趋化素-细胞素融合蛋白和其应用的制作方法

本发明涉及一种融合蛋白，其包含趋化素和连接至该趋化素的细胞素，其中该趋化素和该细胞素具有共同的标的细胞，且其具有增进的细胞素活性和增进的趋化素活性的作用。

背景技术：

细胞素(cytokine)是一群当细胞受外来刺激后所分泌出来(只有极少种细胞素可表达于细胞膜)的蛋白，细胞素自细胞产生后可以就近或经由血液的运输而作用于标的细胞以产生影响，而且在极低的浓度下就会发挥作用，广泛具有可促使标的细胞生长、分化或活化等功能，许多细胞素可作用在免疫细胞而参与免疫反应。细胞素可依其结构作用不同大致分为趋化素(chemokines)、介白素(interleukins)、生长因子(growthfactors)、转形生长因子(transforminggrowthfactors)、群落生成刺激因子(colonystimulatingfactors)、肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactors)和干扰素(interferons)等。

趋化素(chemokines)是一群可趋化吸引白血球的细胞素，通常为分子量小、带正电、可分泌性的蛋白，主要的功能是将免疫细胞吸引到组织受伤或是有病原感染的区域，白血球继而能够在此特定的部位进行吞噬反应(phagocytosis)或是引发发炎反应(inflammation)，以抵御病原，趋化素所吸引的白血球可能包括属于先天性免疫力(innateimmunity)的中性粒细胞(neutrophils)、单核球/巨噬细胞(monocytes/macrophages)、自然杀伤细胞(naturalkillercells)、树突细胞(dendriticcells)和其他白血球等，或者是属于特异性免疫反应(adaptiveimmunity)的t(淋巴)细胞(tlymphocytes，tcells)或b(淋巴)细胞(blymphocytes，bcells)，在生物体的免疫系统中扮演相当重要的角色。趋化素大多拥有4个高度保留的半胱胺酸(cysteine，c)形成双硫键来稳定其结构，依据前两个c的间的氨基酸数不同和第一个c有无进行分类，可分成cxc(或称α)、cc(或称β)、c(或称γ)与cx3c四个亚群(subfamilies)。基质细胞衍生因子(stromalcell-derivedfactor-1，sdf-1)被归类在趋化素的cxc亚群里，又称为cxc配体12(cxcl12)，在许多的物种中均有发现，包括哺乳类动物中的人类、小鼠和猫与两栖类动物中的非洲爪蟾(xenopus)以及斑马鱼(zebrafish)都有发现，在不同物种间变异不大，有相当好的保留性(shirozuetal.，genomics28，495-500)。sdf-1基因在小鼠和人类中转录出的mrna会先经过不同剪接(splicing)，所以可发现有两种sdf-1同型异构物(isoform)：sdf-1α和sdf-1β。sdf-1的分布极广，包括淋巴组织、肾、肺、肝、脑和肌肉等都可侦测的到(shirozuetal.，genomics28，495-500)。sdf-1的受体cxcr4除了长存于脏器中，亦可见于造血干细胞(hematopoieticstemcells)、内皮细胞、树突细胞、b细胞、和t细胞，因此这些细胞会受sdf-1吸引，移动到该趋化素浓度高的部位(bleuletal.，nature，382：829-833；oberlinetal.，nature382：833-835；readetal.，developmentalandcomparativeimmunology，29，143-152)。介白素-8(interleukin-8，il-8)亦被归类在趋化素的cxc亚群里，又称为cxcl8，首度在人类发现后，陆续在猪、牛、鸡等经济动物发现。il-8在低浓度时可以趋化多种免疫细胞，包括单核球、巨噬细胞和淋巴细胞、中性粒细胞等。

cd40配体(cd40ligand，cd40l)是肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，tnf)超家族(superfamily)里的一员，此种细胞素具有使肿瘤坏死与促进白血球细胞分化、增生、凋亡的功用。cd40l蛋白合成时为一跨膜蛋白(transmembraneprotein)，以人类cd40l为例，蛋白共261个氨基酸，首先氨基端22个氨基酸为细胞内区域，接着24个氨基酸为穿膜区域，靠羧基端215个氨基酸序列为细胞外(extracellular，exc)区域，exc区域在羧基端具有一个tnf超家族蛋白均保留的tnf同源(tnfhomology，tnfh)区域。cd40l主要以跨膜蛋白形式存在活化的cd4⁺t细胞表面，也存在cd8⁺t细胞、嗜碱性粒细胞(basophils)、嗜酸性粒细胞(eosinophils)、肥大细胞、自然杀伤细胞、血小板、甚至在表达cd40的细胞表面也有发现。

cd40l的受体为cd40，分布于b细胞、树突细胞，巨噬细胞等抗原呈现细胞(antigenpresentingcells，apcs)表面。在生理上这些抗原呈现细胞可受到辅助性t细胞(thelpercells)表达的cd40l活化，促进表达第二类主要组织相容性复合体(maiorhistocompatibilitycomplexclassii，mhc-ii)分子与b7分子以助抗原呈现。cd40l透过与标的细胞上的cd40结合而活化信息传递通路，除了上述促进抗原呈现的作用，cd40l在b细胞可促进b细胞增殖(proliferation)、免疫球蛋白的类型转变(isotypeswitching)、抗体分泌、记忆性b细胞的分化或避免细胞凋亡；cd40l作用在巨噬细胞可加强其活化，促进其产生介白素-12(interleukin-12，il-12)以活化第一型辅助性t细胞(thelper1，th1)或是分泌一些趋化素，或是促进一氧化氮(nitricoxide，no)产生以提升巨噬细胞防卫微生物的能力；作用在树突细胞可使其成熟活化，活化的树突细胞除了表达大量mhc-ii分子以助抗原呈现，还会分泌tnf-α以及il-8、巨噬细胞炎性蛋白1α(macrophageinflammatoryprotein1α，mip-1α)等趋化素。

目前已有许多研究将cd40l应用在疫苗佐剂或是治疗上，例如做为鸭b型肝炎病毒(duckhepatitisbvirus，dhbv)疫苗(garesetal.，clinvaccineimmunol13，958-965)、人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)dna疫苗(stoneetal.，jvirol80，1762-1772)的佐剂或是治疗人类自体免疫性疾病(howard&miller，autoimmunity37，411-418)等。

介白素-2(interleukin-2，il-2)被归类在造血因子(hematopoietin)家族里，这家族包括了一些与细胞生长有关的荷尔蒙或其他细胞素等。il-2的功能包括：调节t细胞的成熟和分化、刺激b细胞的增殖和抗体分泌、促进自然杀伤细胞的毒杀能力、活化单核细胞和巨噬细胞等。il-2也可以刺激t细胞与b细胞持续表达mhc，也可以刺激自然杀伤细胞产生多种不同的细胞素，包括tnf-α、ifn-γ和粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte/macrophagecolonystimulatingfactor，gm-csf)等。研究显示il-2有抗肿瘤和提升疫苗的作用。

