专利名称：球等鞭金藻胞外多糖的分离纯化工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于海洋生化工程领域，具体涉及一种球等鞭金藻胞外多糖的分离纯化工艺。
背景技术：
球等鞭金藻(J1SocAzy1Si1S富含多不饱和脂肪酸,蛋白质和多糖,营养丰富，是水产养殖业中常用的饵料微藻。以往研究主要集中在多不饱和脂肪酸上。近年来，随着微藻多糖研究的深入，对球等鞭金藻多糖的研究日益增多。然而，相对于其它微藻多糖的研究而言，球等鞭金藻多糖的研究尚处于起步阶段，其多糖的分离纯化、结构鉴定以及生理活性等还未见报道。其中，对其胞外多糖的研究则更少。海洋微藻在生长过程中会不断向外分泌粘性物质,称为胞外产物(Extracellular
products, ECP)ο 胞外多糖(Extracellular polysaccharides, ECPS)是胞外产物的主要组成成分，在海洋生态系统的微食物链及微生态系统中发挥着重要作用。研究表明，微藻胞外多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗辐射和免疫调节等生理活性，并且，由于海洋微藻的生长条件和环境特点决定了其可能具有一些有别于陆生植物多糖的结构和功能，此类多糖在医药和医学领域中的应用潜力越来越引起人们对其的研究兴趣。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的工艺更为合理的球等鞭金藻胞外多糖的分离纯化工艺。本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种球等鞭金藻胞外多糖的分离纯化工艺，其特点是，其步骤如下
(I)选取培养至指数生长阶段的球等鞭金藻培养物，5000 rpm/ min下离心15 min,取上清液经O. 22 Mffl微孔滤膜过滤后，45°C下减压浓缩；冷冻干燥后，获得白色粉末状的胞外物质；
(2 )取胞外物质，加入蒸馏水中，蒸馏水与胞外物质的质量比为15:1，混合均匀后，用O. 5 M NaOH调节pH至9.0，在70°C水浴锅中提取240 min ;提取结束后，5000 rpm/ min下离心5 min，取上清液加入质量浓度3%的三氯乙酸，4°C下静置4 h后，5000 rpm/ min下离心5 min,弃去沉淀；上清液加入3倍体积无水乙醇，4°C下静置24 h, 5000 rpm/ min下离心5 min，收集白色乳状沉淀；沉淀依次经丙酮、无水乙醇洗脱后，40°C下烘干，粉碎后，得白色粉末状物质即为球等鞭金藻胞外粗多糖(ECPS)；
(3)采用DEAE-52离子交换柱层析对球等鞭金藻胞外粗多糖进行分离，获得中性多糖(ECPS I )和酸性多糖(ECPS II)组分；
(4)采用SephadexG-100凝胶柱层析进一步分离纯化中性多糖ECPS I和酸性多糖ECPS II组分。其中，中性多糖组分经分离，得到3个组分，分别记为ECPS I -A、ECPS I -B和ECPS I -C ;酸性多糖组分经分离，得到5个组分，分别记为ECPS II -A、ECPS II -B、ECPS II -C、ECPS II -D 和 ECPS II -E ；
(5)上述8个多糖组分，除ECPS II -A组分外，其余多糖组分量很少，故此，仅富集ECPS II -A组分。多次富集，经减压浓缩后，将其加载于S^hadex G-IOO凝胶柱层析。洗脱后，获得单一多糖组分，经乙醇沉淀和冷冻干燥后，得到白色粉末状固体，为胞外纯多糖，记为 ECPS III。本发明所述的球等鞭金藻胞外多糖的分离纯化工艺，步骤(3)、(4)和(5)进一步优选的方案如下
