一种从褐藻中提取活性多糖的方法

专利名称：一种从褐藻中提取活性多糖的方法
技术领域：
本发明涉及天然产物有效成分提取领域，具体为一种从褐藻中提取活性多糖的方法。
背景技术：
海藻为海产藻类的统称，通常固著于海底或某种固体结构上，是由基础细胞所构成的单株或一长串的简单植物。海藻中的营养成分包括多糖类、蛋白质、脂质、色素及低分子物质。经传统中药及现在科学研究证明，海藻中具有增强免疫力及抗癌活性的物质主要成分是多糖类。海藻包括红藻、绿藻、褐藻等，而目前海藻多糖中研究和应用比较深入的主要为褐藻类多糖。褐藻为一类较高级的藻类，约有250属，1500多种。褐藻类的藻体呈黄褐色或深褐色，含有多糖类、蛋白类、脂类和甘露醇等物质。有的种类如海带，细胞内含有大量碘。褐藻多糖是褐藻重要的组成成分，其中包括褐藻胶、褐藻糖胶、褐藻淀粉等。褐藻胶，通常是指褐藻酸钠，是由β-D-甘露糖醛酸(简称M)和α-L-古罗糖醛酸(简称G)两种糖醛酸单体依靠1-4糖苷键连接成的线性多糖嵌段共聚物，在褐藻中含量很高。其段链结构有三种类型由连续M单元组成的M嵌段，由连续G单元形成的G嵌段，和由G单元和 M单元交替连接形成的MG嵌段。褐藻胶也是一类最具代表性的海藻化工产品，有据数据显示，目前我国褐藻胶年产量已高居世界首位。为便于保存和使用，一般将褐藻胶转化为褐藻酸钠作为最终产品。作为一种聚阴离子多糖(海藻酸)的钠盐，褐藻酸钠以其固有的理化性质，在工业上有着极为广泛的用途。在食品工业上，褐藻酸钠低热无毒、易膨化、柔韧度高， 添加到食品中可起到凝固、增稠、乳化、悬浮、稳定和防止食品干燥等诸多功能，是一种优良的食用添加剂。在纺织工业中，褐藻酸钠具有易着色、得色量高、色泽鲜艳和印花织物手感柔软等特点，是棉织物活性染料印花中最常用的糊料。同时它还可作为经纱浆料、防水加工、制造花边用等工艺过程的水溶纤维。在化妆品工业中褐藻酸钠用作牙膏基料、洗发剂、 整发剂等。在造纸工业上可作为施胶，在橡胶工业中用作胶乳浓缩剂，还可以制成水性涂料和耐水性涂料。褐藻酸钠还是一种重要的生物医用材料，被广泛用作药物缓释剂、聚合物薄膜、细胞封装、伤口敷料、手术海绵和栓塞剂等，在生物医用材料学、临床医学、组织工程学和药物学等领域正在受到越来越多的关注。至今，褐藻胶的生产基本上仍沿用碱消化工艺，基本原理是利用纯碱(Na2CO3)把各种不溶于水的褐藻酸盐转化成褐藻酸钠，并溶解在水中，再经过滤后得到干燥的海藻酸钠粉末。褐藻糖胶是一种杂多糖，组成除了含有岩藻糖和硫酸根外，还含有半乳糖、木糖、 甘露糖和糖醛酸等单糖。由于具有独特的结构和优异的生理活性，如调节血脂、降血糖、降血压、抗凝血、抗肿瘤、抗突变和防辐射、抗病毒、增强免疫功能等，褐藻糖胶已成为本世纪海洋药物研究的热点之一。褐藻淀粉又名昆布多糖，同样是一种具有多种生理活性的多糖。 褐藻糖胶及褐藻淀粉的制取主要利用生产褐藻胶、碘及甘露醇的废弃物为主要原料，经水浸提后分级醇沉。现有褐藻胶生产工艺方法的主要缺点1)耗水耗能严重，污染大。这也是制约海藻工业发展的关键因素。碱消化工艺原理简单，但实际工业制备中往往需要数十道过程，有些步骤是非常困难的。