然而，本领域中仍然需要具较强活性的细胞素和趋化素。

技术实现要素：

本发明意外地发现，包含趋化素和连接至该趋化素的细胞素的融合蛋白，具有增进的细胞素活性和增进的趋化素活性。

因此，本发明提供一种融合蛋白，其包含一趋化素多肽，其为一趋化素或其受体结合域；和连接至该趋化素多肽的一细胞素多肽，其为一介白素、一tnf-超家族细胞素或其受体结合域；其中该趋化素多肽和该细胞素多肽具有共同的标的细胞，且该融合蛋白具有相较于该趋化素多肽的增进的趋化素活性，以及相较于该细胞素多肽的增进的细胞素活性。

根据本发明，该趋化素为一cxc趋化素、cc趋化素、c趋化素和cx3c趋化素，较佳为cxc趋化素。根据本发明的具体实施例，该趋化素可以是基质细胞衍生因子(stromalcell-derivedfactor-1；sdf-1)或il-8。

根据本发明，该细胞素多肽为一介白素、一tnf-超家族细胞素或其受体结合域。在本发明的具体实施例中，该细胞素多肽为il-2、cd40配体或其受体结合域。

另一方面，本发明提供一种经分离的核酸分子，其编码本发明的融合蛋白。

又一方面，本发明提供一种表达载体，其包含本发明的核酸分子。

本发明亦提供一种宿主细胞，其包含本发明的核酸分子或本发明的表达载体。

本发明的各个具体实施例的细节说明如后。本发明的其他特征将会经由以下各个具体实施例中的详细说明和申请专利范围而清楚呈现。

无须进一步的阐述，相信本发明所属技术领域中具有通常知识者基于前述说明即可利用本发明至最广的程度。因此，可以理解以下的说明仅仅是作为例示说明的用，而非以任何方式限制其余的揭露内容。

附图说明

图1为鸡cd40l和其衍生蛋白cd40lexc和cd40ltnfh的示意图；

图2显示所表达的鸡重组融合蛋白的sds-page和westernblot分析结果；

第1道(lane1)：il8cd40lexc，预期大小为52kda；第2道：il8il2，预期大小为44kda；第3道：sdf1cd40lexc，预期大小为38kda；第4道：sdf1cd40ltnfh，预期大小为44kda；和第5道：sdf1il2，预期大小为26kda；

图3显示纯化单一蛋白的sds-page和westernblot分析结果；

第1道：标签蛋白，预期大小为21kda；第2道：il-8，预期大小为13kda；第3道：sdf-1，预期大小为11kda；第4道：il-2，预期大小为32kda；第5道：cd40lexc，预期大小为42kda；和第6道：cd40ltnfh，预期大小为33kda；

图4显示il-8衍生蛋白趋化pbmcs的情形；

细胞受到胶体外的趋化素吸引，会自中心胶体游向四周，细胞在低放大倍率下呈现云雾状，胶体周围细胞愈多代表趋化细胞程度愈大，在2μm下，il8cd40lexc或il8il2趋化细胞程度明显大于il-8单一蛋白；

图5显示sdf-1衍生蛋白趋化pbmcs的情形；

在2μm下，sdf1cd40lexc、sdf1cd40ltnfh、或sdf1il2趋化细胞程度明显大于单一sdf-1蛋白；

图6显示cd40l衍生蛋白活化巨噬细胞产生no的活性；

a：cd40lexc；b：cd40ltnfh；c：il8cd40lexc；d：：sdf1cd40lexc；e：：sdf1cd40ltnfh；和对照组：以lps(4μg/ml)做为阳性对照组，卷标蛋白(250nm)和培养液做为阴性对照组，^*表示与个别单一蛋白相比有显著较高活性(^*p＜0.05，^**p＜0.01)；

图7显示il-2融合蛋白促进淋巴球增生试验的结果；

增生指数(stimulationindex，si)＝试验组别的od/仅以rpmi1640培养的od。融合蛋白sdf1il2浓度在0.625-160nm时，其si值显著高于单独il-2组别(^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001)；

图8显示il-2融合蛋白作为新城疫病(nd)疫苗佐剂，可显著促进细胞免疫反应；施用il-2融合蛋白佐剂与nd疫苗组别鸡只，于新城疫病毒(ndv)抗原再刺激时，其记忆淋巴细胞增生情形显著高于nd疫苗组；

图9显示融合蛋白作为传染性支气管炎(ib)疫苗佐剂，可显著促进细胞免疫反应；

进行传染性支气管炎病毒(ibv)抗原再刺激试验，施用il-2融合蛋白佐剂与ib疫苗组别鸡只，其记忆淋巴细胞增生情形显著(p<0.01)高于ib疫苗组；施用cd40lexc融合蛋白佐剂与ib疫苗组别鸡只，其记忆淋巴细胞增生情形亦显著(p<0.05)高于ib疫苗组。

具体实施方式

除非另有指明，所有在此处使用的技术性和科学性术语具有如同本发明所属技艺中的通常技术者一般所了解的意义。

本文所使用的“一”一词，如未特别指明，是指至少一个(一个或一个以上)的数量。

本文所使用的“趋化素多肽”一词是指一多肽，其为趋化素(chemokine)或其受体结合域(receptorbindingdomain)，其中该趋化素包括但不限于cxc趋化素、cc趋化素、c趋化素和cx3c趋化素。

本文所使用的“细胞素多肽”一词是指一多肽，其为细胞素(cytokine)或其受体结合域，其中该细胞素包括但不限于介白素和tnf-超家族细胞素。

本文所使用的「趋化素活性」一词是指趋化素于生物体内所具备或可发挥的活性，包括但不限于趋化多种免疫细胞(包括单核细胞、巨噬细胞、t细胞、b细胞、自然杀伤细胞、树突细胞和中性粒细胞等)。

本文所使用的“细胞素活性”一词是指细胞素于生物体内所具备或可发挥的活性，包括但不限于促进b细胞增殖、免疫球蛋白的类型转变、抗体分泌；记忆性b细胞的分化或避免细胞凋亡；促进巨噬细胞分泌介白素-12以活化第一型辅助性t细胞或分泌趋化素；促进巨噬细胞产生一氧化氮以提升防卫微生物的能力；促进树突细胞成熟活化；调节t细胞的成熟和分化；促进自然杀伤细胞的毒杀能力、产生多种不同的细胞素；活化单核细胞和巨噬细胞；和刺激t细胞与b细胞持续表达mhc等。

本发明提供一种融合蛋白，其包含一趋化素多肽，其为一趋化素或其受体结合域；和连接至该趋化素多肽的一细胞素多肽，其为一介白素、一tnf-超家族细胞素或其受体结合域；其中该趋化素多肽和该细胞素多肽具有共同的标的细胞，且该融合蛋白具有相较于该趋化素多肽更增进的趋化素活性，以及相较于该细胞素多肽更增进的细胞素活性。

在本发明的较佳具体实施例中，该趋化素多肽和该细胞素多肽是通过多肽接头(peptidelinker)连接。为了将两种蛋白接合在一起并且还保有原来的构形与功能，可在两蛋白的中间加上适当的多肽接头以降低两蛋白折叠时的互相干扰。而这类多肽接头例如具有一定程度的弹性和亲水性的弹性多肽接头(gly-gly-gly-gly-ser)n(通常n小于6)，或是具亲水性的螺旋多肽接头(glu-ala-ala-ala-lys)n(通常n小于6)。

