专利名称：生物可降解聚氨酯基因转染试剂的制备方法
技术领域：
本发明属于纳米生物材料技术领域，涉及一类可降解阳离子聚氨酯的制备方法及其作为转染试剂转染哺乳动物细胞株的应用。
背景技术：
基因治疗是将具有 治疗功能的基因输送到人体细胞，表达需要的功能蛋白治疗疾病的新方法。如何利用载体将外源基因安全准确有效地导入靶细胞是基因治疗成功的关键技术。目前重组病毒载体已被广泛的应用于体外基因转染和临床基因治疗，但其潜在的安全问题比如免疫原性、诱变及致肿瘤性仍然是一大亟需解决的问题。相比之下，非病毒基因载体如脂质体、聚合物和纳米粒子有更好的安全性，同时具有设计合成方便、花费低、载药量大及大批量合成等优点。但基于非降解聚合物的基因释放载体往往在具有较低的传染效率。近十年来，国内外聚合物基因释放载体的研究是研究热点。特别是生物可降解的聚合物基因载体，如可降解的聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚酰胺。双硫键在设计可降解聚合物基因载体中充当着重要的角色。在细胞外部，双硫键具有很高的化学稳定性，但在进入细胞后便会被降解，因此将双硫键引入阳离子聚合物是设计高效低毒基因载体的一大进步。聚氨酯是一类在主链上含有氨基甲酸酯键(urethane linkage)的聚合物。在过去十年里，聚氨酯在生物医学领域，特别是药物缓释和组织工程方面得到广泛的应用。目前，含有双硫键的阳离子聚氨酯的合成还没有报到。并且含有双硫键的阳离子聚氨酯作为基因释放载体的研究也未见报道。参考文献:1.Thomas CE，Ehrhardt A, Kay MA.Progress and problems with the use ofviral vectors for gene therapy.Nat Rev Genet2003;4:346-358.
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发明内容
本发明的目的在于为克服现有技术的缺陷而提供一种含有双硫键的阳离子聚氨酯及其制备方法和用途。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:首先合成单体二硫代二乙基对硝基苯碳酸酯。它和含有叔胺基团的二伯胺化合物通过逐步聚合得到含有双硫键和可质子化胺基的聚氨酯。该方法具有制备简单、反应条件温和的优点。一种含有双硫键的阳离子聚氨酯，其结构式如式(I)所示:
权利要求
1.一种含有双硫键的阳离子聚氨酯，其特征在于:其结构式如式(I)所示:
2.一种上述权利要求1所述的含有双硫键的阳离子聚氨酯的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)通过取代反应合成出二硫代二乙基对硝基苯基碳酸酯 将二硫代二乙二醇和吡啶加入到有机溶剂中搅拌溶解，然后将对硝基苯基氯甲酸酯加入到反应器内，进行反应； (2)反应结束后将混合物洗涤，然后蒸掉有机溶剂后，用硅胶柱提纯得到二硫代二乙基对硝基苯基碳酸酯； (3)制备含有双硫键的聚氨酯 将二硫代二乙基对硝基苯基碳酸酯和二伯胺化合物加入到有机溶剂中进行反应； (4)反应完毕后，加入去离子水稀释，每Immol反应物加入20mL重蒸水，用IM盐酸调节PH值到6，然后用透析袋透析、冷冻干燥，得到含有双硫键的聚氨酯。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于:所述的步骤(I)中二硫代二乙二醇与吡啶的按摩尔比为1: (Γ3);搅拌溶解10-30分钟； 或所述的步骤(1)中对硝基苯基氯甲酸酯与二硫代二乙二醇的摩尔比为1: (Γ5)0
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于:所述的步骤(I)或(3)中的有机溶剂为三氯甲烷或二甲基甲酰胺。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于:所述的步骤(I)中对硝基苯基氯甲酸酯加入到反应器内，室温反应24-36小时。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于:所述的步骤(2)中，反应结束后，混合物用磷酸氢二钠溶液洗涤1-3次，再用去离子水洗涤。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于:所述的步骤(3)中二伯胺类化合物选自氨基酸、1，4-双(3-氨基丙基)-哌嗪、N-甲基-2，2’ - 二氨基二乙胺、双(2-氨基乙基)2-(叔丁氧羰基氨基)乙基胺或1，4-哌嗪二乙胺； 或所述的步骤(3)中，二硫代二乙基对硝基苯基碳酸酯与二伯胺化合物的摩尔比为1:1，室温反应5-9天。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于:所述的步骤(4)中，透析袋的截留分子量为 1000-3000。
9.一种上述权利要求1所述的含有双硫键的阳离子聚氨酯作为基因转染试剂的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于:所述的用途包括如下步骤: (1)将培养至85-90%融合的所需细胞用胰蛋白酶消化、计数，并以4-15X104/孔接种24孔板，置于培养箱中培养约24h，至细胞达50-70%融合； (2)按N/P比为2.5、5、10、15、20、40、80将不同浓度比例的聚氨酯与pCMV_GFP质粒进行复合，室温复合半个小时； 转染时，将孔板中的细胞培养基吸除，以PBS缓冲液冲洗细胞，更换新鲜无血清培养基于培养箱中培养Ih,,随后向孔板中滴加质粒复合物，充分混勻后置培养箱培养l_4h ； (3)吸去培养基，加入含10%胎牛血清和100U/ml双抗的培养基，置培养箱培养，44_48h后用倒置荧光显微镜观 察细胞绿色荧光表达情况并拍照。
全文摘要
本发明属于纳米生物材料技术领域，涉及一类可降解阳离子聚氨酯的制备方法及其作为转染试剂转染哺乳动物细胞株的应用。其结构式如式(1)所示其中，R基团选自聚合度n为200~400。本发明方法中使用的反应试剂无毒无污染、成本低廉，具有可推广性；合成反应中无需添加特殊的缩合剂及催化剂、反应条件温和、副反应少；本方法便于引入双硫键和胺基官能团，可以得到结构多样性的聚氨酯。另外，本发明提供给的聚氨酯生物相容性好，细胞毒性低。
文档编号C08G71/00GK103087314SQ20131004102
公开日2013年5月8日 申请日期2013年2月1日 优先权日2013年2月1日
发明者娄博, 林超, 程建, 宋焱艳 申请人:同济大学