例如海带经过碳酸钠处理形成的褐藻酸钠浓浆中有许多不溶于水的纤维素等成份需要滤除，由于浓浆粘度过高，除了需要加入硅藻土等助滤剂外，还需要消耗大量的水进行稀释，而且对用水的水质要求很高。据统计，生产1吨成品海藻酸钠约需用700-1000吨水。另外，现有碱消化工艺的化学过程主要有加酸和加钙盐两种方法首先把褐藻中不溶于水的褐藻酸盐转换成可溶于水的褐藻酸钠，加入酸或钙离子使褐藻酸钠形成褐藻酸或褐藻酸钙沉淀，然后清洗后转换回褐藻酸钠，最后再进一步把褐藻酸钠加工成各类产品。无论采用哪种方法，都要产生的大量工业废水，对生态环境构成了严重的威胁。2)产品品种单一，质量欠优，附加值低。褐藻酸钠的分类从结构上可分为高G/M 比、中G/M比、低G/M比三种，从粘度上可分为超低粘度、低粘度、中等粘度、高粘度和超高粘度褐藻酸钠，从纯度上可分为工业用，食用以及医用三个级别。我国海藻酸生产企业大概有二十家。经过几十年的发展，我国已成为海藻酸生产大国。但我国在开发应用海藻酸的深度及广度上，特别是在开发高档次的海藻酸原料以及高附加值下游产品的开发方面与发达国家相比还存在着很大的差距。海藻酸工业是一个竞争非常激烈的领域，特别是中国企业采用低价格的策略使大部分海藻酸工业处于低利润状态，只有在医药卫生等高端应用领域才有较大的利润空间。我国国内企业生产的褐藻酸钠大多是中等粘度产品，作为保健医药类产品应用受到其胶凝性较强，溶解度低等特性的限制，活性得不到充分体现。上述诸多原因，都使我国现在的很多海藻胶生产企业经营十分困难。为突破上述困境，国内外研究人员针对以上各项不足，在多个环节做了长期不懈的努力，许多研究卓有成效，取得了一些重要的进展。这些研究包括对旧有工艺的改进以及新工艺的开发，比如最近国外学者报道的褐藻胶反应挤出新工艺，就同时具备节水、省时、 碱用量少，而且产品的粘度和收率都有不同程度的提高，但出于成本等问题，该设备目前还未得到推广。对传统海藻多糖产品的修饰包括利用生物、化学或物理方法，将褐藻酸钠和褐藻糖胶降解为褐藻胶低聚糖、寡糖和低分子量岩藻糖，对褐藻糖胶的硫含量进行调整等措施。研究结果也已证实，降解后的褐藻酸钠和褐藻糖胶的活性得到了有效地提高，有些低分子量褐藻酸钠已具有类似肝素的抗肿瘤和抗病毒的生理活性，可用于心脑血管疾病和病毒方面的药用研究。有些具有整肠和解毒、降血糖血脂、抗凝血、抗炎、免疫调节等作用，可作为糖尿病、肥胖症、直肠结肠癌、习惯性便秘患者的疗效食品。尤其是近年来，经过修饰后的低分子量褐藻胶或岩藻多糖的独特的生理作用不断被发现出来，它的活性及药用价值的研究已成为新的研究热点之一。另外，聚甘露糖醛酸和聚古罗糖醛酸是褐藻胶分子中所特有的，在自然界中尚未发现有单独存在的此类化合物。而且褐藻胶中两种糖醛酸聚糖的比例 (M/G)、嵌段的结构和排列等不同时，其性能会表现出显著不同。因此，也有许多科研工作者通过不同的降解、分离方法得到这类结构独特的多糖片段及其寡糖，研究其独特的生物活性，以期开发成为具有特殊疗效的药物。所有这些结构不同的系列低聚糖或寡糖，极大地丰富了海藻多糖产物的多样性。但上述这些研究都以中等粘度褐藻胶为原料，并未从根本上解决褐藻酸钠传统生产工艺中所存在的耗水耗能、污染严重等问题。因此，有必要继续开展
