专利名称：一种具有取向生长结构细胞的材料的制备方法
技术领域：
本发明属于生物材料领域，特别是涉及ー种具有取向生长结构细胞的材料的制备方法。
背景技术：
细胞与材料的相互作用是生物材料及组织工程研究的重要领域之一。大多数哺乳动物的细胞必须与材料粘附后才能进行増殖、迁移和分化。材料表面性质无论是表面拓扑微结构的差异还是化学信号的不同，都对细胞行为有很大的影响(包括从最初的粘附到增埴，甚至分化和最后形成新的组织)，这种现象被称为接触诱导(Contact Guidance)ο大多数正常组织内的细胞不是杂乱无序的，而是具有一定的有序取向结构，例如肌腱细胞、骨细胞、心肌细胞及构成血管的内皮细胞、平滑肌细胞等在一定程度上均为有序结构。这也使得有效调控细胞取向生长在生物材料、仿生学及组织工程等领域具有重要的意义。众所周知，对细胞生长进行结构调控是生物材料由单纯的材料学走向组织工程仿生的关键一歩。通常获得取向生长的细胞往往是在ー个图案化的基底上，利用化学或者物理的模板作用来限制细胞生长(Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 5406; J. AppI. Biomater.Biom. 2008, 6，132)。已报道的传统方法主要是在基底上通过光刻或者电子束刻蚀等技术，首先得到具有一定微结构的模型，通过复型或者在图案化的材料上进行化学修饰差异化不同区域，进而对细胞的生长进行接触诱导。这些方法主要是利用微电子加工等方法得到可精确控制的周期性结构，主要在平面的基底上进行操作，但这些图案化基底的制备过程较为复杂，成本较高，难以得到大面积的制备，从而限制了其应用范围。因此，大批量、低成本地制备能诱导细胞取向生长的基底，是获得长程有序细胞生长的关键。同吋，在曲面上获得长程有序生长的细胞更是ー个难题。摩擦法起始于1911年Mauguin观察到的现象，即用纸按一定方向擦拭玻璃基板，液晶分子长轴按上述方向排列的现象，该技术广泛应用于液晶显示领域(液晶器件手册[M]·北京海洋出版社，1992，254; Mol. Cryst. Liq. Cryst. 1983，94，33)。之后在1991年，Jean C Wittmann等在报道摩擦PFTE诱导小分子在其上取向結晶，该技术在薄膜和界面材料等方面又有了进一步的发展(Naturel991, 352, 414;MacromoIecules2010, 43，7604; Adv. Funct. Mater. 2011, 21，4047.)但是这一技术在微结构调控显得日益重要的生物材料方面还未得到拓展。
发明内容
本发明的目的是提供ー种具有取向生长结构细胞的材料的制备方法；通过在摩擦取向的聚合物的基底上涂覆生物相容性高分子薄膜，经热处理复合形成聚合物/生物相容性高分子ニ元复合膜，之后在该复合膜上进行细胞培养，得到具有取向生长结构细胞的材料；该制备方法能大批量、低成本地制备具有取向生长结构细胞的材料。ー种具有取向生长结构细胞的材料的制备方法，包括以下步骤
I)制备具有摩擦取向的聚合物的基底；2)在具有摩擦取向的聚合物的基底上附着生物相容性高分子薄膜，得到具有聚合物/生物相容性高分子ニ元复合膜的基底；3)在具有聚合物/生物相容性高分子ニ元复合膜的基底上进行细胞培养。进ー步地，所述步骤I)是首先，将聚合物和基底加热到室温至聚合物熔融温度之间；其次，固定基底，对聚合物施加垂直于基底的5(Γ500Ν的向下的压力，并沿水平方向对聚合物施加5 300Ν的推力，使聚合物在基底上水平延展，得到具有摩擦取向的聚合物的基底；其中，所述基底的动摩擦系数为O. 06、. 7。 进ー步地，所述聚合物为聚こ烯、聚丙烯、聚丁烯、聚苯こ烯、聚甲基丙烯酸甲酷、聚偏氟こ烯、聚四氟こ烯、聚酰亚胺、聚对苯ニ甲酸ニこ酷、聚こ烯萘酸酷、聚醚砜或聚碳酸酷。进ー步地，所述基底为玻璃片、石英片或单晶硅片。使用前应保持洁净。进ー步地，所述步骤2)是将步骤I)制得的具有摩擦取向的聚合物的基底浸入生物相容性高分子溶液中，缓慢提拉基底，待生物相容性高分子溶液的溶剂完全挥发后，在生物相容高分子玻璃化转变温度与熔融温度之间对基底进行热处理，得到具有聚合物/生物相容性高分子ニ元复合膜的基底。