在本发明一具体实施例中，该趋化素系为一cxc趋化素。在一特定实施例中，该趋化素为基质细胞衍生因子(sdf-1)。在另一特定实施例中，该趋化素为il-8。

在本发明的部分具体实施例中，该趋化素多肽系具有选自下列的氨基酸序列之一：seqidno：2、4、6、8、10、12、14、16、18和其同源物(homolog)和类似物(analog)。

在本发明部分具体实施例中，该细胞素多肽为il-2、cd40配体(cd40ligand；cd40l)或其受体结合域。

在本发明部分具体实施例中，该细胞素多肽具有选自下列的氨基酸序列之一：seqidno：20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和其同源物和类似物。

在本发明特定具体实施例中，本发明的融合蛋白具有选自下列的氨基酸序列之一：seqidno：40、42、44、46和48。

另一方面，本发明提供一种经分离的核酸分子，其编码本发明的融合蛋白。

在本发明部分具体实施例中，该经分离的核酸分子包含选自下列的编码趋化素多肽的核苷酸序列之一：seqidno：1、3、5、7、9、11、13、15、17和其同源物和类似物。

在本发明部分具体实施例中，该经分离的核酸分子包含选自下列的编码细胞素多肽的核苷酸序列之一：seqidno：19、21、23、25、27、29、31、33、35、37和其同源物和类似物。

在本发明特定具体实施例中，该经分离的核酸分子具有选自下列序列之一：seqidno：39、41、43、45和47。

又一方面，本发明提供一种表达载体，其包含本发明的核酸分子。

本发明亦提供一种宿主细胞，其包含本发明的核酸分子或本发明的表达载体。

以下实施例仅作为说明，而非作为本发明的限制。

实施例1：原核表达载体的构建

利用先前已构建的鸡sdf-1、il-8、cd40l衍生蛋白和il-2的表达载体(吴佩珊，国立中兴大学兽医微生物学研究所硕士论文2008，鸡cd40l和趋化素的研究；tsaietal.，taiwanvetj31：38-45)做为模版，进行重组聚合酶链反应，其中鸡cd40l(chcd40l)衍生蛋白包括cd40l的细胞外区域(extracellulardomainofcd40l，cd40lexc)或tnf同源区域(tnfhomologydomainofcd40l，cd40ltnfh)(参见图1)。由此扩增sdf1cd40lexc、sdf1cd40ltnfh、sdf1il2、il8cd40lexc、il8cd40ltnfh、il8il2等连接蛋白(conjugateprotein)或融合蛋白(fusionprotein)的基因序列。

方法简述如下，根据各基因序列分别设计出两对专一性引物对，第一对引物的正向引物带有限制性酶切位点ecori切位和融合蛋白位于前段的n-端基因序列，反向引物则带有螺旋多肽接头和融合蛋白位于前段的c-端基因序列，此对引物可专一性扩增出编码融合蛋白前段与多肽接头的dna片段；第二对引物的正向引物带有螺旋多肽接头和融合蛋白位于后段的n-端基因序列，反向引物则带有限制性酶切位点xhoi切位和融合蛋白位于后段的c-端基因序列，此对引物则可专一性扩增出编码多肽接头与融合蛋白后段的dna片段；将这两pcr产物做为模板，以第一对引物的正向引物与第二对引物的反向引物再做一次pcr，则两个片段会因为螺旋多肽接头重迭的部分序列而达到连接的目的，所得的产物即为其间含有螺旋多肽接头的融合基因序列。将上述产物以限制性酶切位点ecori与xhoi作用后，与经过ecori和xhoi作用过的pet载体(novagen，darmstad，germany)以t4dna接合酶(invitrogen)在16℃进行16小时连接作用，构建的原核表达载体分别命名为petsdf1cd40lexc、petsdf1cd40ltnfh、petsdf1il2、petil8cd40lexc和petil8il2。

实施例2：重组蛋白的表达

将构建好的原核表达载体转化至e.coli表达菌株bl21(de3)中，以0.5mmiptg诱导重组蛋白表达，以离心的方式收取菌体去除培养液。所有的菌体接着以结合缓冲液(bindingbuffer)重悬，使用高压细胞裂解仪(frenchpressurecellpress，thermoiec，needham，height，ma，usa)裂解菌体，高速离心的后水溶性的蛋白会位于上清液，以镍离子亲和柱进行纯化。不可溶蛋白则会位于离心后的底部团块中，以8m尿素处理此部分不可溶蛋白后，尿素会将蛋白质的折叠打开使其溶解于水溶液中，接着离心12000rpm30分钟取其上清液进行透析，将尿素慢慢置换出来，使蛋白重新折叠成原来的构型，最后将蛋白质溶解于含有10％甘油的磷酸盐缓冲液(ph7.3)中，经0.22μm滤膜过滤后，以bca蛋白分析试剂盒(pierce，rockford，il，usa)测定蛋白浓度，储存在-20℃。蛋白纯化后经maldi-tof质谱仪分析鉴定为正确的融合蛋白，sds-page与westernblot(一级抗体为anti-his抗体，二级抗体为ap-标记的山羊抗小鼠igg抗体，显色剂为nbt/bcip)分析显示所表达的鸡重组融合蛋白il8cd40lexc、il8il2、sdf1cd40lexc、sdf1cd40ltnfh和sdf1il2等的分子量如预期大小，分别为52kda、44kda、38kda、44kda和26kda(参见图2)。此外，亦制备纯化单一蛋白做为对照，方法如前述(吴佩珊，国立中兴大学兽医微生物学研究所硕士论文2008，鸡cd40l和趋化素的研究；tsaietal.，taiwanvetj31：38-45)。

实施例3：趋化活性试验(chemotacticactivityassay)

评估趋化素(sdf-1或il-8)与cd40l衍生蛋白或il-2融合后的趋化活性，以histopaque1077(sigma，saintlouis，mo，usa)分离周边血液单核细胞(peripheralbloodmononuclearcells，pbmcs)，以pbs冲洗两次后，再以含10％胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)的rpmi1640(gibco，grandisland，ny，usa)悬浮后加入融溶状态0.6％洋菜胶，混合均匀，使洋菜胶的终浓度为0.3％，接着取此混合液2μl/孔点在48孔盘的中央，放入冰箱五分钟使洋菜胶凝固，而将细胞固定在胶的范围内。接着每孔加入250μl含有各浓度待测蛋白的培养液，于37℃培养隔夜后观察。