4海洋科学与海藻工业新工艺、新技术、新产品的研究和开发。

发明内容
针对现有技术中存在的加工过程中耗水耗能、污染严重，产品活性得不到充分体现等不足之处，本发明要解决的技术问题在于提供一种直接在褐藻原料中将褐藻多糖(褐藻酸钠、褐藻糖胶等)降解为低聚糖和寡糖，提高其生物活性，降低提取溶剂用量，实现工艺过程的节水、减排为目的的从褐藻中提取活性多糖的方法。为了解决上述的技术问题，本发明采用的技术方案如下所述一种从褐藻中提取活性多糖的方法，其特征在于包括如下的步骤1)将经洗净、干燥、粉碎后的褐藻类原料置于提取容器中，加入有机酸溶液或有机-无机混酸溶液，充分搅拌使均勻润湿；2)加热处理对步骤1)润湿后的物料加热，温度为50-150°C，保温时间为 10-180min，利用有机酸分子适度切断褐藻高分子多糖的糖苷键，实现其部分降解；3)利用有机溶剂进行充分洗涤至排除尽物料中酸溶液，完成褐藻的有机酸预处理；4)经预处理的褐藻，加入5-8倍体积水进行提取，提取液浓缩，调节PH值至中性后分级醇沉分别得到水溶性良好的富含甘露糖醛酸片段(富M)的褐藻胶、褐藻糖胶和褐藻淀粉；5)经过水提后的有机酸预处理褐藻原料残渣，再按碱消化工艺进行处理，可获得富含古洛糖醛酸片段(富G)的褐藻胶。步骤1)中褐藻粉与有机酸溶液或有机-无机混酸溶液的重量比为5/1-1/5。褐藻类选自海带属(Laminaria)海带，马尾藻属(Sargassum)海蒿子、海黍子、羊栖菜、鼠尾藻、匍枝马尾藻，墨角藻属(Fucus)岩藻、墨角藻，鹿角菜属(Pelvetia)鹿角菜，裙带菜属 (Undaria)裙带菜，巨藻属(Maerocystis)巨藻。所述有机酸溶液选自质量百分比浓度为5% -50%的草酸、质量百分比浓度 10% -99%的甲酸、质量百分比浓度10% -99%的乙酸和10% -99%的丙酸水溶液中的一种。有机-无机混酸中无机酸选自盐酸、硫酸、硝酸或磷酸，有机无机混酸中无机酸的质量百分比浓度为0. -15% .用于洗涤残余酸的有机溶剂选自C1-C3的醇或丙酮中的一种。所述有机酸溶液或有机-无机混酸溶液中的有机酸选用草酸溶液时，处理后采用有机溶剂洗涤去除残留的草酸；所述有机酸溶液或有机-无机混酸溶液中的有机酸选自甲酸、乙酸、丙酸溶液时，处理后先采用蒸馏、离心或者过滤去除大部分残留的酸，再采用有机溶剂洗涤除去少量残留的酸。步骤4)分级醇沉为加乙醇至含醇量20wt% -40wt%，过滤或者离心分离出沉淀， 获得富含甘露糖醛酸片段即富M片段的低聚褐藻胶沉淀，加乙醇至含醇量60wt% -70wt% 时，过滤或离心分离可获得褐藻糖胶沉淀，加乙醇至含醇量80wt% -85wt%时，过滤或离心分离可获得褐藻淀粉沉淀。富M片段的低聚褐藻胶沉淀加入碳酸钠进行转化得到富M片段褐藻酸钠。