进ー步地，所述步骤2)是利用旋涂法将生物相容性高分子溶液旋涂到步骤I)制得的具有摩擦取向的聚合物的基底上，旋涂速度为50(Γ5000转/分，待生物相容性高分子溶液的溶剂完全挥发后，在生物相容高分子玻璃化转变温度与熔融温度之间对基底进行热处理，得到具有聚合物/生物相容性高分子ニ元复合膜的基底。具体的热处理温度和时间视生物相容高分子而定。进ー步地，所述生物相容性高分子溶液是将生物相容性高分子与溶剂混合，配制成每100毫升溶剂中含有O. I飞克生物相容性高分子的溶液。通常在室温下进行配制。生物相容性高分子溶液的浓度太稀将无法得到连续的薄膜，而溶液浓度过大则会因溶液粘度太大无法成膜。进ー步地，所述生物相容性高分子为聚己内酷、聚乳酸、聚氨酷、聚こ醇酸、聚己丙酰胺、聚乳酸-羟基こ酸共聚物、胶原、丝蛋白、纤维素、壳聚糖等合成高分子材料或天然高分子材料中的ー种或两种以上混合物。进ー步地，所述溶剂为蒸馏水、こ醇、甲苯、ニ甲苯、ニ氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、丙酮、丁酮、环己酮中的ー种或两种以上混合物。制得的复合膜的厚度通常为5(Tl000nm，优选为200nm，但应了解，它的长、宽、尺
寸可根据需要任意调节。所述步骤3)可采用公知的贴壁细胞的培养方法在具有聚合物/生物相容性高分子ニ元复合膜的基底上进行细胞培养。所述细胞主要包括成纤维细胞、肌细胞、骨细胞、干细胞等贴壁类细胞。在热处理过程中受摩擦取向聚合物分子诱导，生物相容性高分子膜表面本身具有特殊的预取向结构，可诱导粘附在其上的多种细胞进行取向生长，从而获得大面积具有取向结构的细胞。本发明具有以下有益效果
本方法操作简单易行，成本低，可重复、大面积地在平面或曲面基底上制备具有稳定的预取向结构的生物相容高分子薄膜，并通过细胞培养可以获得取向生长的细胞；可以通过控制基底上摩擦区域的面积和范围，在同一基底上获得取向和杂乱的不同细胞分布区域，即同时含有两种(取向和杂乱)图案化的细胞分布，取向的细胞在具有预取向结构的区域生长，杂乱的细胞在没有取向结构的区域分布，图案分辨效果高、对比明显，可以精确调控；本方法适用于目前已有报道的众多细胞的取向诱导生长；本方法为生物材料、仿生学、组织工程等研究領域的进ー步拓展提供了有利的支
持。
图Ia为实施例I制备样品I #的操作示意图；图Ib为实施例IPTFE摩擦后样品的扫描电子显微镜图像；图Ic为实施例IPCL复合后样品的扫描电子显微镜图像；图Id为实施例1PCL/PTFE复合膜样品的原子力显微镜2D图像；图Ie为实施例I制备样品的相图；图If为实施例I制备样品的高度图；图2为用样品I #培养小鼠成纤维细胞3天后的荧光显微镜图像(a取向和杂乱，b杂乱，c取向)；图3a, b, c为用样品I #培养大鼠骨髓间充质干细胞3天后的扫描电子显微镜图像；图3d，e, f为用样品I #培养大鼠骨髓间充质干细胞3天后的荧光显微镜图像。图4a, b为实施例4用样品2 #培养中国仓鼠卵巢成纤维细胞7天后的突光显微镜图像。
具体实施例方式以下结合附图和具体实施方式
对本发明作进ー步说明，但本发明的保护范围不仅限于下述实施例。实施例Iー种具有取向生长结构细胞的材料的制备方法，包括以下步骤I)将清洁的玻璃基底(平面或曲面)和聚四氟こ烯棒放在加热到280°C的热台上，保持10分钟，玻璃基底的动摩擦系数为O. 06、. 7 ；2)固定玻璃基底，对聚四氟こ烯棒施加垂直于基底向下的5(Γ500Ν的压力，并沿水平方向施加5 300Ν的推力，使得聚四氟こ烯棒摩擦玻璃，然后常温下冷却后，沿摩擦方向将玻璃基底在PCL溶液(lw/v%)中缓慢提拉，溶剂自然挥发干后，于55°C的热台上继续加热2小吋，既可以得到复合于PTFE基质上取向的PCL薄膜(平面样品编号1#，曲面样品编号2#)。图Ia为实施例I制备样品I #的操作示意图；图Ib为实施例IPTFE摩擦后样品的扫描电子显微镜图像；图Ic为实施例IPCL复合后样品的扫描电子显微镜图像；图Id为实施例1PCL/PTFE复合膜样品的原子力显微镜2D图像；图Ie为实施例I制备样品的相图；图If为实施例I制备样品的高度图；由图可见，采用本发明的制备方法得到的ニ元复合薄膜具有良好的取向性。图中，A为聚合物棒，B为基底，C为热台，D为生物相容性高分子溶液。