(3)球等鞭金藻胞外粗多糖溶解于蒸馏水后，加载于DEAE-52离子交换层析柱，依次用蒸懼水和I. O mol/L NaOH进行洗脱,每管收集3 1^,流速为1.5 mL/min,以硫酸-蒽酮法检测多糖，直至检测不出多糖组分，换用下一洗脱液。多糖组分合并收集后，减压浓缩(用NaOH进行洗脱所收集的馏分先经透析后，再减压浓缩)，分别获得中性多糖(ECPS I )和酸性多糖(ECPS II)组分； (4)采用SephadexG-100凝胶柱层析进一步分离纯化中性多糖ECPS I和酸性多糖ECPS II组分，以蒸馏水为洗脱液，每管收集3 mL，流速为1.5 mL/min，馏分采用硫酸-蒽酮法检测。中性多糖组分ECPS I经Sephadex G-100凝胶柱层析分离后，获得3个组分，分别记为 ECPS I -A,ECPS I -B 和 ECPS I -C ;ECPS II 经 S印hadex G-100 凝胶柱层析进一步分离后，获得 5 个组分，分别记为 ECPS II -A,ECPS II -B,ECPS II -C,ECPS II -D 和 ECPS II -E ；
(5)上述8个多糖组分，除ECPSII -A外，其它组分量很少，因此，仅富集ECPS II -A组分。多次富集，经减压浓缩后，将其加载于Sephadex G-100凝胶柱层析，用蒸馏水进行洗脱，每管收集3 !^，流速为1.5 mL/min，馏分采用硫酸-蒽酮法检测。洗脱后，获得单一多糖组分，经乙醇沉淀和冷冻干燥后，得到白色粉末状固体，为胞外纯多糖，记为ECPS III。本发明方法建立了球等鞭金藻胞外多糖的分离纯化工艺，该工艺简单合理，而且具有稳定的重现性和良好的可操作性。该工艺填补了国内外球等鞭金藻胞外多糖分离纯化研究领域的空白，为后续研究此多糖的生理活性奠定了良好的实验基础；并且，该微藻多糖与其它多糖类物质一样，可以在医药和医学领域中得到应用。
图I球等鞭金藻胞外多糖分离纯化工艺流程 图2为球等鞭金藻胞外粗多糖经DEAE-52离子交换柱层析的洗脱曲线；
图3为球等鞭金藻胞外中性多糖经Sephadex G-100凝胶柱层析的洗脱曲线；
图4为球等鞭金藻胞外酸性多糖经Sephadex G-100凝胶柱层析的洗脱曲线；
图5为球等鞭金藻胞外多糖组分ECPS II -A经Sephadex G-100凝胶柱层析的洗脱曲线。
具体实施例方式以下参照附图，进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。实施例1，参照图I，一种球等鞭金藻胞外多糖的分离纯化工艺，其步骤如下
(I)选取培养至指数生长阶段的球等鞭金藻培养物，5000 rpm/ min下离心15 min,取上清液经O. 22 Mffl微孔滤膜过滤后，45°C下减压浓缩；冷冻干燥后，获得白色粉末状的胞外物质；
(2 )取胞外物质，加入蒸馏水中，蒸馏水与胞外物质的质量比为15:1，混合均匀后，用O. 5 M NaOH调节pH至9.0，在70°C水浴锅中提取240 min ;提取结束后，5000 rpm/ min下离心5 min，取上清液加入质量浓度3%的三氯乙酸，4°C下静置4 h后，5000 rpm/ min下离心5 min,弃去沉淀；上清液加入3倍体积无水乙醇，4°C下静置24 h, 5000 rpm/ min下离心5 min，收集白色乳状沉淀；沉淀依次经丙酮、无水乙醇洗脱后，40°C下烘干，粉碎后，得白色粉末状物质即为球等鞭金藻胞外粗多糖；
(3)采用DEAE-52离子交换柱层析对球等鞭金藻胞外粗多糖进行分离，获得中性多糖ECPS I和酸性多糖ECPS II组分；
(4)采用SephadexG-100凝胶柱层析进一步分离纯化中性多糖和酸性多糖组分；其中，中性多糖组分经分离，得到3个组分，分别记为ECPS I -A,ECPS I -B和ECPS I -C ;酸 性多糖组分经分离，得到5个组分，分别记为ECPS II -A,ECPS II -B,ECPS II -C,ECPS II -D和 ECPS II -E ；
(5)富集上述8个多糖组分中多糖组分量最大的ECPSII -A ;经多次富集，经减压浓缩后，将其加载于Sephadex G-100凝胶柱层析；洗脱后，获得单一多糖组分，经乙醇沉淀和冷冻干燥后，得到白色粉末状固体，为胞外纯多糖，记为ECPS III。实施例2，参照图I，一种球等鞭金藻胞外多糖的分离纯化工艺，其步骤如下
(I)选取培养至指数生长阶段的球等鞭金藻培养物，5000 rpm/ min下离心15 min,取上清液经O. 22 Mffl微孔滤膜过滤后，45°C下减压浓缩；冷冻干燥后，获得白色粉末状的胞外物质；
(2 )取胞外物质，加入蒸馏水中，蒸馏水与胞外物质的质量比为15:1，混合均匀后，用
