专利名称：一种prp核糖提取方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种PRP核糖的制备方法。
背景技术：
B型流感嗜血杆菌(Hib)是引起婴幼儿脑膜炎、中耳炎的主要致病因子，荚膜是B型流感嗜血杆菌的主要毒力因子，主要成分是核糖基核糖醇磷酸酯(PRP)重复单元。研究发现抗PRP多糖的抗体可有效的降低Hib的感染，为此基于PRP的多糖疫苗或者结合疫苗已经成为预防Hib感染的主要方法。Hib结合疫苗是世界上开发最早、也是最为成功的结合疫苗，此类结合疫苗的成功开发解决了多糖疫苗不能有效激发婴幼儿免疫反应的缺点，随着结合疫苗的技术发展，现在已经有多家制药企业研发了不同类型的Hib结合疫苗；B型流感嗜血杆菌PRP多糖属于Hib细菌荚膜组分之一，故有称之为Hib荚膜多糖，主要成分为磷酸化的核糖基核糖醇，用英文表述为polyribophosphate,简写为PRP,有文章用聚核糖基核糖醇磷酸酯来表述其主要的成分，也有文章用磷酸多核糖核醇来表述；总之,Hib荚膜多糖、PRP多糖、PRP核糖、polyribophosphate、聚核糖基核糖醇磷酸酯、磷酸多核糖核醇均指同一物质，在此篇文章中都指来自于Hib培养液纯化得到的荚膜多糖，文章中通常用PRP多糖来书写。获取纯化的PRP多糖是研制Hib结合疫苗的基础，传统的PRP多糖提取方法如下首先是收集十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀的发酵液中的复合多糖，之后乙醇沉淀收集粗制多糖，或超滤浓缩后乙醇沉淀，取上清，然后加入适宜浓度的乙醇溶液沉淀多糖，并依次用无水乙醇、丙酮洗涤沉淀物，干燥后即为粗制多糖。将粗制多糖溶解于1/10饱和醋酸钠溶液中，然后按适当 比例用冷酚溶液重复抽提数次。收集上清液，并透析或超滤脱酚，再加乙醇至最终浓度为60% -80%，离心后收集沉淀物，或超滤浓缩后乙醇沉淀，取上清，然后加入60% -80%的乙醇溶液沉淀多糖，依次用无水乙醇、丙酮离心洗涤，真空干燥，所得固体即为精制多糖。传统的PRP多糖提取方法繁琐，回收率低，而且大量使用苯酚、丙酮等有机试剂，这些有机试剂对环境造成潜在的影响；此外，CTAB沉淀PRP核糖因涉及到沉淀是否完全对发酵以及浓缩的批次一致性提出更高的要求，当然采用苯酚抽提蛋白这个工艺存在放大困难，反复操作的弊端。本发明在Hib结合疫苗的生产过程中采用了新的PRP多糖提取方法，此提取方法不仅有别于传统的PRP多糖提取方法，而且更为简捷、可以迅速放大，此外也避免了传统方法中的多种化学试剂存在的潜在污染。
发明内容
本发明的目的是提供一种从B型流感嗜血杆菌(Hib)发酵液中提取PRP多糖的生
产工艺。
从Hib发酵液中制备PRP多糖，重点考虑三个策略，其一是提取特异性的PRP多糖，其二是降低蛋白和核酸的百分含量，最后是尽量的避免引入外源物质。因此，优先考虑过程简单、易于放大的纯化工艺；采用现在高速发展业已成熟的纯化设备和方法，优先考虑安全性高、工艺稳定的纯化设备和方法。根据本发明的方法，该方法包括(I)从B型流感嗜血杆菌发酵液中去除菌体得到发酵液上清；(2)从发酵液上清中去除核酸和蛋白，得到PRP多糖。根据本发明的方法，其中步骤(I)去除菌体沉淀得到发酵液上清可以采用本领域任何常用的或者常规的方法，优先采用离心的方法，例如可选择8000转/分钟(rpm)离心20min,也可选择 12000rpm 离心 lOmin。按照以上步骤(I)的方法得到的发酵液上清可以直接进行步骤(2)，也可以浓缩发酵液上清再进行步骤(2)，还可以过滤发酵液上清再浓缩。优选的是过滤后浓缩发酵液上清。本发明的步骤(2)采用以阴离子介质装填的色谱柱去除蛋白和核酸类杂质。其中所述的阴离子介质优选强阴离子介质Q-sepharose。Q-sepharose介质同时可以吸附发酵液上清中的部分蛋白和核酸以及几乎全部的PRP多糖，采用Q-s印harose介质的洗脱条件可以通过调节PH或者离子强度或者同时调节PH和离子强度达到。
