专利名称：一种多孔磁性载体及制备方法及固定污染物降解菌的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于污水生物处理技术领域，涉及一种多孔磁性载体及制备方法及固定污染物降解菌的应用。
背景技术：
微生物固定化技术，是指利用化学的或者物理的手段和方法，将游离微生物限制或定位在某一特定空间范围内，保留其固有的催化活性，以利于提高反应器内微生物的数量，提高系统的处理能力和适应性，且能够被重复和连续使用的现代生物工程技术。在这一技术的应用中，固定载体的选择是非常关键的。随着高分子材料学的发展，许多天然或人工合成的高分子凝胶载体被尝试用于微生物固定技术中，这些材料大多具有对微生物细胞无毒性，传质性能好，性质稳定，有较大的比表面积，机械强度高等优点。但是，微生物固定技术只是将易于流失的微生物更多地截留在反应器中，依靠微生物数量上的优势来降低污泥负荷，提高处理能力，并没有从本质上提高微生物自身的活性和代谢能力；而且，由于微生物的敏感性，在固定过程中，不同载体材料和交联剂都会对微生物的活性造成不同程度的影响。随着微生物学的不断发展，研究者开始致力于从不同环境中筛选出具有各种特殊功能的高效菌株，并制备出生物制剂投加到污水处理反应器中，以期提高污泥的整体活性和系统的处理能力，这被称之为微生物强化技术。进入21世纪以来，基因工程技术的发展日新月异，研究者可以利用DNA重组等手段构建出“超级细菌”并将之用于污水处理的生物强化技术中。无论是筛选得到的高效菌还是人工构建的基因工程菌，其中的大多数都能在实验室环境中表现出良好的污染物去除能力，但当将其应用到实际的污水处理工艺中时，便会遇到许多困难和障碍，如微生物制剂流失严重，需要连续大量投加；对系统处理能力的提高效果不显著等。这主要是由于，实验室中培育出的微生物种群不能很快地适应实际处理构筑物的新环境，并且要与原有的“土著”微生物之间进行竞争性生长，在这一过程中大多数微生物制剂都会处于劣势地位，其代谢能力受到严重的限制，不能获得足够的基质来促进自身种群的繁殖，而逐渐被淘汰或消亡。其中后者是更为根本和主要的原因。早期研究者发现弱磁场对活微生物可以产生正的磁生物效应而有效提高微生物代谢活性，加快了污染物降解的生化反应速率，从而提高了整体系统的处理效率。但在以往的应用中，只是投加单一的磁粉，虽然有些磁粉的比表面积较大，但其只能在偏酸性环境中才能发挥对带负电的菌胶团的吸附作用，且其吸附性能较弱而不能高效地固定和催化微生物活性；特别是在长期的磁场作用下，这些磁粉会产生记忆性磁性，易于在污泥中发生团聚，而失去其原有的功效。纳米级的磁性微粒具有对外加磁场的响应性，在外磁场作用下可以与液相基质分离，但撤去外加磁场，磁性微粒不会因被磁化而发生团 聚，无磁记忆性，可以重新分散在液相基液中。磁颗粒的这些特性恰好克服了传统磁粉在污泥强化应用中的不足，表现出了极大的应用价值。但磁颗粒为立方晶石结构，表面光滑无孔，且其粒径过小无法直接作为载体用于微生物的固定化。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种多孔磁性载体。本发明的第二个目的是提供一种多孔磁性载体的制备方法。本发明的第三个目的是提供一种多孔磁性载体的用途。本发明的技术方案概述如下:一种多孔磁性载体的制备方法，其特征是包括如下步骤:量取50mL质量浓度为7.50%的聚乙二醇6000水溶液加入装有冷凝管和搅拌装置的三颈瓶中，加热到60°C，加入12g粒径为120-200nm的Fe3O4磁颗粒，通入N2,加入50mL的无水乙醇，保持在60°C下搅拌30min，升高温度到75°C，滴加溶有2.50g过氧化苯甲酰的IOmL苯乙烯，再滴加2mL 二乙烯基苯、ImL甲基丙烯酸，7.50mL甲苯和7.50mL正庚烷，保持在400r/min下，搅拌3h，将所获得的微球装入索氏提取器中，用丙酮作溶剂，抽提48h ;再将抽提好的微球放入烘箱中，60 °C下干燥24h，得到多孔磁性载体。上述方法制备的多孔磁性载体。多孔磁性载体固定污染物降解菌的应用，包括如下步骤:( I)在液体培养基中接种污染物降解菌，加入上述多孔磁性载体使多孔磁性载体的质量浓度为0.5%，30°C培养72小时；(2)将步骤(I)获得的混合物投加到含有接种活性污泥的污水生物处理反应器中。