所述富M片段褐藻胶、褐藻糖胶、褐藻淀粉和富G片段褐藻胶等不同结构的褐藻多糖，是以有机酸预处理的褐藻为原料，分别经水浸提、分级醇沉、碱消化等步骤获得。本发明原理是褐藻原料与有机酸的混合体系加热时，有机酸对褐藻中褐藻胶等有机大分子多糖进行温和适度的降解，具有不同分子结构的多糖物质对有机酸作用的敏感度不同，从而有选择的断裂其中的糖苷键，得到结构和性质独特的褐藻多糖产物。例如褐藻胶中存在M-M、G-G、M-G三种糖苷键，其中M-M、G-G糖苷键对有机酸较不敏感，而M-G糖苷键对有机酸较为敏感，有机酸选择性的断裂M-G糖苷键，因此褐藻胶被降解为富M片段和富G片段。富M片段水溶性良好，不需经过消化就可以顺利提出，而且由于分子量降低，提取耗水量显著降低。水溶性较差的富G片段则残留在褐藻残渣中，可通过碱消化工艺提出。 这样，不仅不同分子结构的褐藻多糖得到分离，而且大幅度减少了生产用水及用碱，简化了工艺过程及污水的处理过程。同时，产物褐藻多糖分子量的降低，水溶性增强，有利其生物活性的表达，从而提高了产品的附加值。有机酸预处理褐藻多糖工艺的优点特殊的海洋生存环境使褐藻细胞具有坚固的纤维素细胞壁，细胞结构紧密，质地坚韧，其中所含有效成分不易被提取。而且，天然的褐藻多糖普遍具有分子量大、水溶性差、 在人体内不易吸收等问题，因此，如何将褐藻多糖(褐藻酸钠、褐藻糖胶等)降解为低聚糖和寡糖，从而提高其生物活性已成为目前海洋药物的研究热点之一。在一定条件下，有机酸使植物细胞壁碳水化合物(纤维素和半纤维素)发生部分水解而溶出。假如在褐藻活性多糖的提取中使用这种有机酸体系，就有可能通过控制工艺条件，使褐藻细胞壁纤维质和藻胶类物质发生部分降解，从而改变褐藻细胞壁的结构层，使胞内有效成分迅速溶出的同时，胞壁多糖也得以尽快释放。采用酸性强度适中的有机酸体系，还可能在提取的过程中，在温和条件下，将褐藻多糖的分子结构进行适当降解，改善其固有的结构及理化性质，提高其生物活性。因此本发明提供了一种从褐藻中高效提取活性多糖的方法，即利用有机酸溶液适度切断褐藻多糖分子中的糖苷键，从而获得高附加值的多糖产物。同时，由于原料细胞壁结构层的改变，使得提取溶剂用量显著降低，因此实现了工艺过程的节水、减排目的。因此与现有技术相比，本发明更具有如下优点1.采用有机酸预处理后，节水及减排效果显著，用水量为传统方法的1/4-1/5 ；本工艺消化过程的用碱量约为旧消化工艺的1/2-1/3 ；2.相比较于传统工艺，新工艺多糖产物收率得到提高，特别是褐藻糖胶最高可提高约1倍；3.提取过程既直接实现多糖分子结构调控，获得平均分子量低、分子量分布范围窄、水溶性很好的高附加值多糖产品，还直接实现富M褐藻胶与富G褐藻胶的分离，而且褐藻糖胶的硫酸根含量得也得到了调整，有望在保持其活性的同时降低其毒副作用。新工艺多糖产品作为药物、保健食品等开发具有独特的优势。


