEI 分子总量呈现逐渐缓慢的脱落，但脱落量不足5%。说明(in-PEI-glass基片的稳定性较高， 疏水超枝结构对硅氧烷的水解作用有较好的保护性。
实施例2在室温下，将100 μ 1浓度为5 X IO8CfuAiL的细菌悬浮液滴加到Gn-PEI-glass上，静置 lh，将&i-PEI-glaSS基片用PBS缓冲溶液冲洗并浸泡，用激光共聚焦显微镜(LSCM)下观察其表面吸附的细菌。
大肠杆菌(E. coli)的活性用LIVE/DEAD试剂盒对细菌染色，此试剂盒包括细胞核染色剂SYT09和碘化丙啶(PI )。在室温避光环境下，将100 μ 1的SYT09和PI的混合溶液 (ν/ν，1:1)加入到100 μ 1的细菌悬浮液中15min，在激光共聚焦显微镜(LSCM)下观察。
抗菌性检测采用美国ASTM 标准E2149-01 Standard Test Method for Determining the Antimicrobial Activity of Immobilized Antimicrobial Agents under Dynamic Contact Conditions。 Gn-PEI-glass 基片(1. 5X 2. 5cm2)浸入至Ij 5mL 的细胞悬浮液中(细胞数量约为7X 105)，另选空白玻璃基片作为对照，同样放入同一浓度的另一 5mL的细胞悬浮液中lh。适当稀释后转入L-agar固体培养基中培养，每一个可见菌斑都是单一细菌克隆复制形成，可以通过计数菌斑来推测抗菌效果。基片表面改性的杀菌效果可以通过对Ncontrol和Nsample中L_agar固体培养基菌斑数的检测得到。
大肠杆菌在Gn-PEI-glass上的附着运用LCSM进行表征，如图2所示，对比APTES-glass (5. 10 X 104units/cm2)，Gn-PEI基片吸附大肠杆菌的数量逐渐增加 (从1. 53 X IO6到1. 10X107units/cm2), G3. O-PEI聚合膜接近饱和。大肠杆菌细胞在(in-PEI-glass上的附着是由于静电吸附作用形成，细菌细胞壁外带有负电荷，而Gn-PEI-glass基片表面带有大量的正电荷。随着(in-PEI-glass循环的增加，基片表面所带正电荷增加，从而吸附更多的大肠杆菌。此外，通过调节PH值，可以有效调节大肠杆菌的吸附量。取相同的G5. O-PEI基片，当pH5. 5时，大肠杆菌的吸附量上升到1. 13 X IO8Units/ cm2，而当ρΗ9· 5时，吸附量下降到1. 51 X IO4 units/cm2。ρΗ5· 5基片的吸附量为通常生理状态的10倍左右，这是由于氨基提供了质子产生正电荷(NH3+)。结果更好地证明了大量吸附是由于&i-PEI-glaSS表面的正电荷与细菌细胞壁带有的负电荷相互静电吸附形成的。
大肠杆菌(E. coli)的活性用LIVE/DEAD试剂盒对细菌染色，此试剂盒包括可以在荧光显微镜下将细胞核染成绿色的染色剂SYT09 (最大激发/发射波长，480/500nm)和将死细胞染成红色的碘化丙啶PI (最大激发/发射波长，490/635nm)。SYT09可以将具有完整细胞膜的细菌染成绿色，PI可以将不完整细胞膜的死细胞染成红色。
大肠杆菌吸附后，运用正常/死亡两种荧光染色标记细菌细胞膜的渗透性，可以看到被吸附的细胞都死亡了。所以可以用同样方法追踪细菌与to-PEI-glass表面接触的动态过程，将空白玻璃样品、APTES-glass和Gn-PEI-glass表面滴加相同量的大肠杆菌悬浮液(5X108cell/mL)，后加入SYT09和PI混合后的染色液，在室温下共置培养15min， 之后不洗直接进行激光共聚焦显微镜下观察基片表面大肠杆菌的吸附量，如图3所示，同时，也用同样方法处理了革兰氏阳性菌的代表一枯草芽孢杆菌。空白玻璃样品上的大肠杆菌在30min后在荧光显微镜下都呈绿色，说明试验用大肠杆菌具有较强活性，具有完整的细胞膜。IOmin后在(in-PEI-glass基片上细菌由于细胞膜开始破裂变成红色，对比 APTES-glass，只有很少一部分细菌变成红色，说明PEI聚合膜对细菌具有很强的接触杀菌能力。同时，为了对&1-PEI的抗菌能力分析，又运用ASTM的标准方法进行了检测。图8 中，在Gl.O-PEI-glass中死亡大肠杆菌的量达到1. 65X 105units/cm2，而APTES-glass中死亡大肠杆菌的量为8.93X 104imitS/cm2。因此，PEI在抗菌试验中具有决定性的作用。然而，Gn-PEI聚合膜的抗菌效果不仅仅决定于PEI的循环次数(轻微的上升由1.65X 105到 1. 74X 105units/cm2)。