O.5 M NaOH调节pH至9.0，在70°C水浴锅中提取240 min ;提取结束后，5000 rpm/ min下离心5 min，取上清液加入质量浓度3%的三氯乙酸，4°C下静置4 h后，5000 rpm/ min下离心5 min,弃去沉淀；上清液加入3倍体积无水乙醇，4°C下静置24 h, 5000 rpm/ min下离心5 min，收集白色乳状沉淀；沉淀依次经丙酮、无水乙醇洗脱后，40°C下烘干，粉碎后，得白色粉末状物质即为球等鞭金藻胞外粗多糖；
(3)球等鞭金藻胞外粗多糖溶解后，加载于DEAE-52离子交换层析柱，依次用蒸馏水和1.0 mol/L NaOH进行洗脱,每管收集3 mL,流速为1.5 mL/min,以硫酸-蒽酮法检测多糖，直至检测不出多糖组分，换用下一洗脱液；多糖组分合并收集后，用NaOH进行洗脱所收集的馏分先经透析后，再减压浓缩，分别获得中性多糖ECPS I和酸性多糖ECPS II组分；
(4)采用SephadexG-100凝胶柱层析进一步分离纯化中性多糖和酸性多糖组分，以蒸馏水为洗脱液，每管收集3 mL，流速为1.5 mL/min，馏分采用硫酸-蒽酮法检测；中性多糖组分ECPS I经S印hadex G-100凝胶柱层析分离后，获得3个组分，分别记为ECPS I -A、ECPS I -B和ECPS I -C ;ECPS II经S印hadex G-100凝胶柱层析进一步分离后，获得5个组分，分别记为 ECPS II -A, ECPS II -B、ECPS II -C、ECPS II -D 和 ECPS II -E ；
(5)富集上述8个多糖组分中多糖组分量最大的ECPSII -A，经多次富集，经减压浓缩后，将其加载于Sephadex G-100凝胶柱层析，用蒸馏水进行洗脱，每管收集3 !^，流速为1.5mL/min,馏分采用硫酸_蒽酮法检测；洗脱后，获得单一多糖组分，经乙醇沉淀和冷冻干燥后，得到白色粉末状固体，为胞外纯多糖，记为ECPS III。实施例3，球等鞭金藻胞外多糖的分离纯化工艺实验一，其步骤如下
称取实施例I步骤(2)制取的球等鞭金藻胞外粗多糖O. 5 g，溶解于100 mL蒸馏水中后，加载于DEAE-52离子交换柱层析，先用蒸馏水洗脱，每管收集3 1^，流速为1.5 mL/min,以硫酸-蒽酮法检测多糖，直至检测不出多糖组分。多糖组分合并收集，减压浓缩至10 mL,得到中性多糖组分(ECPS I)。随后，用1.0 mol/L NaOH继续洗脱，每管收集3 mL，流速为
1.5mL/min，以硫酸-蒽酮法检测多糖，直至检测不出多糖组分。多糖组分合并收集，透析24 h后,减压浓缩至10 mL,得到酸性多糖组分(ECPS II)。采用Sephadex G-100柱层析进一步纯化中性多糖ECPS I和酸性多糖ECPS II组分，用蒸馏水进行洗脱，每管收集3 mL,流速为I. 5 mL/min,懼分采用硫酸-蒽酮法检测。中性多糖组分ECPS I经Sephadex G-100凝胶柱层析进一步分离后，获得3个组分，分别记为ECPS I -A, ECPS I -B和ECPS I -C;ECPS II经S印hadex G-100凝胶柱层析进一步分离后，获得5个组分，依次记为ECPS II -A、ECPS II -B、ECPS II -C、ECPS II -D 和 ECPS II -E (上述 8 个多糖组分，除 ECPS II -A 组分 夕卜，其它组分量很少)。将ECPS II -A加载于Sephadex G-100凝胶柱层析，用蒸馏水进行洗脱，每管收集3 mL，流速为1.5 mL/min，馏分采用硫酸-蒽酮法检测。洗脱后，获得单一多糖组分，经乙醇沉淀和冷冻干燥后，得到O. 190 g胞外纯多糖。本实施例中，球等鞭金藻胞外粗多糖经DEAE-52离子交换柱层析的洗脱曲线参见图2 ;球等鞭金藻胞外中性多糖经Sephadex G-100凝胶柱层析的洗脱曲线参见图3 ;球等鞭金藻胞外酸性多糖经Sephadex G-100凝胶柱层析的洗脱曲线参见图4 ;球等鞭金藻胞外多糖组分ECPS II -A经Sephadex G-100凝胶柱层析的洗脱曲线参见图5。本实施例制得的胞外纯多糖ECPS III的检测方法如下