图1为本发明工艺示意图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。比较例1称取100克经洗净、干燥、粉碎后的海带粉原料放入2L的烧杯中，加入IL水以及 20g碳酸钠于70°C的热水浴中进行搅拌1小时，然后用80-100L的水进行冲稀，充分搅拌后过滤，滤液加盐酸调节PH值至2. 0，离心分离，沉淀中加入碳酸钠进行转化，得到褐藻酸钠。 离心所得上清液用乙醇分级沉淀，加乙醇至含醇量65wt %时可得到褐藻糖胶，加乙醇至含醇量85wt%时可得到褐藻淀粉。各步产物干燥后分别计算提取率，提取率为各步产物与原料海带粉的质量比的百分数。并将褐藻酸钠、褐藻糖胶和褐藻淀粉这三种海带中多糖成分的提取率，以及工艺过程中的总耗水量、褐藻酸钠产品的粘度等数据进行了比较。褐藻酸钠产物利用传统方法进行纯化后得组成均一的单体多糖，采用H1-NMR方法测定其聚甘露糖醛酸片段(M)与古洛糖醛酸片段(G)比值M/G。采用乌氏粘度计在25°C水浴测定褐藻酸钠粘度。采用比浊法测定褐藻糖胶中硫酸根含量。所有分析结果见表1。实施例1如图1所示的工艺示意图，按照如下工艺进行1)1. 5kg干海带粉置于IOL的提取容器中；2)取无水甲酸1L，加水0. 5L配成甲酸溶液1. 5L ；3)将步骤2、中的甲酸溶液1. 5L，加到步骤1)中的提取容器中，充分搅拌使海带粉均勻润湿；4)步骤3)得到的润湿的物料加热至100°C，保温20min后，减压蒸馏，至提取容器
中无明显液体。5)步骤4)中进过减压蒸馏后的提取容器中加入无水乙醇5L，充分搅拌，过滤，滤液蒸馏回收乙醇，滤渣干燥后即为经过有机酸预处理后的海带粉。6)取步骤5)中有机酸预处理海带粉100克，放入IL的烧杯中，加入500ml蒸馏水，于70°C的热水浴中提取40min，过滤，重复上述过程1次，合并两次滤液并用碳酸钠溶液调PH至中性，滤渣备用。7)步骤6)中滤液浓缩后分级醇沉，加乙醇至含醇量30wt%，沉积得到富M片段的褐藻酸钠；加乙醇至含醇量65wt%沉积得到褐藻糖胶；加乙醇至含醇量为85wt%沉积得到褐藻淀粉。8)步骤6)所得滤渣中加入6g碳酸钠及500ml水，于70°C的热水浴中进行搅拌 40min，过滤，滤液调节PH值至中性后浓缩，醇沉(加乙醇至沉淀不再出现为止)得到富G 片段的褐藻酸纳。测试聚甘露糖醛酸片段(M)与古洛糖醛酸片段(G)比值M/G、褐藻酸钠粘度、以及褐藻糖胶中硫酸根含量的方法均与比较例1中的条件相同，各步产物提取率，以及工艺过程中的总耗水量、褐藻酸钠产品的粘度、褐藻糖胶中硫酸根含量等数据结果见表1。其中多糖的提取率均是所得目标产物与总原料的重量比。褐藻糖胶硫酸根含量是指硫酸根在褐藻糖胶分子中的质量百分数。表1有机酸预处理海带干粉与未经处理海带干粉原料的各步多糖产物提取率、总用水量及褐藻酸钠粘度比较情况
权利要求
1.一种从褐藻中提取活性多糖的方法，其特征在于包括如下的步骤1)将经洗净、干燥、粉碎后的褐藻类原料置提取容器中，加入有机酸溶液或有机-无机混酸溶液，充分搅拌使均勻润湿；2)加热处理对步骤1)润湿后的物料加热，温度为50-150°C，保温时间为10-180min， 提取容器的工作压力为20mmHg-760mmHg，利用有机酸分子适度切断褐藻高分子多糖的糖苷键，实现其部分降解；3)利用有机溶剂进行充分洗涤，排除物料中酸溶液，完成褐藻的有机酸预处理；4)经预处理的褐藻，加入5-8倍体积水进行提取，提取液浓缩，调节PH值至中性后分级醇沉，分别得到水溶性良好的富含甘露糖醛酸片段(富M)褐藻胶、褐藻糖胶和褐藻淀粉；5)经过水提后的有机酸预处理褐藻原料残渣，再按碱消化工艺进行处理，可获得富含古洛糖醛酸片段(富G)的褐藻胶。