依据各蛋白发挥趋化活性的最低有效浓度(minimaleffectiveconcentration，mec)，mec值愈小即趋化活性愈佳，il-8无论融合cd40l衍生蛋白或il-2(il8cd40lexc或il8il2)均可明显降低mec值，提高趋化活性，其融合蛋白趋化活性比il-8的更好(参见表1)；sdf-1无论融合cd40l衍生蛋白或il-2(sdf1cd40lexc或sdf1il2)均可降低mec值，提高趋化活性，其融合蛋白的趋化活性比sdf-1更好(参见表1)。各蛋白浓度愈高，趋化效果愈佳，在相同浓度下，il8cd40lexc(趋化程度最大)或il8il2(趋化程度次的)趋化细胞程度明显大于il-8单一蛋白(参见图4)；在相同浓度下，sdf1cd40lexc、sdf1cd40ltnfh、或sdf1il2趋化细胞程度明显大于混合液或sdf-1单一蛋白(参见图5)。

表1：趋化活性的最低有效浓度(mec)

实施例4：cd40l衍生蛋白活化巨噬细胞产生一氧化氮(nitricoxide，no)活性分析

基于cd40l可活化巨噬细胞产生no的特性，评估趋化素与cd40l衍生蛋白融合后的cd40l活性。分离周边血液单核细胞，以pbs冲洗两次后，以含10％fbs的rpmi1640外加125ng/ml鸡il-2和4μg/mllps调整细胞至2×10⁶/ml，24孔盘中各放入1ml，两天后外加新鲜培养液1ml(同样添加125ng/ml鸡il-2和4μg/mllps)，五天后完成刺激，单核细胞会分化成巨噬细胞。以pbs冲洗三次去除悬浮细胞后加入不同浓度的cd40l衍生蛋白或融合蛋白，并以培养液、载体表达的标签蛋白和加入4μg/mllps的培养液分别做为阴性和阳性对照组，培养48小时后取50μl利用可通过商业途径购买的试剂盒(griessreagentsystem；promega，madison，wi，usa)测定培养液中亚硝酸(由no转化)浓度。

融合蛋白il8cd40lexc与只加入cd40lexc的组别相比，有显著较好的活性(5-30nm，p＜0.05；180nm，p＜0.01)。融合蛋白sdf1cd40lexc的效果显著较单一cd40lexc蛋白更好(5nm，p＜0.01；30-180nm，p＜0.05)。而在sdf-1和cd40ltnfh的组合亦有类似结果，融合蛋白sdf1cd40ltnfh的效果也是显著比单一蛋白(cd40ltnfh)还要好(5nmand180nm，p＜0.01；0.8nmand30nm，p＜0.05)(参见图6)。

实施例5：il2融合蛋白促进淋巴球增生的活性

基于il-2可促进淋巴球增生的活性，评估趋化素与il-2融合后的il-2活性。利用细胞内酸性磷酸酶(acidphosphatase)的活性与细胞数成正比，加入显色底物对硝基磷酸苯酯(p-nitrophenylphosphate，pnpp)。分离周边血液单核细胞后，以含10％fbs的rpmi1640培养液加上不同浓度的蛋白、10μg/mlcona(阳性对照组)、或10nm标签蛋白(阴性对照组)，培养于96孔板当中，每孔细胞量为2×10⁵，培养三天后3000rpm离心10分钟，接着去掉培养液，每孔加入100μl的显色试剂(0.1msodiumacetate，ph5.5，0.1％tritonx-100，and10mmpnpp)，37℃培养两个小时，接着加入10μl1nnaoh终止反应，以波长405nm读取吸光值并计算增生指数(stimulationindex，si)，其中si＝试验组别的od/仅以rpmi1640培养的od。结果显示融合蛋白sdf1il2于0.625-160nm时促进增生的活性均显著高于il-2(0.625nm，p＜0.05；1.25-80nm，p＜0.001；160nm，p＜0.01)，此结果显示融合趋化素后il-2活性显著提高(参见图7)。

实施例6：融合蛋白作为禽类新城疫病(newcastledisease，nd)疫苗佐剂促进疫苗引发的免疫反应

以il-2融合蛋白作为禽类新城疫病(newcastledisease，nd)疫苗佐剂(vaccineadjuvant)施用于鸡只，于施用疫苗后抽取鸡血，培养淋巴细胞并加入灭活的(inactivated)新城疫病毒(newcastlediseasevirus，ndv)为抗原，进行抗原再刺激试验(antigenre-stimulationassay)，另于培养液加入10μg/mlcona做为阳性对照组，比较各组鸡只可识别ndv抗原的记忆淋巴细胞(memorylymphocytes)增生情形，决定增生情形的方法与实施例5所描述相同，增生百分比＝(试验组别的od/仅以rpmi1640培养的od)×100％。与仅接种nd疫苗的组别(ndvaccine)相较，接种il-2融合蛋白为nd疫苗佐剂的组别(sdf1il2+ndvaccine)可显著(p＜0.05)提升抗原再刺激时具抗原识别特异性(antigen-specific)的记忆淋巴细胞增生活性(参见图8)。

实施例7：融合蛋白作为禽类传染性支气管炎(infectiousbronchitis，ib)疫苗佐剂促进疫苗引发的免疫反应

以il-2融合蛋白或cd40lexc融合蛋白作为禽类传染性支气管炎(infectiousbronchitis，ib)疫苗佐剂，于施用疫苗后抽取鸡血，培养淋巴细胞并加入去活性传染性支气管炎病毒(infectiousbronchitisvirus，ibv)为抗原，进行抗原再刺激试验，比较各组鸡只可识别ibv抗原的记忆淋巴细胞增生情形，决定增生情形的的方法与实施例5所描述相同，增生百分比＝(试验组别的od/仅以rpmi1640培养的od)×100％。与仅接种ib疫苗的组别(ibvaccine)相较，接种il-2融合蛋白为ib疫苗佐剂的组别(sdf1il2+ibvaccine)(p＜0.01)或接种cd40lexc融合蛋白为ib疫苗佐剂的组别(sdf1cd40lexc+ibvaccine)(p＜0.05)均可显著提升抗原再刺激时具抗原识别特异性的记忆淋巴细胞增生活性(参见图9)。

