专利名称：一种硒化聚甘露糖醛酸制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于硒化多糖技术领域，具体涉及一种硒化聚甘露糖醛酸制备方法及其应用。
背景技术：
褐藻胶是一种水溶性酸性多糖，主要从巨藻、马尾藻、海带等褐藻的细胞壁中提取得到，具有独特的结构和生物活性。其结构上由a-1，4-L-古罗糖醒酸(a-1，4-L-guluronic acid,简写为G)和0 _1，4-D-甘露糖醒酸(3-1，4-D-mannuronicacid,简写为M)通过1_4糖苷键连接而成的直链阴离子多糖。整个分子由三种片段构成聚甘露糖醒酸片段(Poly-mannuronate, PM)、聚古罗糖醒酸片段(Poly-guluronate, PG)和聚甘露糖醒酸-古罗糖醒酸杂合段(PMG block)。因此,通过已有的酸解方法可以分离出单一的聚甘露糖醛酸。聚甘露糖醛酸结构特殊是C5上连有羧基的酸性化合，且结构上不含硫，对其进行硒化存在一定的困难，因此采用先磺化再硒化的方法对其进行硒化。硒元素是生命活动的必须元素，其存在形式有无机硒和有机硒两种，常见的无机硒有亚硒酸钠和硒酸钠，有机硒主要是硒蛋白和硒多糖。硒能构成若干氧化酶的活性中心，可增强机体的抗氧化能力和对相关疾病的抵抗能力。这说明了硒与人体健康的直接关系。无机硒具有蓄积性毒性和致突变作用，使用时剂量难以控制，而有机硒毒性低，副作用小，不但能够更好地发挥硒的作用，而且在激发免疫反应上比无机硒显著，因此，将无机硒与多糖有机结合使之转化为有机硒化合物硒多糖，将会使硒和多糖的生理和药理功能得到优化。目前有多糖对阿尔兹海默症(AD)的作用，但尚未见硒多糖对AD作用的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术之缺陷，提供一种硒化聚甘露糖醛酸制备方法及其应用。本发明提供一种硒化聚甘露糖醛酸的制备方法，其包括如下步骤制备磺化聚甘露糖醛酸将聚甘露糖醛酸悬浮于无水有机溶剂中，在搅拌条件下加入无水有机溶剂溶解的三氧化硫_吡啶复合物，在20 100°C恒温度下反应I 10小时，加入2 4倍体积的95%的乙醇，离心分离反应产物，再用95%的乙醇洗涤，加水溶解，用碱调节PH至中性，透析，过滤，冷冻干燥，得磺化聚甘露糖醛酸；制备硒化聚甘露糖醛酸按质量比为I :0. I 10将所述磺化聚甘露糖醛酸与亚硒酸盐在酸性溶液中、Ba2+的催化下20 100°C恒温度下反应2 20小时，磺化聚甘露糖醛酸与氯化钡摩尔比为I :1 100，加入硫酸盐以去除Ba2+，离心取上清液，用碱调节pH至中性，再用截留分子量1000的透析袋透析，至抗坏血酸检测透析袋内液不变红为止，过滤，冷冻干燥，获得所述硒化聚甘露糖醛酸。
以及，提供上述硒化聚甘露糖醛酸的制备方法所制备的硒化聚甘露糖醛酸在阿尔茨海默症预防和治疗的药物以及保健品中的应用。本发明的硒化聚甘露糖醛酸的制备方法，采用先磺化再硒化的制备方法，具有成本低，产率高的优势。而且通过透析法有效除去过量的亚硒酸根，同时也可以透析除去其他小分子无机化合物和低聚糖。同时，该制备方法所制备的硒化聚甘露糖醛酸具有预防和治疗阿尔茨海默症的作用。
图I是本发明实施例的聚甘露糖醛酸(a)、磺化聚甘露糖醛酸(b)和硒化聚甘露糖醛酸(C)的红外光谱图；图2是本发明Se-PM和Na2Se03、磺化聚甘露糖醛酸、PM、不同聚合度的寡糖混合物(MOM)对H2O2损伤的N2a-APP695-sw细胞保护后的细胞存活率关系图； 图3是硒化聚甘露糖醛酸、硒化卡拉胶和Na2SeO3对N2a_APP695_sw细胞中BACEl和APP蛋白表达的影响Western blot检测结果原图，I是对照，2是Se_PM，3是Se-Carr，4 是 Na2SeO3 ；图4是硒化聚甘露糖醛酸、硒化卡拉胶和Na2SeO3对N2a_APP695_sw细胞中BACEl蛋白表达的影响Quantity one软件对BACEl蛋白条带进行光密度分析的结果，I是对照，