所述污染物降解菌优选为脱氮鲍曼氏菌、蜡状芽孢杆菌、气单胞菌属或无色杆菌属。本发明的优点:实验证明，本发明的方法制备的多孔磁性载体外观呈黑色粒状，其表面微观结构可见形成了大量的孔隙结构，孔径基本分布在ΙΟμπι以下的范围内，比较适合于各种微生物的栖息与生长繁殖。用于固定微生物时，在其表面和孔洞内可聚积大量的微生物。因而，微生物聚集量大、生长繁殖快，易于物质传递与交换，是很好的微生物固定化载体。多孔磁性载体粒径(D [4，3])为196.90 μ m,比表面积为0.1709m2/g，其中50-500 μ m粒径在总体产物中所占比例约为80%，在这一粒径范围内的多孔磁性载体均能满足微生物聚集生长的要求，因此再用孔径为50 μ m和500 μ m的细胞筛将其余粒径的微磁载体筛除后，可将其全部用于后期高效脱氮菌的吸附和固定。磁响应性是评价本多孔磁性载体的重要指标。用物理性能测试仪重复测定所得到的载体在不同磁场强度下的磁滞回线。结果可见，多孔磁性载体的矫顽力均为零，说明其呈现出典型的超顺磁性特征，这也表明磁性微球属于铁磁性材料。通过对比磁颗粒和多孔磁性载体的X射线衍射测定，我们所选用的磁流体和和制备出的多孔磁性载体，峰位基本没有发生变化，基本没有杂峰；磁颗粒晶体属立方晶系尖晶石结构，特征衍射峰很明显地出现在2 Θ =18.3° ,30.1° ,35.4° ,37.0°、43。1°、57。1°、62。6°和74.1°处，这些衍射峰分别对应于磁粒子的各晶面的特征。表明在制备过程中磁粒子的晶体结构没有改变，且没有发生团聚现象。而多孔磁性载体的峰图中，除与磁颗粒相同的特征衍射峰外，在2 θ =18.2°出现的强衍射峰，则是非晶态聚苯乙烯衍射峰。这些结果表明在本制备方法中，磁性粒子与聚苯乙烯之间并未发生任何化学反应，磁颗粒只是被包裹在聚苯乙烯高分子微球内部，因而，所制备的多孔磁性载体仍然具有良好的超顺磁性。本发明的多孔磁性载体，在细菌培养初期通过微磁载体表面的吸附与固定作用，会驱使细菌易于聚集在磁颗粒为核心的载体表面及内部孔洞中；使得其较为牢固地保留在载体内，同时提高了细菌密度，避免了菌体流失；并且，由于磁性载体先被用于在菌液中固定高效菌，因此这些菌群距离中心磁核最近，所受到的磁生物效应最为强烈，这有利于提高其生物代谢活性，增强其竞争能力。
图1为多孔磁性载体的表面结构(放大倍数为4000倍)。图2为多孔磁性载体的粒径分布。图3为300Κ下微磁载体的磁滞留回线。图4为XRD谱图(a:多孔磁性载体XRD谱图；b:磁流体XRD谱图)。图5为磁粒子磁粒子(magnetite, Fe+2Fe2+304)的宽衍射峰标准峰图。图6为脱氮鲍曼氏菌与多孔磁性载体的结合(放大倍数为8000倍)图7反应器工艺流程示意图。图8两反应器对有机物的去除效果比较图9两反应器对 NH4+-N的去除效果比较图10两反应器中脱氮鲍曼氏菌与总细菌16S rDNA基因拷贝数变化
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。实施例1材料与设备:苯乙烯(St)，过氧化苯甲酰(ΒΡ0)，甲基丙烯酸(MAA)，二乙烯基苯(DVB)，聚乙二醇-6000 (PEG)，均为优级纯，无水乙醇(分析纯)，购自国药集团试剂公司，数显恒速搅拌器，购自江苏金坛仪器厂。量取50mL质量浓度为7.50%的聚乙二醇6000水溶液加入装有冷凝管和搅拌装置的三颈瓶中，加热到60°C，加入12g平均粒径为150nm的Fe3O4磁颗粒，通入N2,加入50mL的无水乙醇，保持在60°C下搅拌30min，升高温度到75°C，滴加溶有2.50g过氧化苯甲酰的IOmL苯乙烯，再滴加2mL 二乙烯基苯、ImL甲基丙烯酸，7.50mL甲苯和7.50mL正庚烷，保持在400r/min下，搅拌3h，将所获得的微球装入索氏提取器中，用丙酮作溶剂，抽提48h ;再将抽提好的微球放入烘箱中，60°C下干燥24h，得到多孔磁性载体。实验证明=Fe3O4磁颗粒的平均粒径选120nm、180nm或200nm,其它同本实施例，也可以制备出相应的多孔磁性载体。上述实施例1制备的多孔磁性载体的表征