序列表

<110>薛富盛

<120>趋化素-细胞素融合蛋白和其应用

<130>ic0333/chi0001tw

<160>48

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>263

<212>dna

<213>gallusgallus（原鸡）

<400>1

ctctgtcgcaaggtaggacgctggtaaagatggggaatgagctgcggtgccagtgcatta60

gcactcattctaagttcatccaccctaaatccattcaagatgtgaagctgacgccaagcg120

gcccccactgcaagaatgttgaaatcatagctactctaaaggatggaagagaggtgtgct180

tggaccccactgctccctgggtacagctgatcgtaaaggcacttatggccaaggctcagc240

tcaattctgatgcaccactgtga263

<210>2

<211>87

<212>prt

<213>gallusgallus（原鸡）

<400>2

alaleuserglnglyargthrleuvallysmetglyasngluleuarg

151015

cysglncysileserthrhisserlyspheilehisprolysserile

202530

glnaspvallysleuthrproserglyprohiscyslysasnvalglu

354045

ileilealathrleulysaspglyarggluvalcysleuaspprothr

505560

alaprotrpvalglnleuilevallysalaleumetalalysalagln

65707580

leuasnseraspalaproleu

85

<210>3

<211>237

<212>dna

<213>susscrofa（山猪）

<400>3

gcaagagtaagtgcagaacttcgatgccagtgcataaatacgcattccacacctttccac60

cccaaatttatcaaggaactgagagtgattgagagtggaccccactgtgaaaattcagaa120

atcattgttaagcttgtcaatggaaaagaggtctgcctggaccccaaggaaaagtgggtg180

cagaaggttgtacagatatttttgaagagaactgagaagcaacaacaacagcagtaa237

<210>4

<211>78

<212>prt

<213>susscrofa（山猪）

<400>4

alaargvalseralagluleuargcysglncysileasnthrhisser

151015

thrprophehisprolyspheilelysgluleuargvalilegluser

202530

glyprohiscysgluasnsergluileilevallysleuvalasngly

354045

lysgluvalcysleuaspprolysglulystrpvalglnlysvalval

505560

glnilepheleulysargthrglulysglnglnglnglngln

657075

<210>5

<211>240

<212>dna

<213>bostaurus（瘤牛）

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gcagttctgtcaagaatgagtacagaacttcgatgccaatgcataaaaacacattccaca60

cctttccaccccaaatttatcaaagaattgagagttattgagagtgggccacactgtgaa120

aattcagaaatcattgttaagcttaccaatggaaacgaggtctgcctaaaccccaaggaa180

aagtgggtgcagaaggttgtgcaggtatttgtgaagagagctgagaagcaagatccatga240

<210>6

<211>79

<212>prt

<213>bostaurus（瘤牛）

<400>6

alavalleuserargmetserthrgluleuargcysglncysilelys

151015

thrhisserthrprophehisprolyspheilelysgluleuargval

202530

ilegluserglyprohiscysgluasnsergluileilevallysleu

354045

thrasnglyasngluvalcysleuasnprolysglulystrpvalgln

505560

lysvalvalglnvalphevallysargalaglulysglnasppro

657075

<210>7

<211>234

<212>dna

<213>homosapiens（智人）

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gcagttttgccaaggagtgctaaagaacttagatgtcagtgcataaagacatactccaaa60

cctttccaccccaaatttatcaaagaactgagagtgattgagagtggaccacactgcgcc120

aacacagaaattattgtaaagctttctgatggaagagagctctgtctggaccccaaggaa180

aactgggtgcagagggttgtggagaagtttttgaagagggctgagaattcataa234

<210>8

<211>77

<212>prt

<213>homosapiens（智人）

<400>8

alavalleuproargseralalysgluleuargcysglncysilelys

151015

thrtyrserlysprophehisprolyspheilelysgluleuargval

202530

ilegluserglyprohiscysalaasnthrgluileilevallysleu

354045

seraspglyarggluleucysleuaspprolysgluasntrpvalgln

505560

argvalvalglulyspheleulysargalagluasnser

657075

<210>9

<211>270

<212>dna

<213>gallusgallus（原鸡）

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gagaagcctgtcagcctgacttaccgatgcccctgtcgattcttcgagagcaacgtggcg120

agggccaacattaagcacctcaaaatcctttccactcccaactgctcgcttcagattgtt180

gcaaggctcaagagcaacagcaagcaagtgtgcattgatcccaagctaaaatggatccag240

gaatatctggagaaagctttaaacaagtaa270

<210>10

<211>89

<212>prt

<213>gallusgallus（原鸡）

<400>10

metaspleuargalaleualaleuleualaphealaleualavalile

151015

serleusergluglulysprovalserleuthrtyrargcysprocys

202530

argphephegluserasnvalalaargalaasnilelyshisleulys

354045

ileleuserthrproasncysserleuglnilevalalaargleulys

505560

serasnserlysglnvalcysileaspprolysleulystrpilegln

65707580

glutyrleuglulysalaleuasnlys

85

<210>11

<211>351

<212>dna

<213>susscrofa（山猪）

<400>11

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gagaaaccggtcagcctgagctacagatgcccttgccgattctttgagagccacgttgcc120

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gaatacctggagaaagctttaaacaaacccagtcccactctctcgggcctgacctctgcc300

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<210>12

<211>116

<212>prt

<213>susscrofa（山猪）

<400>12

metglyvallysvalleualavalleualaleuvalleuthralaleu

151015

cysleuseraspglulysprovalserleusertyrargcysprocys

202530

argphephegluserhisvalalaargalaasnilelyshisleulys

354045

ileleuasnthrproasncysalaleuglnilevalalaargleulys

505560

serasnasnargglnvalcysileaspprolysleulystrpilegln

65707580

glutyrleuglulysalaleuasnlysproserprothrleusergly

859095

leuthrseralaleuglyserserleualaserthrthrvalglyile

100105110

thrserargser

115

<210>13

<211>270

<212>dna

<213>bostaurus（瘤牛）

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gcaaggctgaagaacaacaataggcaagtgtgcattgacccgaaattgaagtggattcag240

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<210>14

<211>89

<212>prt

<213>bostaurus（瘤牛）

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metaspalalysvalphevalvalleualaleuvalleuthralaleu

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cysleuseraspalalysprovalserleusertyrargcysprocys

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argphephegluserhisvalalalysalaasnvallyshisleulys

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ileleuasnthrproasncysserleuglnilevalalaargleulys

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asnasnasnargglnvalcysileaspprolysleulystrpilegln

65707580

glutyrleuasplysalaleuasnlys

85

<210>15

<211>270

<212>dna

<213>homosapiens（智人）

<400>15

atgaacgccaaggtcgtggtcgtgctggtcctcgtgctgaccgcgctctgcctcagcgac60

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<211>89

<212>prt

<213>homosapiens（智人）

<400>16

metasnalalysvalvalvalvalleuvalleuvalleuthralaleu

151015

cysleuseraspglylysprovalserleusertyrargcysprocys

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argphephegluserhisvalalaargalaasnvallyshisleulys

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<212>dna

<213>musmusculus（小鼠）

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gagtacctggagaaagctttaaacaagtaa270

<210>18

<211>89

<212>prt

<213>musmusculus（小鼠）

<400>18

metaspalalysvalvalalavalleualaleuvalleualaalaleu

151015

cysileseraspglylysprovalserleusertyrargcysprocys

202530

argphephegluserhisilealaargalaasnvallyshisleulys

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ileleuasnthrproasncysalaleuglnilevalalaargleulys

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85

<210>19

<211>819

<212>dna

<213>gallusgallus（原鸡）

<400>19

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ctcttctgtttatatcttcacatgaagatggataagatggaagaggtgttgagtttaaat180

gaagattacatctttctgagaaaagtgcagaaatgtcagacgggagaagatcagaagtcg240

acattattggactgtgaaaaagttctaaaaggcttccaggacctccaatgcaaggatagg300

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acgcacagcacctccacggctctctgtgagctccagtccatccgggagggcggtgtcttc720

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aaccctggcaacacctactttggcatgttcaagctgtag819

<210>20

<211>272

<212>prt

<213>gallusgallus（原鸡）

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metasnglualatyrserproalaalaproargprometglyserthr