2是 Se-PM，3 是 Se-Carr, 4 是 Na2SeO3 ；图5是硒化聚甘露糖醛酸、硒化卡拉胶和Na2SeO3对N2a_APP695_sw细胞中APP蛋白表达的影响Quantity one软件对APP蛋白条带进行光密度分析的结果，I是对照，2是Se-PM, 3 是 Se-Carr，4 是 Na2SeO3。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明实施例提供一种硒化聚甘露糖醛酸的制备方法，其包括如下步骤SOl :制备磺化聚甘露糖醛酸将聚甘露糖醛酸(PM)悬浮于无水有机溶剂中，在搅拌条件下加入无水有机溶剂溶解的三氧化硫_吡啶复合物，在20 100°C恒温度下反应I 10小时，加入2 4倍体积的95%的乙醇，离心分离反应产物,再用95%的乙醇洗涤，力口水溶解，用碱调节PH至中性，透析，过滤，冷冻干燥，得磺化聚甘露糖醛酸(S-PM)；S02 :制备硒化聚甘露糖醛酸按质量比为I :0. I 10将所述磺化聚甘露糖醛酸与亚硒酸盐在酸性溶液中、Ba2+的催化下20 100°C恒温度下反应2 20小时，磺化聚甘露糖醛酸与氯化钡摩尔比为I :1 100，加入硫酸盐以去除Ba2+，离心取上清液，用碱调节PH至中性，再用截留分子量1000的透析袋透析，至抗坏血酸检测透析袋内液不变红为止，过滤，冷冻干燥，获得所述硒化聚甘露糖醛酸(Se-PM)。步骤SOl中，聚甘露糖醛酸悬浮于无水有机溶剂中，优选地，所述有机溶剂为二甲基甲酰胺(DMF)，所述三氧化硫-吡啶复合物与PM的摩尔比为100 I :1。所述反应优选在50 70°C恒温度下反应3 5小时，加入2 4倍体积的95%的醇，其目的为终止反应并醇沉多糖。离心分离，用醇洗涤沉淀后，将沉淀溶于水中，用碱调节PH值至7。其中，所述碱可以为NaOH、KOH等强碱。透析，滤过，冷冻干燥，得磺化聚甘露糖醛酸。步骤S02优选为，按质量比为I :1 3将所述磺化聚甘露糖醛酸与亚硒酸盐在加入到非强还原酸中，如稀硝酸溶液，更优选地，硝酸的质量浓度为0. 5 %，其中，磺化聚甘露糖醛酸在酸溶液中的质量浓度为0. I 0. 3%，优选为0. 2%。在Ba2+的催化下、40 60°C恒温度下反应7 10小时，磺化聚甘露糖醛酸与氯化钡摩尔比为I :1 100，加入硫酸盐以去除Ba2+，离心取上清液，用碱调节pH至中性，再用截留分子量1000的透析袋透析，至抗坏血酸检测透析袋内液不变红为止，过滤，冷冻干燥，获得所述硒化聚甘露糖醛酸。其中，所述冷冻干燥具体是在_80°C下冷冻8 24小时，再用真空冷冻干燥冻干。所制备的硒化聚甘露糖醛酸包含吡喃型糖单元，即P -I, 4-D-甘露糖醛酸，其C2、C4和C5位上至少一个羟基氢被亚硒酸酯基或其盐所取代。所述聚甘露糖醛酸、磺化聚甘露糖醛酸和硒化聚甘露糖醛酸的红外光图谱如图I所示。从图I (a)中可以看出，在939. 99、 1037. 21和1082. 53CHT1为吡喃糖环骨架振动的特征吸收峰，820. 40cm^为D-聚甘露糖醛酸的特征吸收峰，证明该样品分子中存在D-聚甘露糖醛酸糖环骨架结构。磺化聚甘露糖醛酸的红外光图谱(图Ib)中，856. 27和1255. SOcnT1分别为C-O-S和S=O的伸缩振动峰，证明该样品分子中存在硫酸酯基；1418. 67和1629. 79cm^分别为COO-的对称和非对称伸缩振动峰，证明该样品结构中存在羧基；3442. 