表面形态与结构:取多孔磁性载体置于防脱玻片上，用离子溅射仪对样品表面喷金后放入场发射扫描电镜(FEI NanoSem430)中进行观察。见图1多孔磁性载体粒径分布:取制备好的多孔磁性载体0.5g采用激光粒度分析仪(Malvern Mastersizer, Malvern Instruments Ltd, UK)对其粒径分布进行测定。见图 2磁响应性与饱和磁强度:取0.5g冷冻干燥后的多孔磁性载体，在300K下，用物理性能测试仪(PPMS-9, Quantum Design Inc.USA)见图 3微磁载体晶体结构:取制备并冷冻干燥后的磁流体和多孔磁性载体各0.5g，采用X射线粉末衍射仪(D/MAX-2500，Japan)分析其晶体结构；参数设置为2 Θ ,5-90°，6° /min。本研究中，在N2保护及一定搅拌速度下，以乙醇/水混合液为分散介质，苯乙烯为单体，过氧化苯甲酰为引发剂，聚乙二醇为稳定剂，二乙烯基苯为交联剂，以甲苯和正庚烷为致孔剂，制备出了多孔磁性载体。制备而成的多孔磁性载体外观呈黑色粒状，其表面微观结构如图1所示，由图1可见，在多孔磁性载体表面形成了大量的孔隙结构，孔径基本分布在ΙΟμπι以下的范围内，比较适合于各种微生物的栖息与生长繁殖。用于固定微生物时，在其表面和孔洞内可聚积大量的微生物。因而，微生物聚集量大、生长繁殖快，易于物质传递与交换，是很好的微生物固定化载体。多孔磁性载体粒径分布范围如图2所示，结果表明:所制得的载体平均粒径(D[4，3])为196.90 μ m,比表面积为0.1709m2/g，其中50-500 μ m粒径在总体产物中所占比例约为80%，在这一粒径范围内的多孔磁性载体均能满足微生物聚集生长的要求，因此再用孔径为50 μ m和500 μ m的细 胞筛将其余粒径的微磁载体筛除后，可将其全部用于后期高效脱氮菌的吸附和固定。磁响应性是评价本多孔磁性载体的重要指标。用物理性能测试仪重复测定所得到的载体在不同磁场强度下的磁滞回线如图3。结果可见，多孔磁性载体的矫顽力均为零，说明其呈现出典型的超顺磁性特征，这也表明磁性微球属于铁磁性材料。磁颗粒和多孔磁性载体的X射线衍射测定结果如图4所示的。图典型的磁粒子(magnetite，Fe+2Fe2+304)的宽衍射峰标准峰图。通过图4与图5的对比可见，我们所选用的磁流体和和制备出的多孔磁性载体，峰位基本没有发生变化，基本没有杂峰；磁颗粒晶体属立方晶系尖晶石结构，特征衍射峰很明显地出现在2 Θ =18.3°、30.1°、35.4° ,37.0°、43。1°、57。1°、62。6°和74.1°处，这些衍射峰分别对应于磁粒子的各晶面的特征。表明在制备过程中磁粒子的晶体结构没有改变，且没有发生团聚现象。而多孔磁性载体的峰图中，除与磁颗粒相同的特征衍射峰外，在2 Θ =18.2°出现的强衍射峰，则是非晶态聚苯乙烯衍射峰。这些结果表明在本制备工艺中，磁性粒子与聚苯乙烯之间并未发生任何化学反应，磁颗粒只是被包裹在聚苯乙烯高分子微球内部，因而，所制备的多孔磁性载体仍然具有良好的超顺磁性。实施例2多孔磁性载体与脱氮鲍曼氏菌(Bowmanella denitrificans,菌株保藏编号:MCCC1A00162)的结合配置2瓶500mL液体培养基。
液体培养基:(NH4) 2S040.25g，琥珀酸钠1.08g, g，维氏盐溶液25mL，加蒸馏水溶解至500mL。其中:维氏盐溶液:K2HP045.0g, MgSO4.7Η202.5g，NaC12.5g，FeS04.7H200.05g，MnS04.4H200.05g，溶解后加水定容至1000mL。其中第I瓶中投加实施例1制备的多孔磁性载体2.5g。等量地向2个瓶液体培养基中分别接种脱氮鲍曼氏菌，30°C、120r/min摇床培养72h。取培育后负载有脱氮鲍曼氏菌的多孔磁性载体置于2.5%戊二醛固定液中，4°C下固定12h,乙醇梯度脱水后置于场发射扫描电镜(FEI Nanosem430)中进行观察。结果如图6所示。在载体内部孔洞与脱氮鲍曼氏菌结合处可见，大量的细菌菌附着在其孔洞中生长繁殖。这也说明本载体为微生物的固定和生长提供了优良的环境。