本发明优选用调节离子强度来洗脱Q-sepharose的吸附物。本发明的柱层析步骤如下首先用4倍体积的A液(A液0. 5*PBS,电导1. 77ms)平衡Q-sepharose柱,平衡Q-sepharose柱的过程中同时用OD28tl和OD2tl6以及电导曲线来监测柱子平衡情况,待OD28tl和OD2tl6吸收曲线与基线持平，电导曲线显示的电导率和A液一致(1.77ms)时开始上样，分离PRP多糖,一般4倍柱体积的A液可以完全平衡Q-sepharose柱满足上样条件。优选通过上样阀进入Q-sepharose柱(Q-sepharose柱大小为16*20cm,由GE公司提供)，同时监控OD28tl和OD2tl6吸收来观察穿透液中蛋白质和多糖的含量。上样结束后用6倍柱体积的A液洗涤未被结合的蛋白、核酸以及多糖等其他杂质，同时监控OD28tl和OD2tl6吸收，优先洗脱至OD28tl和OD2tl6吸收峰与基线持平，6倍柱体积的A液即可。随后用B液(B液0. 5*PBS+2M NaCl)分梯度洗脱，用低浓度的B液(28%的B液)洗脱蛋白和核酸等，高浓度的B液(100% B液)洗脱多糖。优选的先用6倍柱体积的28%的B液洗脱Q_s印harose柱，弃去洗脱液，再用6倍柱体积的100%的B液洗脱Q-sepharose柱，收集洗脱液。本发明的发酵液上清通过上样阀进入Q-s印harose柱的过程中，通过监控OD28tl和OD2tl6吸收来观察穿透液中蛋白质和多糖的含量，OD280是蛋白质的特异性吸收波长，荚膜多糖没有特异性的吸收波长，一般通过OD28tl和OD2tl6吸收峰的差别来判断溶液中荚膜多糖的含量高低，当穿透液中存在较高浓度的荚膜多糖或者OD2tl6的吸收峰比较高的时候，说明Q-sepharose已经满载，此时停止上样，通常离子交换介质的吸附量通常比较高，一般情况16*20的Q-s印harose阴离子交换柱可完全满足2L发酵液上清中PRP核糖的纯化。
本发明通过Q-sepharose的分步洗脱,达到以下目的其一，除去发酵液中的大量蛋白、核酸等其他杂质，其二，浓缩了发酵液上清中的PRP核糖。优选的在步骤(2)之前还包括浓缩发酵液上清的步骤。浓缩发酵液上清的主要目的是缩小上样前的体积，节约上样时间，浓缩发酵液上清可以采用任何本领域常用的或常规的实验方法，优先采用膜包超滤浓缩，超滤膜包选用Millipore公司的PVDF材质构成的膜包，膜包大小为50KDa。通常浓缩后的体积为浓缩前发酵液上清的二十分之一，超滤浓缩设备为millipore公司的，膜包的大小依实验目的物决定，用于Hib荚膜多糖提取的超滤膜包通常选用50KDa，超滤浓缩方法为本领域常见的实验方法，超滤浓缩至预定体积后，可以直接进行后续的实验，也可以选用PBS反复洗涤发酵液，目的是除去发酵液中的部分蛋白质和核酸，原因是蛋白质和核酸往往小于50KDa，因此在PBS缓冲液置换发酵液的过程中，部分蛋白质和核酸随透过液流出，可以选用50倍浓缩发酵液体积的PBS反复置换浓缩液，结果就是大部分核酸和蛋白质随透过液流出，浓缩液中主要组分为PRP多糖。本发明还包括，将发酵液上清在采用膜包超滤浓缩之前过滤的步骤。过滤可以采用任何本领域采用的方法，例如用O. 22um的滤膜过滤，优选采用O. 22um孔径的中空纤维膜，中空纤维比普通的滤膜有更大的表面积，因此有更多的过滤能力；实验优先采用O. 22um孔径的中空纤维(天津膜天膜科技股份有限公司，大小为50*386mm)过滤发酵液，同时收集透过液用于后续实验。Q-sepharose柱100% B洗脱液的主要组分为PRP多糖,不过仍含有部分蛋白质和核酸。本发明还包括用乙醇分级醇沉进一步除去剩余的核酸和蛋白质。