25CHT1为羟基吸收峰，证明该样品结构中存在-0H。对照PM的IR谱图发现，在磺化聚甘露糖醛酸中增加了硫酸酯基的吸收峰，表明硫酸酯基成功地引入至PM的分子结构中(图lc)。已有报道亚硒酸钠的红外图谱在788. 63CHT1和742. 29CHT1有两个特征吸收峰，而PM在此范围内无吸收峰。Se-PM的红外光图谱(图Ic)中，3457. 35cm-l为羟基吸收峰，证明该样品结构中存在-OH ； 1415. 33和1614. 22cm-1分别为COO-的对称和非对称伸缩振动峰，证明该样品结构中存在羧基C00H。各特征吸收峰的位置不变化，多糖的基本构型保持不变，其特征吸收峰828. 76cm-1强度变化不大，透析后硒多糖中无游离的亚硒酸根，证实多糖与亚硒酸根结合后形成化学键，而不是吸附。以及，本发明实施例提供上述硒化聚甘露糖醛酸的制备方法所制备的硒化聚甘露糖醛酸在阿尔茨海默症预防和治疗的药物以及保健品中的应用。阿尔兹海默症是一组病因未明的原发性退行性脑变性疾病。多起病于老年期，潜隐起病，病程缓慢且不可逆，临床上以智能损害为主。病理改变主要为皮质弥漫性萎缩，沟回增宽，脑室扩大，神经元大量减少，并可见老年斑(SP)，神经原纤维结(NFT)等病变，胆碱乙酰化酶及乙酰胆碱含量显著减少。将所述硒化聚甘露糖醛酸作用于AD细胞模型，研究硒化聚甘露糖醛酸对AD病理指标的改变以及作用机理。氧化应激参与阿尔茨海默病的发生和发展，所述硒化聚甘露糖醛酸(Se-PM)具有良好的抗氧化效果。将AD细胞模型为N2a-APP695-sw细胞按5 X IO3/孔接种于96孔细胞培养板，培养24h后洗细胞三次，分别加入100 u L多种硒化合物与多糖的无血清DMEM培养基，使所含硒的最终浓度为2. 5iimol/L、多糖与对应的硒多糖质量相同，培养24h后再加入10 ii L含H2O2的无血清DMEM培养基，使H2O2的终浓度为60 u mo I/L (n=6)，继续培养24h，加CCK-8试剂，检测细胞存活率。图2是硒浓度为2. 5 u mo I/L的Se-PM和Na2SeO3,以及500 u g/mL的磺化聚甘露糖醛酸、PM和不同聚合度的寡糖混合物(MOM)对N2a-APP695_sw细胞免受H2O2氧化损伤的保护作用结果(#*p〈0. 001VS对照，###p〈0. 001VS H2O2模型组)。从图2中可以看出，Se-PM、磺化聚甘露糖醛酸、聚甘露糖醛酸和Na2SeO3可以使H2O2处理的N2a-APP695-sw细胞的存活率显著提高，而在MOM的作用下，细胞存活率没有显著变化。因此，Se-PM、磺化聚甘露糖醛酸、PM和Na2SeO3能够保护N2a-APP695_sw细胞免受H2O2的氧化损伤。而且本实验AD模型细胞在Se-PM作用后线粒体膜电位显著增高、细胞色素C的释放减少、ROS水平明显降低、Bcl-2蛋白的表达明显增加。因此，Se-PM能够通过保护线粒体完整性和生物功能、抑制细胞内ROS的产生，从而提高Bcl-2蛋白的表达，促进细胞生长与增殖，阻止或延缓细胞的凋亡。对硒化聚甘露糖醛酸处理AD细胞进行研究。采用的AD细胞模型为N2a-APP695-sw细胞，是稳转了 APP695 Swedish突变基因的Neuro_2a细胞。取对数生长期N2a_APP_sw细胞消化成单细胞悬液，调节细胞浓度，将其接种于培养皿上，37°C，5% CO2培养箱中培养24h。弃去旧的培养液，用无血清培养基重复洗3次，再分别加入待研究硒化合物与多糖的无血清DMEM培养基，使硒的终浓度为2. 5 u mol/L (多糖与对应的硒多糖质量相同)，继续培养24h。收集细胞，加入细胞裂解液(RIPA)，冰浴裂解细胞，4°C于14000rpm离心lh。收集上清， 于-80°C冰箱中保存备用。采用BCA法测定蛋白质浓度。通过Western blot方法检测与AD重要相关蛋白的变化，用兔源BACEl抗体、鼠源APP抗体分别检测所对应的蛋白。通过研究与AD重要相关的蛋白BACEl个APP来研究硒化聚甘露糖醛酸对AD的作用效果。BACEl即