胞外纯多糖ECPS III重新溶解于蒸馏水中，制备成多糖溶液。依次采用下列方法，鉴定并检测其纯度。①经蒽酮-硫酸显色反应，ECPS III溶液呈现蓝绿色，表明ECPS III为多糖类物质；经碘溶液实验和茚三酮反应检测，溶液均未出现颜色反应，表明，ECPS III不含淀粉，也不含游离(或结合)蛋白质。②由于多糖在分子大小上表现为连续变化，所以它的纯化只代表某一多糖的相似链长的平均分布，所以，可以用凝胶柱层析来检测其纯度。将此多糖溶液加载于SephadexG-100凝胶柱层析，蒸馏水洗脱，流速为I. 5 mL/min，每管收集3 mL，馏分采用硫酸-蒽酮法检测。经洗脱，得到单一的峰形对称的洗脱峰。结果表明，ECPS III为均一多糖。实施例4，球等鞭金藻胞外多糖的分离纯化工艺实验二，其步骤如下
称取实施例I步骤(2)制取的球等鞭金藻胞外粗多糖O. 4 g，溶解于80 mL蒸馏水中后，加载于DEAE-52离子交换柱层析，先用蒸馏水洗脱，每管收集3 1^，流速为1.5 mL/min,以硫酸-蒽酮法检测多糖，直至检测不出多糖组分。多糖组分合并收集，减压浓缩至8 mL,得到中性多糖组分(ECPS I)。随后，用1.0 mol/L NaOH继续洗脱，每管收集3 mL，流速为
1.5mL/min，以硫酸-蒽酮法检测多糖，直至检测不出多糖组分。多糖组分合并收集，透析24 h后,减压浓缩至8 mL,得到酸性多糖组分(ECPS II)。采用Sephadex G-100柱层析进一步纯化中性多糖ECPS I和酸性多糖ECPS II组分，用蒸馏水进行洗脱，每管收集3 mL,流速为I. 5 mL/min,懼分采用硫酸-蒽酮法检测。中性多糖组分ECPS I经Sephadex G-100凝胶柱层析进一步分离后，获得3个组分，分别记为ECPS I -A, ECPS I -B和ECPS I -C;ECPS II经S印hadex G-IOO凝胶柱层析进一步分离后，获得5个组分，依次记为ECPS II -A、ECPS II -B,ECPS II -C,ECPS II -D 和 ECPS II -E。将 ECPS II -A 组分加载于 S印hadex G-100凝胶柱层析，用蒸馏水进行洗脱，每管收集3 mL，流速为1.5 mL/min，馏分采用硫酸-蒽酮法检测。洗脱后，获得单一多糖组分，经乙醇沉淀和冷冻干燥后，得到O. 150 g胞外纯多糖。实施例5，球等鞭金藻胞外多糖的分离纯化工艺实验三，其步骤如下
称取实施例I步骤(2)制取的球等鞭金藻胞外粗多糖O. 3 g，溶解于60 mL蒸馏水中后，加载于DEAE-52离子交换柱层析，先用蒸馏水洗脱，每管收集3 1^，流速为1.5 mL/min,以硫酸-蒽酮法检测多糖，直至检测不出多糖组分。多糖组分合并收集，减压浓缩至6 mL,得到中性多糖组分(ECPS I)。随后，用1.0 mol/L NaOH继续洗脱，每管收集3 mL，流速为
1.5mL/min，以硫酸-蒽酮法检测多糖，直至检测不出多糖组分。多糖组分合并收集，透析24 h后,减压浓缩至6 mL,得到酸性多糖组分(ECPS II)。采用Sephadex G-100柱层析进一步纯化中性多糖ECPS I和酸性多糖ECPS II组分，用蒸馏水进行洗脱，每管收集3 mL,流 速为I. 5 mL/min,懼分采用硫酸-蒽酮法检测。中性多糖组分ECPS I经Sephadex G-100凝胶柱层析进一步分离后，获得3个组分，分别记为ECPS I -A, ECPS I -B和ECPS I -C;ECPS II经S印hadex G-100凝胶柱层析进一步分离后，获得5个组分，依次记为ECPS II -A、ECPS II -B,ECPS II -C,ECPS II -D 和 ECPS II -E。将 ECPS II -A 组分加载于 S印hadex G-100凝胶柱层析，用蒸馏水进行洗脱，每管收集3 mL，流速为1.5 mL/min，馏分采用硫酸-蒽酮法检测。洗脱后，获得单一多糖组分，经乙醇沉淀和冷冻干燥后，得到O. 108 g胞外纯多糖。
权利要求