&1-PEI聚合膜上的氨基诱导在细菌表面的阳离子和正电荷，扰乱细菌细胞壁上的阴离子，从而造成细胞膜的破损，导致K+和其他细胞内成分的外泄，最终的结果是细菌的死亡。SEM电镜图片中，死亡的细胞其细胞形态皱缩，细胞膜破裂，内容物外泄。而正常细胞体态饱满，细胞完整。随着PEI循环的增加，&1-PEI聚合膜吸附细菌的量增加，杀菌速度加快，抗菌效果更好。
实施例3Gn-PEI-glass的制备方法同实施例1，基片为硅橡胶，硅橡胶的处理方法为将硅橡胶片放入98%浓硫酸H2SO4和30%双氧水H2A (3:1，V/V)混合溶液中，室温15min，后用去离子水冲洗干净。
Gn-PEI-glass的抗菌实验同实施例2，结果显示可以取得以玻片为基片制得的 Gn-PEI-glass相当效果和相似规律。
实施例4Gn-PEI-glass的制备方法同实施例1，基片为氧化硅，氧化硅的处理方法为将氧化硅片放入98%浓硫酸H2SO4和30%双氧水H2A (3:1，V/V)混合溶液中，室温15min，后用去离子水冲洗干净。
Gn-PEI-glass的抗菌实验同实施例2，结果显示可以取得以玻片为基片制得的 Gn-PEI-glass相当效果和相似规律。
实施例5Gn-PEI-glass的制备方法同实施例1，基片为金属，金属的处理方法为常用空气等离子体处理方法。常用的金属片包括铁片、铝片、铝合金、铁合金等。
Gn-PEI-glass的抗菌实验同实施例2，结果显示可以取得以玻片为基片制得的 Gn-PEI-glass相当效果和相似规律。
权利要求
1.一种表面有PEI膜层的基片，其特征在于在基片表面通过戊二醛交联有超枝化聚合物二甲亚胺膜层；所述基片为表面上含有羟基的基片，或为表面经处理后可形成羟基的基片。
2.根据权利要求1所述的表面有PEI膜层的基片，其特征在于该膜层为2飞层。
3.根据权利要求1所述的表面有PEI膜层的基片，其特征在于所述基片为玻片、硅橡胶、氧化硅、金属。
4.一种制备权利要求1所述的表面有PEI膜层的基片的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将基片浸入体积比为3:1的98%浓硫酸和30%双氧水混合溶液中，室温反应15min， 取出，用去离子水洗净；然后将基片浸泡在体积比为1%的APTES水溶液中lh，用去离子水冲洗基片，再用N2吹干，110°C下干燥30min，制得APTES改性的APTES-glass ；(2)将APTES-glass浸入体积比为5%的戊二醛水溶液中，室温反应池，用去离子水洗净；再浸入体积比为1%的PEI水溶液中，室温反应池，用去离子水洗净；再浸泡在IM NaBH4 水溶液中池，用去离子水洗净，制得表面有单层PEI膜层的基片Gl. Ο-ΡΕΙ-glass ；(3)将Gl.Ο-ΡΕΙ-glass重复η次步骤(2)的操作，制得表面有多层PEI膜层的基片 Gn-PEI-glass，其中 η 不小于 1。
5.权利要求1所述的表面有PEI膜层的基片在广谱杀菌中的应用。
6.权利要求1所述的表面有PEI膜层的基片在杀死革兰氏阴性菌中的应用。
7.权利要求1所述的表面有PEI膜层的基片在杀死革兰氏阳性菌中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种表面有PEI膜层的基片，在基片表面通过戊二醛交联有超枝化聚合物二甲亚胺膜层；所述基片为表面上含有羟基的基片，或为表面经处理后可形成羟基的基片，例如玻片；该膜层不少于一层，优选为2~5层。本发明的表面有PEI膜层的基片，通过在基片表面通过枝状偶联完成氨基放大，制得的基片性能稳定，具有良好的广谱杀菌效果。将基片浸入到PBS缓冲溶液中，37℃培养30d，用FT-IR分析其降解率小于10%。在基片表面含一层膜层时，E.coli吸附量是5.10×104个/cm2；当为5层时，E.coli吸附量增加到1.10×107个/cm2。通过接触抗菌能力进行了检测，结果显示可在8min之内快速杀死吸附在基片上的代表革兰氏阴性菌的E.coli，同时对像枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌也有很好的抗菌效果。具有很好的实用性，能够产生较好的经济效益和社会效益。
文档编号C08L83/04GK102501495SQ20111031847
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月19日 优先权日2011年10月19日
发明者夏兵, 施季森, 董琛 申请人:南京林业大学