151015

serproserthrmetlysmetphemetcyspheleuservalphemet

202530

valvalglnthrileglythrvalleuphecysleutyrleuhismet

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lysmetasplysmetglugluvalleuserleuasngluasptyrile

505560

pheleuarglysvalglnlyscysglnthrglygluaspglnlysser

65707580

thrleuleuaspcysglulysvalleulysglypheglnaspleugln

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cyslysaspargthralaserglugluleuprolyspheglumethis

100105110

argglyhisgluhisprohisleulysserargasngluthrserval

115120125

alagluglulysargglnproilealathrhisleualaglyvallys

130135140

serasnthrthrvalargvalleulystrpmetthrthrsertyrala

145150155160

prothrserserleuilesertyrhisgluglylysleulysvalglu

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lysalaglyleutyrtyriletyrserglnvalserphecysthrlys

180185190

alaalaalaseralaprophethrleutyriletyrleutyrleupro

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metglugluaspargleuleumetlysglyleuaspthrhisserthr

210215220

serthralaleucysgluleuglnserilearggluglyglyvalphe

225230235240

gluleuargglnglyaspmetvalphevalasnvalthraspserthr

245250255

alavalasnvalasnproglyasnthrtyrpheglymetphelysleu

260265270

<210>21

<211>786

<212>dna

<213>susscrofa（山猪）

<400>21

atgatcgaaacgtacagccaaccttcgccccgctctgtggccgctggaccacccgtcagt60

atgaaaatctttatgtatttacttactgtttttcttatcacccagatgattgggtcagca120

ctttttgcagcgtaccttcacagaagattggacaagatagaagatgaaaggaatcttcat180

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<210>22

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<212>prt

<213>susscrofa（山猪）

<400>22

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151015

proprovalsermetlysilephemettyrleuleuthrvalpheleu

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leuleuasncysglugluileargserglnphegluaspleuvallys

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100105110

methislysglyaspglnaspproglnilealaalahisvalileser

115120125

glualaserserlysthralaservalleuglntrpalaprolysgly

130135140

tyrtyrthrleuserthrasnleuvalthrleugluasnglyarggln

145150155160

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180185190

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210215220

leuglyglyvalphegluleuglnproglyalaservalphevalasn

225230235240

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245250255

glyleuleulysleu

260

<210>23

<211>786

<212>dna

<213>bostaurus（瘤牛）

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caatccattcacttaggaggagtctttgaattgcaatcgggtgcttcggtgtttgtcaat720

gtgactgatccaagtcaagtgagccacgggacgggcttcacatcatttggcttactcaaa780

ctctga786

<210>24

<211>261

<212>prt

<213>bostaurus（瘤牛）

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metilegluthrtyrserglnproserproargservalalathrgly

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proprovalsermetlysilephemettyrleuleuthrvalpheleu

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methislysglyaspglngluproglnilealaalahisvalileser

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glualaserserlysthrthrservalleuglntrpalaprolysgly

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tyrtyrthrleuserasnasnleuvalthrleugluasnglylysgln

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leualavallysargglnglyphetyrtyriletyrthrglnvalthr

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alaasnthrhisserserserlysprocysglyglnglnserilehis

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glyleuleulysleu

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<212>dna

<213>homosapiens（智人）

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atgatcgaaacatacaaccaaacttctccccgatctgcggccactggactgcccatcagc60

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<212>prt

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phecysserasnargglualaserserglnalapropheilealaser

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alaasnthrhisserseralalysprocysglyglnglnserilehis

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260

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<212>dna

<213>musmusculus（小鼠）

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tga783

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<212>prt

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aspilethrleuasnlysgluglulyslysgluasnserpheglumet

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glnargglyaspgluaspproglnilealaalahisvalvalserglu

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alaasnserasnalaalaservalleuglntrpalalyslysglytyr

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thrvallysarggluglyleutyrtyrvaltyrthrglnvalthrphe

165170175

cysserasnarggluproserserglnargpropheilevalglyleu

180185190

trpleulysproserserglysergluargileleuleulysalaala

195200205

asnthrhisserserserglnleucysgluglnglnservalhisleu

210215220

glyglyvalphegluleuglnalaglyalaservalphevalasnval

225230235240

thrglualaserglnvalilehisargvalglypheserserphegly

245250255

leuleulysleu

260

<210>29

<211>429

<212>dna

<213>gallusgallus（原鸡）

<400>29

atgatgtgcaaagtactgatctttggctgtatttcggtagcaatgctaatgactacagct60

tatggagcatctctatcatcagcaaaaaggaaacctcttcaaacattaataaaggattta120

gaaatattggaaaatatcaagaacattcatctcgagctctacacaccaactgagacccag180

gagtgcacccagcaaactctgcagtgttacctgggagaagtggttactctgaagaaagaa240

actgaagatgacactgaaattaaagaagaatttgtaactgctattcaaaatatcgataag300

aacctcaagagtcttacgggtctaaatcacaccggaagtgaatgcaaggtctgtgaagct360

aacaacaagaaaaaatttcctgattttctccatgaactgaccaactttgtgagatatctg420

caaaaataa429

<210>30

<211>142

<212>prt

<213>gallusgallus（原鸡）

<400>30

metmetcyslysvalleuilepheglycysileservalalametleu

151015

metthrthralatyrglyalaserleuserseralalysarglyspro

202530

leuglnthrleuilelysaspleugluileleugluasnilelysasn

354045

ilehisleugluleutyrthrprothrgluthrglnglucysthrgln

505560

glnthrleuglncystyrleuglygluvalvalthrleulyslysglu

65707580

thrgluaspaspthrgluilelysglugluphevalthralailegln

859095

asnileasplysasnleulysserleuthrglyleuasnhisthrgly

100105110

serglucyslysvalcysglualaasnasnlyslyslyspheproasp

115120125

pheleuhisgluleuthrasnphevalargtyrleuglnlys

130135140

<210>31

<211>465

<212>dna

<213>susscrofa（山猪）

<400>31

atgtataagatgcagctcttgtgttgcattgcactaacccttgcactcatggcaaacggt60

gcacctacttcaagctctacaaagaacacaaagaaacaactggagccattgctgctggat120

ttacagttgcttttgaaggaagttaagaattacgagaatgctgatctctccaggatgctc180

acatttaaattttacatgcccaagcaggctacagaattgaaacaccttcagtgtttagta240

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gcaaatatcaaggaatcaatgaacaatatcaacgtaacagttttggaactaaagggatct360

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aaatggattaccttttgtcaaagcatctactcaacactgacttga465