实施例3多孔磁性载体与脱氮鲍 曼氏菌(Bowmanella denitrificans,菌株保藏编号:MCCC1A00162)结合后的实际应用效果(I)反应器的构建平行运行两个SBR反应器，小试SBR反应器由有机玻璃制成，总高0.6m,内径90mm,总体积3.8L,总有效体容积为3.5L。试验流程示意图如图7所示。图中:1进水管，2止回阀，3反应器，4液位计，5搅拌器，6PLC控制器，7电磁场装置，8微孔曝气器，9空气流量计，10输气管路，11空气压缩机，12电磁阀，13出水管，14PLC控制线路。试验中的C0D&、NH4+-N分析方法的选取主要参照《水和废水监测分析方法》第四版(国家环保总局，2002)。污水由反应器底部的进水管I经止回阀2进水，由反应器下部出水管13出水。进水管1、出水管13分别由PLC控制器6通过PLC控制线路14启动液位计4控制出水口电磁阀12进行操作。曝气由PLC控制器6控制空气压缩机11，加压气体经设置在输气管路10上的空气流量计9送至反应器3内的微孔曝气器8，从反应器底部供气，为系统提供溶解氧和水力剪切力。曝气量通过空气流量计9进行计量和调节。每周期具体运行参数为:进水2min —厌氧搅拌90min —曝气240min —静置沉淀7min —出水5min —闲置16min。共6h为一周期，每天运行4周期。接种污泥取自某污水处理厂好氧池回流污泥，进水为实验室中人工配水，具体组成成分见表I。容积负荷约为0.8kgT0C/(m3.d)。在底部采用微孔曝气的方式对污泥混合液进行搅拌和充氧，曝气量为0.10 0.20m3.1T1。分别向两反应器中投加某污水处理厂好氧池回流污泥，投加后的污泥浓度为
3.0g/L。并向2反应器中分别投加上述培育好的2瓶脱氮鲍曼氏菌，将含有多孔磁性载体的反应器标记为SBR-M，另一反应器标记为SBR-S。表I人工配水的主要组分及浓度(mg.L-1)
权利要求
1.一种多孔磁性载体的制备方法，其特征是包括如下步骤: 量取50mL质量浓度为7.50%的聚乙二醇6000水溶液加入装有冷凝管和搅拌装置的三颈瓶中，加热到60°C，加入12g粒径为120-200nm的Fe3O4磁颗粒，通入N2,加入50mL的无水乙醇，保持在60°C下搅拌30min，升高温度到75°C，滴加溶有2.50g过氧化苯甲酰的IOmL苯乙烯、2mL 二乙烯基苯、ImL甲基丙烯酸，7.50mL甲苯和7.50mL正庚烷，保持在400r/min下，搅拌3h，将所获得的微球装入索氏提取器中，用丙酮作溶剂，抽提48h ;再将抽提好的微球放入烘箱中，60°C下干燥24h，得到多孔磁性载体。
2.权利要求1的方法制备的多孔磁性载体。
3.权利要求2的多孔磁性载体固定污染物降解菌的应用，其特征是包括如下步骤: (1)在液体培养基中接种污染物降解菌，加入权利要求2的多孔磁性载体使多孔磁性载体的质量浓度为0.5%，30°C培养72小时； (2)将步骤(I)获得的混合物投加到含有接种活性污泥的污水生物处理反应器中。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述污染物降解菌为脱氮鲍曼氏菌、蜡状芽孢杆菌、气单胞菌 或无色杆菌属。
全文摘要
本发明公开了一种多孔磁性载体及制备方法及固定污染物降解菌的应用，制备方法为取聚乙二醇6000水溶液加入三颈瓶中，加热，加入纳米Fe3O4磁颗粒，通N2，加无水乙醇，搅拌，升温，滴加溶有过氧化苯甲酰的苯乙烯、二乙烯基苯、甲基丙烯酸，甲苯和正庚烷，搅拌，将获得的微球用丙酮作溶剂抽提；将抽提好的微球干燥，得到多孔磁性载体。本发明的多孔磁性载体，会驱使细菌聚集在磁颗粒为核心的载体表面及内部孔洞中；使其牢固地保留在载体内，提高了细菌密度，避免了菌体流失；由于磁性载体先被用于在菌液中固定高效菌，因此这些菌群距离中心磁核最近，所受的磁生物效应最为强烈，利于提高其生物代谢活性，增强其竞争力。
文档编号C08K3/22GK103204964SQ20131005687
公开日2013年7月17日 申请日期2013年2月22日 优先权日2013年2月22日
发明者张斌, 王景峰, 李君文 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所