2.按照权利要求1所述的从褐藻中提取活性多糖的方法，其特征在于步骤1)中褐藻粉与有机酸溶液或有机-无机混酸溶液的重量比为5/1-1/5。
3.按照权利要求1所述的从褐藻中提取活性多糖的方法，其特征在于所述的褐藻类选自海带属海带，马尾藻属海蒿子、海黍子、羊栖菜、鼠尾藻、匍枝马尾藻、墨角藻属岩藻、墨角藻，鹿角菜属鹿角菜，裙带菜属裙带菜和/或巨藻属巨藻。
4.按权利要求1所述的褐藻中提取活性多糖的方法，其特征在于按质量百分比浓度，所述有机酸溶液选自5% -50%的草酸、10% -99%的甲酸、10% -99%的乙酸或 10% -99%的丙酸水溶液中的一种。
5.按权利要求1所述的从褐藻中提取活性多糖的方法，其特征在于有机-无机混酸溶液中无机酸质量百分比浓度为0. 1%_15%，无机酸选自盐酸、硫酸、硝酸或磷酸中的一种。
6.按权利要求1所述的从褐藻中提取活性多糖的方法，其特征在于用于洗涤残余酸的有机溶剂选自C1-C3的醇或丙酮中的一种。
7.按权利要求1、4或6所述的从褐藻中提取活性多糖的方法，其特征在于有机酸溶液选自甲酸、乙酸、丙酸溶液时，步骤3)中首先采用蒸馏、离心、过滤方法去除大部分酸液， 再选用有机溶剂洗涤除去少量残留的酸。
8.按权利要求1所述的从褐藻中提取活性多糖的方法，其特征在于步骤4)分级醇沉为加乙醇至含醇量20wt%-40wt%，过滤或者离心分离出沉淀，获得富含甘露糖醛酸片段即富M片段的低聚褐藻胶沉淀，加乙醇至含醇量60wt%-70wt%时，过滤或离心分离可获得褐藻糖胶沉淀，加乙醇至含醇量80衬%-85衬％时，过滤或离心分离可获得褐藻淀粉沉淀。
9.按权利要求1或8所述的从褐藻中提取活性多糖的方法，其特征在于富M片段的低聚褐藻胶沉淀加入碳酸钠进行转化为富M片段褐藻酸钠。
全文摘要
本发明涉及一种从褐藻中提取活性多糖的方法，具体步骤为将经洗净、干燥、粉碎后的褐藻类原料置提取容器中，加入有机酸溶液或有机-无机混酸溶液；对搅拌润湿后的物料加热，温度为50-150℃，实现褐藻高分子多糖物质的部分降解；然后利用有机溶剂进行充分洗涤至排除尽物料中酸溶液；加入5-8倍体积水进行提取，提取液浓缩，调节pH值至中性后分级醇沉，分别得到富含甘露糖醛酸片段(富M)的褐藻胶、褐藻糖胶和褐藻淀粉；经水提后的有机酸预处理褐藻原料残渣，按碱消化工艺进行处理，获得富含古洛糖醛酸片段(富G)的褐藻胶。本发明克服了现有褐藻胶生产工艺耗水、污染严重等诸多缺点，具有节能减排，产物得率高，提取溶剂用量少等优点。
文档编号C08B37/04GK102417548SQ201110343580
公开日2012年4月18日 申请日期2011年11月3日 优先权日2011年11月3日
发明者刘志宇, 张劲松, 李明天, 许磊 申请人:沈阳科思高科技有限公司