本发明的乙醇分级醇沉是依据低浓度的乙醇醇沉核酸和蛋白质，高浓度的乙醇主要醇沉核糖的原理，采用不同的乙醇浓度，从而得到不同的产物；实验通过设计一系列醇沉浓度，比如20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，分析沉淀中的物质，最后确定选用20%乙醇浓度，优先考虑25%乙醇浓度，最佳为30%乙醇浓度，沉淀时间为2小时或者过夜沉淀，优选过夜醇沉，可以去除发酵液中的蛋白和核酸；可以选用65%，也可以选用70%，优先考虑80%的乙醇浓度，沉淀时间为2小时或者过夜沉淀，优选过夜醇沉，可以醇沉PRP多糖；总之，优先的，采用25%乙醇浓度醇沉核酸和蛋白质，SOOOrpm离心20min收集上清，之后补加乙醇至80%，此时出现的沉淀主要组分为PRP核糖，80%乙醇醇沉的沉淀用O. 2M NaCl复溶后进行更进一步的纯化。可以采用高浓度醇沉(80%乙醇浓度)复溶物也可以采用低纯度醇沉(30%乙醇浓度)的上清为样品继续进行下一步的纯化，优先考虑高浓度醇沉复溶物，相对而言，高浓度沉淀复溶物体积小，节省上样时间，浓度高，有利于各种杂质的分离。本发明还可以包括采用凝胶介质进一步分离纯化的步骤，其中所述的凝胶介质优选sepharose 4FF。sepharose 4FF分离荚膜多糖的流动相为0. 2M NaCl,因此,此时，高浓度沉淀PRP核糖沉淀优选用0. 2M NaCl来复溶，复溶体积依据沉淀量的多少来决定。因此本发明的方法，最优选的过程包括以下步骤(I)去除菌体得到发酵液上清Hib发酵液8000rpm离心20min去除菌体沉淀得到发酵液上清；
(2)膜包超滤浓缩发酵液上清发酵液上清过O. 22um的中空纤维，滤过液用50KDa的膜包超滤浓缩，通常浓缩后的体积只有初始发酵液上清的二十分之一；(3)采用阴离子介质去除蛋白和核酸类杂质浓缩液用Q-sepharose柱进一步纯化，上样前先用4倍柱体积的A液平衡Q-sepharose柱(A液0. 5*PBS),上样结束后用6倍柱体积的A液继续洗漆Q-sepharose柱，除去大量吸附性较弱以及没有吸附的杂质；之后先用6倍柱体积的28%的B液洗脱Q-sepharose柱，弃去洗脱液，再用6倍柱体积的100%的B液洗脱Q-sepharose柱,收集洗脱液；(4)乙醇分步醇沉洗脱液用乙醇分步醇沉进一步纯化，其中30%乙醇浓度除去蛋白和核酸，80%的乙醇浓度沉淀PRP核糖；离心收集80%醇沉的沉淀，用0. 2M NaCl复溶，取溶解上清进行进一步的纯化；(5)采用凝胶介质进一步分离纯化0. 2M NaCl复溶物用s印harose 4FF进一步分离纯化，自动收集器收集洗脱液，采用药典规定的方法确定PRP核糖洗脱曲线，收集合并PRP核糖。合并S印harose_4FF分离纯化得到的PRP多糖，脱盐冻干，脱盐采用本领域常见的实验方法，优先选用透析袋脱盐，冻干后沉重，计算回收率，按照欧洲药典的方法进行质检。此实验方法PRP核糖 的回收率最低位70%，回收率是通过测定发酵液中的PRP核糖浓度从而得到发酵液上清总的核糖质量，然后沉重最终得到的PRP多糖量，两者相比得到的。采用欧洲药典提供的方法进行PRP多糖的质检，结果完全符合欧洲药典的要求，此质检所采用的方法是本领域常见的实验方法，且在药典中有详细的实验步骤，通过测定核糖的浓度为35% (欧洲药典要求高于32% )，lorry法测定蛋白浓度为0. 4% (欧洲药典要求< 1%)，0D260测定核酸浓度为0.3% (欧洲药典要求< 1%)，磷含量为8.0% (欧洲药典要求6. 8-9% )0