<210>32

<211>154

<212>prt

<213>susscrofa（山猪）

<400>32

mettyrlysmetglnleuleucyscysilealaleuthrleualaleu

151015

metalaasnglyalaprothrserserserthrlysasnthrlyslys

202530

glnleugluproleuleuleuaspleuglnleuleuleulysgluval

354045

lysasntyrgluasnalaaspleuserargmetleuthrphelysphe

505560

tyrmetprolysglnalathrgluleulyshisleuglncysleuval

65707580

glugluleulysalaleugluglyvalleuasnleuglyglnserlys

859095

asnseraspseralaasnilelysglusermetasnasnileasnval

100105110

thrvalleugluleulysglysergluthrserpheglucysglutyr

115120125

aspaspgluthrvalthralavalglupheleuasnlystrpilethr

130135140

phecysglnseriletyrserthrleuthr

145150

<210>33

<211>405

<212>dna

<213>bostaurus（瘤牛）

<400>33

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ttacagttgcttttggagaaagttaaaaatcctgagaacctcaagctctccaggatgcat120

acatttgacttttacgcgcccaaggttaacgctacagaattgaaacatcttaagtgttta180

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tctgaaacaagattcacatgtgaatatgatgatgcaacagtaaacgctgtagaatttctg360

aacaaatggattaccttttgtcaaagcatctactcaacaatgact405

<210>34

<211>135

<212>prt

<213>bostaurus（瘤牛）

<400>34

alaprothrserserserthrglyasnthrmetlysgluvallysser

151015

leuleuleuaspleuglnleuleuleuglulysvallysasnproglu

202530

asnleulysleuserargmethisthrpheaspphetyralaprolys

354045

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505560

lysleuleuglugluvalleuasnleualaproserlysasnleuasn

65707580

proarggluilelysaspsermetaspasnilelysargilevalleu

859095

gluleuglnglysergluthrargphethrcysglutyraspaspala

100105110

thrvalasnalavalglupheleuasnlystrpilethrphecysgln

115120125

seriletyrserthrmetthr

130135

<210>35

<211>462

<212>dna

<213>homosapiens（智人）

<400>35

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tggattaccttttgtcaaagcatcatctcaacactgacttga462

<210>36

<211>153

<212>prt

<213>homosapiens（智人）

<400>36

mettyrargmetglnleuleusercysilealaleuserleualaleu

151015

valthrasnseralaprothrserserserthrlyslysthrglnleu

202530

glnleugluhisleuleuleuaspleuglnmetileleuasnglyile

354045

asnasntyrlysasnprolysleuthrargmetleuthrphelysphe

505560

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65707580

glugluleulysproleuglugluvalleuasnleualaglnserlys

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asnphehisleuargproargaspleuileserasnileasnvalile

100105110

valleugluleulysglysergluthrthrphemetcysglutyrala

115120125

aspgluthralathrilevalglupheleuasnargtrpilethrphe

130135140

cysglnserileileserthrleuthr

145150

<210>37

<211>500

<212>dna

<213>musmusculus（小鼠）

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atgcagctcgcatcctgtgtcacattgacacttgtgctccttgtcaacagcgcacccact60

tcaagctccacttcaagctctacagcggaagcacagcagcagcagcagcagcagcagcag120

cagcagcagcacctggagcagctgttgatggacctacaggagctcctgagcaggatggag180

aattacaggaacctgaaactccccaggatgctcaccttcaaattttacttgcccaagcag240

gccacagaattgaaagatcttcagtgcctagaagatgaacttggacctctgcggcatgtt300

ctggatttgactcaaagcaaaagctttcaattggaagatgctgagaatttcatcagcaat360

atcagagtaactgttgtaaaactaaagggctctgacaacacatttgagtgccaattcgat420

gatgagtcagcaactgtggtggactttctgaggagatggatagccttctgtcaaagcatc480

atctcaacaagccctcaata500

<210>38

<211>169

<212>prt

<213>musmusculus（小鼠）

<400>38

mettyrsermetglnleualasercysvalthrleuthrleuvalleu

151015

leuvalasnseralaprothrserserserthrserserserthrala

202530

glualaglnglnglnglnglnglnglnglnglnglnglnglnhisleu

354045

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505560

tyrargasnleulysleuproargmetleuthrphelysphetyrleu

65707580

prolysglnalathrgluleulysaspleuglncysleugluaspglu

859095

leuglyproleuarghisvalleuaspleuthrglnserlysserphe

100105110

glnleugluaspalagluasnpheileserasnileargvalthrval

115120125

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130135140

gluseralathrvalvalasppheleuargargtrpilealaphecys

145150155160

glnserileileserthrserprogln

165

<210>39

<211>672

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白之胺基酸序列

<400>39

gctctgtcgcaaggtaggacgctggtaaagatggggaatgagctgcggtgccagtgcatt60

agcactcattctaagttcatccaccctaaatccattcaagatgtgaagctgacgccaagc120

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ttgaaccccactgctccctgggtacagctgatcgtaaaggcacttatggccaaggctcag240

ctcaattctgatgcaccactggaagctgcggcaaaagaggcagctgcgaaggaagcggca300

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gaaatattggaaaatatcaagaacaagattcatctcgagctctacacaccaactgagacc420

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gaaactgaagatgacactgaaattaaagaagaatttgtaactgctattcaaaatatcgaa540

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gctaacaacaagaaaaaatttcctgattttctccatgaactgaccaactttgtgagatat660

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<210>40

<211>223

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白之胺基酸序列

<400>40

alaleuserglnglyargthrleuvallysmetglyasngluleuarg

151015

cysglncysileserthrhisserlyspheilehisprolysserile

202530

glnaspvallysleuthrproserglyprohiscyslysasnvalglu

354045

ileilealathrleulysaspglyarggluvalcysleuasnprothr

505560

alaprotrpvalglnleuilevallysalaleumetalalysalagln

65707580

leuasnseraspalaproleuglualaalaalalysglualaalaala

859095

lysglualaalaalalysalaserleuserseralalysarglyspro

100105110

leuglnthrleuilelysaspleugluileleugluasnilelysasn

115120125

lysilehisleugluleutyrthrprothrgluthrglnglucysthr

130135140

glnglnthrleuglncystyrleuglygluvalvalthrleulyslys

145150155160

gluthrgluaspaspthrgluilelysglugluphevalthralaile

165170175

glnasnileglulysasnleulysserleuthrglyleuasnhisthr

180185190

glyserglucyslysilecysglualaasnasnlyslyslysphepro

195200205

asppheleuhisgluleuthrasnphevalargtyrleuglnlys

210215220

<210>41

<211>990

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白之胺基酸序列

<400>41

gctctgtcgcaaggtaggacgctggtaaagatggggaatgagctgcggtgccagtgcatt60

agcactcattctaagttcatccaccctaaatccattcaagatgtgaagctgacgccaagc120

ggcccccactgcaagaatgttgaaatcatagctactctaaaggatggaagagaggtgtgc180

ttgaaccccactgctccctgggtacagctgatcgtaaaggcacttatggccaaggctcag240

ctcaattctgatgcaccactggaagctgcggcaaaagaggcagctgcgaaggaagcggca300

gcgaaacacatgaagatggataagatggaagaggtgttgagtttaaatgaagattacatc360

tttctgagaaaagtgcagaaatgtcagacgggagaagatcagaagtcgacattattggac420

tgtgaaaaagttctaaaaggcttccaggacctccaatgcagggataggacagccagtgag480

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acctactttggcatgttcaagctgtagtaa990