3-分泌酶1，^ -actin是P -肌动蛋白,APP是AP的前体蛋白，a -tublin是a -微管蛋白。上述硒化聚甘露糖醛酸的制备方法所制备的Se-PM处理AD模型细胞N2a-APP695-sw24小时后提蛋白，BCA定量后进行Western blot分析，结果如图3 图5所示，Se-PM能够非常显著的降低BACEl蛋白的表达(#*P〈0. 001)，也能够显著降低APP的表达(*P〈0. 05)。其作用效果显著强于硒化卡拉胶(Se-Carr)和亚硒酸钠(Na2SeO3)tj这说明Se-PM有可能防止AD重要病理特征￠-淀粉样斑块的形成，因此具有抗AD的作用。以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。实施例I :将IOOmg经干燥后聚甘露糖醛酸(PM)悬浮于DFM中，在搅拌条件下加入5mL无水DMF溶解的600mg三氧化硫-吡啶复合物，在60°C恒温度下反应4小时，加入3倍体积的95%的乙醇，离心分离反应产物,用95%的乙醇洗涤，加水溶解，用碱调节pH至中性，透析，过滤，冷冻干燥，得磺化聚甘露糖醛酸，其中硫含量为12. 5%, DS=L 29，平均产率为78% ；制备硒化甘露糖醛酸将所述IOOmg磺化聚甘露糖醛酸与200mg亚硒酸盐加入到50mL0. 5%的HNO3溶液里，25mg BaCl2的催化下60°C反应8h，加入硫酸盐以去除Ba2+，离心取上清液，用碱调节PH至中性，再用截留分子量1000的透析袋透析，至抗坏血酸检测透析袋内液不变红为止，过滤，冷冻干燥，获得所述硒化聚甘露糖醛酸(Se-PM)，测得样品中含硒量为437. 25 u g/g，硒化过程平均产率为70%。实施例2:将IOOmg经干燥后聚甘露糖醛酸(PM)悬浮于DFM中，在搅拌条件下加入5mL无水DMF溶解的600mg三氧化硫-吡啶复合物，在20°C恒温度下反应10小时，加入2倍体积的95%的乙醇，离心分离反应产物,用95%的乙醇洗涤，加水溶解，用碱调节pH至中性，透析，过滤，冷冻干燥，得磺化聚甘露糖醛酸；制备硒化甘露糖醛酸将所述IOOmg磺化聚甘露糖醛酸与IOmg亚硒酸盐加入到50mL0. 5%的順03溶液里，25mg Ba(NO3)2的催化下20°C反应20h，加入硫酸盐以去除Ba2+，离心取上清液，用碱调节PH至中性，再用截留分子量1000的透析袋透析，至抗坏血酸检测透析袋内液不变红为止。过滤，冷冻干燥，获得所述硒化聚甘露糖醛酸(Se-PM)。实施例3 将IOOmg经干燥后聚甘露糖醛酸(PM)悬浮于DFM中，在搅拌条件下加入5mL无水DMF溶解的600mg三氧化硫-吡啶复合物，在100°C恒温度下反应I小时，加入4倍体积的95%的乙醇，离心分离反应产物,用95%的乙醇洗涤，加水溶解，用碱调节pH至中性，透析，过滤，冷冻干燥，得磺化聚甘露糖醛酸；制备硒化甘露糖醛酸将所述IOOmg磺化聚甘露糖醛酸与IOOOmg亚硒酸加入到50mL0. 5%的HNO3溶液里，IOOOmg BaCl2的催化下100°C反应2h，加入硫酸盐以去除Ba2+，离心取上清液，用碱调节PH至中性，再用截留分子量1000的透析袋透析，至抗坏血酸检测透析袋内液不变红为止。过滤，冷冻干燥，获得所述硒化聚甘露糖醛酸(Se-PM)。 