图1为Q-sepharose柱洗脱Hib发酵液OD2tl6和OD28tl曲线图，从中可以看出28%以及100%洗脱峰，其中28%洗脱峰的0D2Q6/0D28Q小于100%洗脱峰0D2(l6/0D28(l，PRP多糖没有特异性的吸收峰，一般通过OD2tl6非特异性的吸收峰来判断含量多少，但是存在其他物质时会干扰OD2tl6吸收峰的大小，比如OD28tl的吸收峰，但是OD2tl6AD28tl比值可以相对反映PRP
核糖含量。图2为100%洗脱液分级醇沉后用0. 2M NaCl复溶物分离图，从图中可以看出IlOml洗脱液之前蛋白峰很低(OD28tl)，说明蛋白的去除效果很好，同时OD2tl6吸收峰很高，说明PRP多糖的含量也比较高，s印harose 4FF分离图说明整个多糖的提取工艺非常好，起到去除蛋白，浓缩核糖的目的。
具体实施方式
实施例1I) Hib发酵液超滤浓缩Hib发酵液8000rpm离心20min去除菌体沉底,之后过O. 22um的中空纤维,滤过液用50KDa的膜包20倍超滤浓缩，浓缩液用于Q柱的分离纯化，实验发酵4L发酵液，经超滤浓缩后得到200ml浓缩液。2) Q-sepharose柱分离纯化超滤浓缩液Q-sepharose柱大小为16*100cm,由GE公司提供,也可以选用更大体积的分离柱，依实验而定；对于16*100cm分离柱，实验每次的上样量为100ml，超滤浓缩液共进行两次；上样前先用4倍柱体积的A液平衡Q-sepharose柱(A液0. 5*PBS),上样后Q-sepharose柱用A液继续洗脱到基线，分步洗脱，6倍柱体积的28% B (B液0. 5*PBS+2M NaCl)洗脱液主要成分为蛋白和核酸，弃之不用，6倍柱体积的100% B液洗脱液中主要成分是PRP多糖；采用AKATA (GE公司)分析纯化，同时监测OD2tl6和OD28tl的变化(图1为Q-s印harose柱洗脱Hib发酵液OD206和OD280曲线图)。3) 100 % B洗脱液醇沉将100% B洗脱液进行分级醇沉，其中采用低浓度25%的乙醇浓度沉淀核酸和蛋白，之后采用高浓度80%的乙醇浓度沉淀PRP多糖，高浓度80%的乙醇浓度沉淀的PRP核糖用0. 2M NaCl复溶，12000rpm离心IOmin去除未充分溶解的沉淀,上清过sepharose 4FF进一步分离纯化。4)沉淀复溶物过 sepharose_4FF80%乙醇浓度醇沉沉 淀复溶物过s印harose 4FF进一步分离纯化，自动收集器分管收集洗脱液，5ml/管,检测OD2tl6和OD28tl的吸收峰变化情况,凝胶介质sepharose 4FF分离纯化多糖过程中，分子量大的先从柱介质中出来，分子量小的由于路径比较长，因此后从柱介质中洗脱下来，由于荚膜多糖为一系列基本糖构成的糖单元的聚合物，比如Hib的PRP多糖的基本单元则是核糖基核糖醇磷酸酯，Hib的PRP多糖是由核糖基核糖醇磷酸酯一系列重复单元组成，即聚核糖基核糖醇磷酸酯；由于每一条荚膜多糖的重复单元数不尽相同，因此荚膜多糖通常为大小不一致的混合物，尤其是发酵培养得到的荚膜多糖，分子量差别比较大，但是这些差别仅限于糖的重复单元数的不同(图2为100%洗脱液分级醇沉后用
O.2M NaCl复溶物分离图)。实验通过测定自动收集器收集的每一管中的核糖以及蛋白含量，可以得出Hib发酵液经Sephar0Se-4FF柱洗脱后的分布曲线，结果表明，最先洗脱得到的是荚膜多糖，最后洗脱得到的为蛋白质和核酸，由于蛋白质和核酸往往小于荚膜多糖，因此sephar0Se-4FF可以很方便的分离蛋白质、核酸以及核糖，最先收集的荚膜多糖中，接近外水体积的荚膜多糖的分子量比较大，中间位置出来的荚膜多糖的分子量比较小，依前所述，分子量大小只是糖单元重复数不同，由于荚膜多糖分子量普遍过大，因此分子量大和小的荚膜多糖的免疫原性差别不大。sepharose-4FF凝胶分离收集管中PRP核糖的合并依据两个原则其一，合并管的主要成分是核糖，其二 分子量符合中国药典规定的Kd小于0.5的比例占50%以上，采用本领域常见的实验方法计算PRP核糖的洗脱曲线，计算KD = 0. 5时对应的洗脱体积就可以确定收集范围。