<210>42

<211>328

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白之胺基酸序列

<400>42

alaleuserglnglyargthrleuvallysmetglyasngluleuarg

151015

cysglncysileserthrhisserlyspheilehisprolysserile

202530

glnaspvallysleuthrproserglyprohiscyslysasnvalglu

354045

ileilealathrleulysaspglyarggluvalcysleuasnprothr

505560

alaprotrpvalglnleuilevallysalaleumetalalysalagln

65707580

leuasnseraspalaproleuglualaalaalalysglualaalaala

859095

lysglualaalaalalyshismetlysmetasplysmetglugluval

100105110

leuserleuasngluasptyrilepheleuarglysvalglnlyscys

115120125

glnthrglygluaspglnlysserthrleuleuaspcysglulysval

130135140

leulysglypheglnaspleuglncysargaspargthralaserglu

145150155160

gluleuprolyspheglumethisargglyhisgluhisprohisleu

165170175

lysserargasngluthrservalalagluglulysargglnproile

180185190

alathrhisleualaglyvallysserasnthrthrvalargvalleu

195200205

lystrpmetthrthrsertyralaprothrserserleuilesertyr

210215220

hisgluglylysleulysvalglulysalaglyleutyrtyriletyr

225230235240

serglnvalserpheargthrlysalaalaalaseralaprophethr

245250255

leutyriletyrleutyrleuprometglugluaspargleuleumet

260265270

lysglyleuaspthrhisseralaserthralaleucysgluleugln

275280285

serilearggluglyglyvalphegluleuargglnglyaspmetval

290295300

phevalasnvalthraspserthralavalasnvalasnproglyasn

305310315320

thrtyrpheglymetphelysleu

325

<210>43

<211>615

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白之胺基酸序列

<400>43

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acccaggagtgcacccagcaaactctgcagtgttacctgggagaagtggttactctgaag420

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tatctgcaaaaataa615

<210>44

<211>204

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白之胺基酸序列

<400>44

lysprovalserleuthrtyrargcysprocysargphephegluser

151015

asnvalalaargalaasnilelyshisleulysileleuserthrpro

202530

asncysserleuglnilevalalaargleulysserasnserlysgln

354045

valcysileaspprolysleulystrpileglnglutyrleuglulys

505560

alaleuasnlysglualaalaalalysglualaalaalalysgluala

65707580

alaalalysalaserleuserseralalysarglysproleuglnthr

859095

leuilelysaspleugluileleugluasnilelysasnlysilehis

100105110

leugluleutyrthrprothrgluthrglnglucysthrglnglnthr

115120125

leuglncystyrleuglygluvalvalthrleulyslysgluthrglu

130135140

aspaspthrgluilelysglugluphevalthralaileglnasnile

145150155160

glulysasnleulysserleuthrglyleuasnhisthrglyserglu

165170175

cyslysilecysglualaasnasnlyslyslyspheproasppheleu

180185190

hisgluleuthrasnphevalargtyrleuglnlys

195200

<210>45

<211>933

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白之胺基酸序列

<400>45

aagcctgtcagcctgacttaccgatgcccctgtcgattcttcgagagcaacgtggcgagg60

gccaacattaagcacctcaaaatcctttccactcccaactgctcgcttcagattgttgca120

aggctcaagagcaacagcaagcaagtgtgcattgatcccaagctaaagtggatccaggaa180

tatctggagaaagctttaaacaaggaagctgcggcaaaagaggcagctgcgaaggaagcg240

gcagcgaaacacatgaagatggataagatggaagaggtgttgagtttaaatgaagattac300

atctttctgagaaaagtgcagaaatgtcagacgggagaagatcagaagtcgacattattg360

gactgtgaaaaagttctaaaaggcttccaggacctccaatgcagggataggacagccagt420

gaggagttgccaaaatttgaaatgcacagaggtcatgagcacccccacttgaagagtagg480

aatgagacatctgtggcagaggagaagaggcagccgatcgcaacacacctggcaggggtg540

aagagcaacacaacagtgagagtgctgaagtggatgacgacgggctacgccccaacgagc600

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aacacctactttggcatgttcaagctgtagtaa933

<210>46

<211>309

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白之胺基酸序列

<400>46

lysprovalserleuthrtyrargcysprocysargphephegluser

151015

asnvalalaargalaasnilelyshisleulysileleuserthrpro

202530

asncysserleuglnilevalalaargleulysserasnserlysgln

354045

valcysileaspprolysleulystrpileglnglutyrleuglulys

505560

alaleuasnlysglualaalaalalysglualaalaalalysgluala

65707580

alaalalyshismetlysmetasplysmetglugluvalleuserleu

859095

asngluasptyrilepheleuarglysvalglnlyscysglnthrgly

100105110

gluaspglnlysserthrleuleuaspcysglulysvalleulysgly

115120125

pheglnaspleuglncysargaspargthralaserglugluleupro

130135140

lyspheglumethisargglyhisgluhisprohisleulysserarg

145150155160

asngluthrservalalagluglulysargglnproilealathrhis

165170175

leualaglyvallysserasnthrthrvalargvalleulystrpmet

180185190

thrthrsertyralaprothrserserleuilesertyrhisglugly

195200205

lysleulysvalglulysalaglyleutyrtyriletyrserglnval

210215220

serpheargthrlysalaalaalaseralaprophethrleutyrile

225230235240

tyrleutyrleuprometglugluaspargleuleumetlysglyleu

245250255

aspthrhisseralaserthralaleucysgluleuglnserilearg

260265270

gluglyglyvalphegluleuargglnglyaspmetvalphevalasn

275280285

valthraspserthralavalasnvalasnproglyasnthrtyrphe

290295300

glymetphelysleu

305

<210>47

<211>666

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白之胺基酸序列

<400>47

aagcctgtcagcctgacttaccgatgcccctgtcgattcttcgagagcaacgtggcgagg60

gccaacattaagcacctcaaaatcctttccactcccaactgctcgcttcagattgttgca120

aggctcaagagcaacagcaagcaagtgtgcattgatcccaagctaaagtggatccaggaa180

tatctggagaaagctttaaacaaggaagctgcggcaaaagaggcagctgcgaaggaagcg240

gcagcgaaaatcgcaacacacctggcaggggtgaagagcaacacaacagtgagagtgctg300

aagtggatgacgacgggctacgccccaacgagcagcttgatatcctaccatgaggggaag360

ctgaaggtggagaaagcagggctctactacatctactcacaagtcagcttctgcaccaag420

gcggcggcttcggcgccattcaccctctatatttatttgtacctccccatggaagaggac480

cggctcctgatgaagggacttgacacgcacagcacctccacggctctctgtgagctccag540

tccatccgggagggcggtgtcttcgagctgcggcagggcgacatggactttgtcaatgtg600

acggactcaacagcagtgaacgtcaaccctggcaacacctactttggcatgttcaagctg660

tagtaa666

<210>48

<211>220

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白之胺基酸序列

<400>48

lysprovalserleuthrtyrargcysprocysargphephegluser

151015

asnvalalaargalaasnilelyshisleulysileleuserthrpro

202530

asncysserleuglnilevalalaargleulysserasnserlysgln

354045

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