3)将制备的聚合物/生物相容性高分子ニ元复合膜基底，即样品1#，用紫外灯照射Ih (距紫外灯50cm)灭菌；4)将灭菌后的基底浸泡在37 °C的PBS中24h，然后用新鲜培养液(10%FBS+H-DMEM+1%双抗)置换PBS，并培养小鼠成纤维细胞(L929) 3天，每天更换培养液。在附生结晶的PCL薄膜上可以得到沿摩擦方向取向生长的L929细胞。图2为用样品I #培养小鼠成纤维细胞3天后的荧光显微镜图像(a取向和杂乱，b杂乱，c取向);由图可见，采用本发明的制备方法得到的培养L929细胞在该基底上高度取向井具有良好的粘附和増殖性能，细胞活力保持较好。 实施例2ー种具有取向生长结构细胞的材料的制备方法，步骤同实施例1，变化在于，在样品1#上培养生长大鼠骨髓间充质细胞(BMMSCs)。图3a, b, c为用样品I #培养大鼠骨髓间充质干细胞3天后的扫描电子显微镜图像；图3d，e, f为用样品I #培养大鼠骨髄间充质干细胞3天后的荧光显微镜图像；由图可见，采用本发明的制备方法得到的材料上培养的BMMSCs细胞取向良好，细胞的粘附和增殖性能保持较好。实施例3ー种具有取向生长结构细胞的材料的制备方法，步骤同实施例1，变化在于，在样品2#上培养生长中国仓鼠卵巢成纤维细胞(CHO) 7天。图4a，b为用样品2 #培养中国仓鼠卵巢成纤维细胞7天后的荧光显微镜图像。实施例4ー种具有取向生长结构细胞的材料的制备方法，包括以下步骤I)制备具有摩擦取向的聚合物的基底；2)在具有摩擦取向的聚合物的基底上附着生物相容性高分子薄膜，得到具有聚合物/生物相容性高分子ニ元复合膜的基底；3)在具有聚合物/生物相容性高分子ニ元复合膜的基底上进行细胞培养。实施例5ー种具有取向生长结构细胞的材料的制备方法，包括以下步骤I)制备具有摩擦取向的聚合物的基底首先，将聚合物和基底加热到室温至聚合物熔融温度之间；其次，固定基底，对聚合物施加垂直于基底的50N的向下的压力，并沿水平方向对聚合物施加5N的推力，使聚合物在基底上水平延展，得到具有摩擦取向的聚合物的基底；其中，所述基底的动摩擦系数为
O.06 ；2)将步骤I)制得的具有摩擦取向的聚合物的基底浸入生物相容性高分子溶液中，缓慢提拉基底，待生物相容性高分子溶液的溶剂完全挥发后，在生物相容高分子玻璃化转变温度与熔融温度之间对基底进行热处理，得到具有聚合物/生物相容性高分子ニ元复合膜的基底；3)在具有聚合物/生物相容性高分子ニ元复合膜的基底上进行细胞培养。所述聚合物为聚こ烯。所述基底为石英片。所述生物相容性高分子溶液是将生物相容性高分子与溶剂混合，配制成每100毫升溶剂中含有O. I克生物相容性高分子的溶液。所述生物相容性高分子为聚己内酷。所述溶剂为蒸馏水、こ醇、甲苯的混合物。实施例6同实施例5。区别在于，所述聚合物为聚甲基丙烯酸甲酷。所述基底为单晶硅片。所述生物相容性高分子为聚乳酸、聚氨酯混合物。所述溶剂为ニ氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃的混合物。实施例7同实施例5。区别在于，所述聚合物为聚偏氟こ烯。所述基底为单晶硅片。所述生 物相容性高分子为聚こ醇酸、聚己丙酰胺、聚乳酸-羟基こ酸共聚物混合物。所述溶剂为丙酮、丁酮的混合物。实施例8ー种具有取向生长结构细胞的材料的制备方法，包括以下步骤I)制备具有摩擦取向的聚合物的基底首先，将聚合物和基底加热到室温至聚合物熔融温度之间；其次，固定基底，对聚合物施加垂直于基底的500N的向下的压カ，并沿水平方向对聚合物施加300N的推力，使聚合物在基底上水平延展，得到具有摩擦取向的聚合物的基底；其中，所述基底的动摩擦系数为 0.7 ;2)利用旋涂法将生物相容性高分子溶液旋涂到步骤I)制得的具有摩擦取向的聚合物的基底上，旋涂速度为5000转/分，待生物相容性高分子溶液的溶剂完全挥发后，在生物相容高分子玻璃化转变温度与熔融温度之间对基底进行热处理，得到具有聚合物/生物相容性高分子ニ元复合膜的基底；3)在具有聚合物/生物相容性高分子ニ元复合膜的基底上进行细胞培养。所述聚合物为聚酰亚胺。所述基底为玻璃片。所述生物相容性高分子溶液是将生物相容性高分子与溶剂混合，配制成每100毫升溶剂中含有5克生物相容性高分子的溶液。所述生物相容性高分子为胶原、丝蛋白混合物。实施例9同实施例8。区别在于，所述聚合物为聚对苯ニ甲酸ニこ酷。所述生物相容性高分子为纤维素。所述溶剂为环己酮。实施例10同实施例8。区别在于，所述聚合物为聚こ烯萘酸酷。所述生物相容性高分子为壳聚糖。所述溶剂为环己酮。实施例11同实施例8。区别在于，所述聚合物为聚醚砜。实施例12同实施例8。区别在于，所述聚合物为聚碳酸酷。显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变 动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