5)收集多糖冻干质检收集的多糖用水置换缓冲液至低电导，完全脱盐后分装冻干，冻干时间依据不同的冻干机而有所不同，收集冻干物，进行质检，可以看出通过此纯化方法可以得到蛋白、核酸以及PRP多糖含量符合药典要求的多糖。6)冻干多糖的质检冻干多糖沉重，之后采用欧洲药典的要求进行质检，质检方法为本领域常用的实验方法，在欧洲药典上有明确的操作方法，此外中国药典也提供相似的质检方法，结果如下表1:PRP质检结果
权利要求
1.一种从Hib发酵液中制备B型流感嗜血杆菌PRP多糖的方法，其特征在于，该方法包括 (1)从B型流感嗜血杆菌发酵液中去除菌体得到发酵液上清； (2)从发酵液上清中去除核酸和蛋白，得到PRP多糖。
2.根据权利I的方法，其特征在于，步骤(I)得到的发酵液上清可以直接进行步骤(2)，也可以浓缩发酵液上清再进行步骤(2)，还可以过滤发酵液上清，再浓缩再进行步骤⑵。
3.根据权利I的方法，其特征在于，其中步骤(I)采用离心的方法去除菌体。
4.根据权利2的方法，其特征在于，其中步骤(2)所述的浓缩发酵液上清用膜包超滤浓缩。
5.根据权利I的方法，其特征在于，其中步骤(2)采用以阴离子介质装填的色谱柱去除蛋白和核酸类杂质。
6.根据权利5的方法，其特征在于，其中所述的阴离子介质为强阴离子介质Q-sepharose0
7.根据权利6的方法，其特征在于，在采用阴离子介质去除蛋白和核酸类杂质之后，还要进行乙醇分布醇沉纯化的步骤。
8.根据权利7的方法，其特征在于，在进行乙醇分布醇沉纯化的步骤之后，还要进行用凝胶介质进一步分离纯化的步骤。
9.根据权利8的方法,其特征在于,其中所述的凝胶介质是sepharose4FF。
10.根据权利9的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤 (1)去除菌体得到发酵液上清 Hib发酵液8000rpm离心20min去除菌体沉淀得到发酵液上清； (2)膜包超滤浓缩发酵液上清 发酵液上清过O. 22um的中空纤维，滤过液用50KDa的膜包超滤浓缩，通常浓缩后的体积只有初始发酵液上清的二十分之一； (3)采用阴离子介质去除蛋白和核酸类杂质 浓缩液用Q-sepharose柱进一步纯化,上样前先用4倍柱体积的A液平衡Q_sepharose柱(A液0. 5*PBS)，上样结束后用6倍柱体积的A液继续洗涤Q-s印harose柱，除去大量吸附性较弱以及没有吸附的杂质； 之后先用6倍柱体积的28%的B液洗脱Q-sepharose柱，弃去洗脱液，再用6倍柱体积的100%的B液洗脱Q-sepharose柱,收集洗脱液； (4)乙醇分步醇沉 洗脱液用乙醇分步醇沉进一步纯化，其中30 %乙醇浓度除去蛋白和核酸，80 %的乙醇浓度沉淀PRP核糖；离心收集80%醇沉的沉淀，用0. 2M NaCl复溶，取溶解上清进行进一步的纯化； (5)采用凝胶介质进一步分离纯化0.2M NaCl复溶物用sepharose 4FF进一步分离纯化，自动收集器收集洗脱液，采用药典规定的方法确定PRP核糖洗脱曲线，收集合并PRP核糖。
全文摘要
本发明涉及B型流感嗜血杆菌聚核糖基核糖醇磷酸酯纯化方法，该方法包括以下步骤(1)从B型流感嗜血杆菌发酵液中去除菌体得到发酵液上清；(2)从发酵液上清中去除核酸和蛋白，得到PRP多糖。
文档编号C08B37/00GK103059149SQ201110318119
公开日2013年4月24日 申请日期2011年10月19日 优先权日2011年10月19日
发明者李军强 申请人:天士力制药集团股份有限公司