1.一种球等鞭金藻胞外多糖的分离纯化工艺，其特征在于，其步骤如下 (1)选取培养至指数生长阶段的球等鞭金藻培养物，5000rpm/ min下离心15 min,取上清液经O. 22 Mffl微孔滤膜过滤后，45°C下减压浓缩；冷冻干燥后，获得白色粉末状的胞外物质； (2)取胞外物质，加入蒸馏水中，蒸馏水与胞外物质的质量比为15:1，混合均匀后，用O.5 M NaOH调节pH至9.0，在70°C水浴锅中提取240 min ;提取结束后，5000 rpm/ min下离心5 min，取上清液加入质量浓度3%的三氯こ酸，4°C下静置4 h后，5000 rpm/ min下离心5 min,弃去沉淀；上清液加入3倍体积无水こ醇，4°C下静置24 h, 5000 rpm/ min下离心5 min，收集白色乳状沉淀；沉淀依次经丙酮、无水こ醇洗脱后，40°C下烘干，粉碎后，得白色粉末状物质即为球等鞭金藻胞外粗多糖ECPS ； (3)采用DEAE-52离子交換柱层析对球等鞭金藻胞外粗多糖进行分离，获得中性多糖ECPS I和酸性多糖ECPS II组分； (4)采用SephadexG-100凝胶柱层析进ー步分离纯化中性多糖和酸性多糖组分；其中，中性多糖组分经分离，得到3个组分，分别记为ECPS I -A,ECPS I -B和ECPS I -C ;酸性多糖组分经分离，得到5个组分，分别记为ECPS II -A,ECPS II -B,ECPS II -C,ECPS II -D和 ECPS II -E ； (5)富集上述8个多糖组分中多糖组分量最大的ECPSII -A ;经多次富集，经减压浓缩后，将其加载于Sephadex G-100凝胶柱层析；洗脱后，获得单一多糖组分，经こ醇沉淀和冷冻干燥后，得到白色粉末状固体，为胞外纯多糖，记为ECPS III。
2.根据权利要求I所述的球等鞭金藻胞外多糖的分离纯化工艺，其特征在于，所述的步骤(3)、(4)和(5)的具体操作如下 (3)球等鞭金藻胞外粗多糖溶解后，加载于DEAE-52离子交换层析柱，依次用蒸馏水和1.0 mol/L NaOH进行洗脱,姆管收集3 mL,流速为1.5 mL/min,以硫酸-蒽酮法检测多糖，直至检测不出多糖组分，换用下一洗脱液；多糖组分合并收集后，用NaOH进行洗脱所收集的馏分先经透析后，再减压浓缩，分别获得中性多糖ECPS I和酸性多糖ECPS II组分； (4)采用SephadexG-100凝胶柱层析进ー步分离纯化中性多糖和酸性多糖组分，以蒸馏水为洗脱液，每管收集3 mL，流速为1.5 mL/min，馏分采用硫酸-蒽酮法检测；中性多糖组分ECPS I经S^hadex G-100凝胶柱层析分离后，获得3个组分，分别记为ECPS I -A、ECPS I -B和ECPS I -C ；ECPS II经S^hadex G-100凝胶柱层析进ー步分离后，获得5个组分，分别记为 ECPS II -A, ECPS II -B、ECPS II -C、ECPS II -D 和 ECPS II -E ； (5)富集上述8个多糖组分中多糖组分量最大的ECPSII -A，经多次富集，经减压浓缩后，将其加载于Sephadex G-100凝胶柱层析，用蒸馏水进行洗脱，每管收集3 !11し流速为1.5mL/min,馏分采用硫酸_蒽酮法检测；洗脱后，获得单一多糖组分，经こ醇沉淀和冷冻干燥后，得到白色粉末状固体，为胞外纯多糖，记为ECPS III。
全文摘要
一种球等鞭金藻胞外多糖的分离纯化工艺，它以球等鞭金藻培养液为原料制得球等鞭金藻胞外粗多糖；采用离子交换柱层析对球等鞭金藻胞外粗多糖ECPS进行分离，获得中性多糖和酸性多糖组分；将中性多糖和酸性多糖组分加载于凝胶柱层析，获得8个组分，除ECPSⅡ-A组分外，其余多糖组分量较少；采用凝胶柱层析纯化ECPSⅡ-A组分，获得单一多糖组分。经乙醇沉淀和冷冻干燥，制备到胞外纯多糖ECPSⅢ。本发明方法建立了球等鞭金藻胞外多糖的分离纯化工艺，该工艺简单合理，而且具有稳定的重现性和良好的可操作性。为后续研究此多糖的生理活性奠定了良好的实验基础；并且该微藻多糖与其它多糖类物质一样，可以在医药和医学领域中得到应用。
文档编号C08B37/00GK102838684SQ20121036846
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者孙颖颖 申请人:淮海工学院