权利要求
1.一种具有取向生长结构细胞的材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 1)制备具有摩擦取向的聚合物的基底； 2)在具有摩擦取向的聚合物的基底上附着生物相容性高分子薄膜，得到具有聚合物/生物相容性高分子二元复合膜的基底； 3)在具有聚合物/生物相容性高分子二元复合膜的基底上进行细胞培养。
2.根据权利要求I所述的具有取向生长结构细胞的材料的制备方法，其特征在于，所述步骤I)是首先，将聚合物和基底加热到室温至聚合物熔融温度之间；其次，固定基底，对聚合物施加垂直于基底的5(T500N的向下的压力，并沿水平方向对聚合物施加5 300N的推力，使聚合物在基底上水平延展，得到具有摩擦取向的聚合物的基底；其中，所述基底的动摩擦系数为0. 06 0.7。
3.根据权利要求I或2所述的具有取向生长结构细胞的材料的制备方法，其特征在于， 所述聚合物为聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯、聚酰亚胺、聚对苯二甲酸二乙酯、聚乙烯萘酸酯、聚醚砜或聚碳酸酯。
4.根据权利要求I或2所述的具有取向生长结构细胞的材料的制备方法，其特征在于，所述基底为玻璃片、石英片或单晶硅片。
5.根据权利要求I所述的具有取向生长结构细胞的材料的制备方法，其特征在于，所述步骤2)是将步骤I)制得的具有摩擦取向的聚合物的基底浸入生物相容性高分子溶液中，缓慢提拉基底，待生物相容性高分子溶液的溶剂完全挥发后，在生物相容高分子玻璃化转变温度与熔融温度之间对基底进行热处理，得到具有聚合物/生物相容性高分子二元复合膜的基底。
6.根据权利要求I所述的具有取向生长结构细胞的材料的制备方法，其特征在于，所述步骤2)是利用旋涂法将生物相容性高分子溶液旋涂到步骤I)制得的具有摩擦取向的聚合物的基底上，旋涂速度为50(T5000转/分，待生物相容性高分子溶液的溶剂完全挥发后，在生物相容高分子玻璃化转变温度与熔融温度之间对基底进行热处理，得到具有聚合物/生物相容性高分子二元复合膜的基底。
7.根据权利要求I所述的具有取向生长结构细胞的材料的制备方法，其特征在于，所述生物相容性高分子溶液是将生物相容性高分子与溶剂混合，配制成每100毫升溶剂中含有0. rs克生物相容性高分子的溶液。
8.根据权利要求I或7所述的具有取向生长结构细胞的材料的制备方法，其特征在于，所述生物相容性高分子为聚己内酯、聚乳酸、聚氨酯、聚乙醇酸、聚己丙酰胺、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、胶原、丝蛋白、纤维素、壳聚糖中的一种或两种以上混合物。
9.根据权利要求7所述的具有取向生长结构细胞的材料的制备方法，其特征在于，所述溶剂为蒸馏水、乙醇、甲苯、二甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、丙酮、丁酮、环己酮中的一种或两种以上混合物。
10.根据权利要求I所述的具有取向生长结构细胞的材料的制备方法，其特征在于，所述细胞为成纤维细胞、肌细胞、骨细胞或干细胞。
全文摘要
本发明公开了一种具有取向生长结构细胞的材料的制备方法；通过在摩擦取向的聚合物的基底上涂覆生物相容性高分子薄膜，经热处理复合形成聚合物/生物相容性高分子二元复合膜，之后在该复合膜上进行细胞培养，得到具有取向生长结构细胞的材料；该制备方法能大批量、低成本地制备具有取向生长结构细胞的材料。
文档编号C08J7/04GK102850567SQ201210357110
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月21日 优先权日2012年9月21日
发明者牛忠伟, 王艳明, 蒋士冬 申请人:中国科学院理化技术研究所