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种硒化聚甘露糖醛酸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 制备磺化聚甘露糖醛酸将聚甘露糖醛酸悬浮于无水有机溶剂中，在搅拌条件下加入无水有机溶剂溶解的三氧化硫-吡啶复合物，在20 100°C恒温度下反应I 10小时，力口入2 4倍体积的95%的乙醇，离心分离反应产物，再用95%的乙醇洗涤，加水溶解，用碱调节PH至中性，透析，过滤，冷冻干燥，得磺化聚甘露糖醛酸； 制备硒化聚甘露糖醛酸按质量比为I :0. I 10将所述磺化聚甘露糖醛酸与亚硒酸盐在酸性溶液中、Ba2+的催化下20 100°C恒温度下反应2 20小时，所述磺化聚甘露糖醛酸与氯化钡摩尔比为I :1 100，加入硫酸盐以去除Ba2+，离心取上清液，用碱调节pH至中性，再用截留分子量1000的透析袋透析，至抗坏血酸检测透析袋内液不变红为止，过滤，冷冻干燥，获得所述硒化聚甘露糖醛酸。
2.如权利要求I所述的硒化聚甘露糖醛酸的制备方法，其特征在于，所述三氧化硫_吡啶复合物与聚甘露糖醛酸的摩尔比为100 I :1。
3.如权利要求I所述的硒化聚甘露糖醛酸的制备方法，其特征在于，所述碱为强碱。
4.如权利要求I所述的硒化聚甘露糖醛酸的制备方法，其特征在于，所述制备磺化聚甘露糖醛酸为将聚甘露糖醛酸悬浮于二甲基甲酰胺中，在搅拌条件下加入二甲基甲酰胺溶解的三氧化硫_吡啶复合物，在50 70°C恒温度下反应3 5小时，加入2 4倍体积的95%的乙醇，离心分离反应产物，用95%的乙醇洗涤，加水溶解，用碱调节pH至中性，透析，过滤，冷冻干燥，得磺化聚甘露糖醛酸。
5.如权利要求I所述的硒化聚甘露糖醛酸的制备方法，其特征在于，所述制备硒化聚甘露糖醛酸为按质量比为I :1 3将所述磺化聚甘露糖醛酸与亚硒酸盐在硝酸溶液中、Ba2+的催化下40 60°C恒温度下反应7 10小时，所述磺化聚甘露糖醛酸与氯化钡摩尔比为I :1 100，加入硫酸盐以去除Ba2+，离心取上清液，用碱调节pH至中性，再用截留分子量1000的透析袋透析，至抗坏血酸检测透析袋内液不变红为止，过滤，冷冻干燥，获得所述硒化聚甘露糖醛酸。
6.如权利要求I所述的硒化聚甘露糖醛酸的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥是在-80°C下冷冻8 24小时，再用真空冷冻干燥冻干。
7.如权利要求I所述的硒化聚甘露糖醛酸的制备方法，其特征在于，所述酸性溶液为非强还原性酸溶液。
8.如权利要求I所述的硒化聚甘露糖醛酸的制备方法，其特征在于，所述磺化聚甘露糖醛酸在酸溶液中的质量浓度为0. I 0. 3%。
9.如权利要求I 8所述的硒化聚甘露糖醛酸的制备方法所制备的硒化聚甘露糖醛酸在阿尔茨海默症预防和治疗的药物以及保健品中的应用。
全文摘要
本发明涉及硒化多糖技术领域，提供一种硒化聚甘露糖醛酸的制备方法，其包括如下步骤将聚甘露糖醛酸悬浮于无水有机溶剂中，在搅拌条件下加入无水有机溶剂溶解的三氧化硫-吡啶复合物，在20～100℃恒温度下反应1～10小时，加入乙醇，离心分离反应产物，再用乙醇洗涤，加水溶解，用碱调节pH至中性，透析，过滤，冷冻干燥，得磺化聚甘露糖醛酸；将所述磺化聚甘露糖醛酸与亚硒酸盐在酸性溶液中、Ba2+的催化下进行反应，加入硫酸盐，离心取上清液，用碱调节pH至中性，透析，过滤，冷冻干燥，获得所述硒化聚甘露糖醛酸。以及，提供上述硒化聚甘露糖醛酸的制备方法所制备的硒化聚甘露糖醛酸在阿尔茨海默症预防和治疗的药物以及保健品中的应用。
文档编号C08B37/00GK102936291SQ20121045891
公开日2013年2月20日 申请日期2012年11月15日 优先权日2012年11月15日
发明者朱志杰, 刘琼, 续旭, 倪嘉缵 申请人:深圳大学