落叶松miR166a在调控植物发育中的应用的制造方法与工艺

本发明属于植物分子生物学技术领域，涉及一种落叶松miR166a在调控植物发育中的应用，特别涉及一种落叶松miR166a在促进植物侧根发育中的应用。

背景技术：
落叶松（Larixspp.）是我国北方重要的速生造林用材针叶树种，可用于木材和造纸原料。从全球来看，落叶松天然分布在温带山区、寒温带的平原以及高山气候区，前两带大致在北纬48°～60°之间，具有高纬度高海拔的特点。我国天然分布的落叶松有10个种和5个变种。它们分别分布于西北、华北、华中、东北和西南的山地和高山地区。大力开展落叶松的科学研究，对于我国北方生态文明建设、推动国民经济的发展具有重要意义。落叶松作为我国重要的针叶速生造林用材树种，对其进行大量繁育和遗传改良，不经能够满足人们对木材原料日益增长的需求，也能为我国生态文明建设做出巨大贡献。MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20～25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。植物miRNA的目标基因大多是植物体内的转录因子，在植物的生长发育、环境应答和抗病响应等诸多方面起着广泛的调控作用。通过正向遗传筛选、直接克隆、计算机预测和EST序列分析，目前已经在67种植物中鉴定出约6000个miRNA（miRBase19.0）。随着高通量测序技术的发展和测序成本的下降，越来越多的植物中miRNA在基因组水平被生物信息学预测出来。而目前研究的最大挑战之一是，如何验证单个的miRNA及其对应的目标基因在生物体内发挥的功能。

技术实现要素：
本发明的目的是提供一种落叶松miR166a的新用途。本发明所提供的新用途，具体为如下（1）-（4）中任一所示的核酸分子在促进植物生长发育中的应用：（1）序列表中序列1所示的RNA分子；（2）序列表中序列2所示的RNA分子（落叶松前体miR166a）；（3）序列表中序列3所示的DNA分子（落叶松前体miR166a的全长cDNA，命名为LaMIR166a基因）；（4）序列表中序列3的第27-539位所示的DNA分子。在上述应用中，所述促进植物生长发育具体可体现在如下（A）-（C）中的至少一种：（A）促进植物侧根的发育；（B）提高植物生长速率；（C）提高植物成活率。在上述应用中，（A）中所述的“促进植物侧根发育”为促进植物侧根的发生；（B）中所述的“提高植物生长速率”为提高组培苗（如在生根培养基上培养4个月的组培苗）的生长速率；（C）中所述的“提高植物成活率”为提高植物移栽后的成活率。如下（1）-（4）中任一所示的核酸分子在选育具有如下（I）-（III）中的至少一种的植物品种中的应用也属于本发明的保护范围：（1）序列表中序列1所示的RNA分子（落叶松成熟miR166a）；（2）序列表中序列2所示的RNA分子（落叶松前体miR166a）；（3）序列表中序列3所示的DNA分子（LaMIR166a基因）；（4）序列表中序列3的第27-539位所示的DNA分子。（I）侧根根系发达；（II）植株生长速率提高；（III）植株成活率提高。在实际应用中，选育具有如上所述（I）-（III）中的至少一种的植物品种时，需将所述（1）-（4）中任一所示的核酸分子表达量较高的胚性细胞系，作为获得目的转基因的细胞系。本发明的再一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可包括如下a）和b）的步骤：a）向目的植物中导入如下（1）-（4）中任一所示的核酸分子，得到表达所述核酸分子的转基因植物；（1）序列表中序列1所示的RNA分子（落叶松成熟miR166a）；（2）序列表中序列2所示的RNA分子（落叶松前体miR166a）；（3）序列表中序列3所示的DNA分子（LaMIR166a基因）；（4）序列表中序列3的第27-539位所示的DNA分子。b）从步骤a）所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，具有如下（I）-（III）中的至少一种的转基因植物：（I）侧根根系发达；（II）植株生长速率提高；（III）植株成活率提高。其中，序列1由21个核苷酸组成，为落叶松成熟miR166a序列；序列2由95个核苷酸组成，为落叶松前体miR166a序列；序列3由884个脱氧核苷酸组成，为落叶松前体miR166a的全长cDNA序列，即为LaMIR166a基因。在本发明中，培育转基因植物时采用的是将序列表中序列3的第27-539位所示的DNA分子导入所述目的植物中的。进一步，所述序列表中序列3的第27-539位所示的DNA分子，是通过重组表达载体的形式转入所述目的植物中的。更进一步，所述重组表达载体上启动所述序列表中序列3的第27-539位所示的DNA分子转录的启动子是Super启动子。更为具体的，所述重组表达载体为在pSuper1300+载体的多克隆位点（如HindIII和KpnI）处插入序列表中序列3的第27-539位所示的DNA分子后得到的重组质粒。当然，所述重组表达载体也可用现有的其他植物表达载体构建，如双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，更加具体如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子（pUbi）、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。在上述培育转基因植物的方法中，将所述重组表达载体导入所述目的植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。在上述各应用或各方法中，所有的（I）中所述的“侧根根系发达”为侧根数目增多；所有的（II）中所述的“植株生长速率提高”为组培苗（如在生根培养基上培养4个月的组培苗）生长速率提高；所有的（III）中所述的“植株成活率提高”为移栽后的植株成活率提高。在上述各应用或各方法中，所述植物可为裸子植物。在本发明中，所述裸子植物为落叶松属植物，具体可为日本落叶松（Larixleptolepis）、长白落叶松（LarixolgensisHenry）、兴安落叶松（Larixgmelinii）或华北落叶松（Larixprincipis-rupprechtiiMayr）。实验证明，将序列表中序列3的第27-539位所示的DNA分子在落叶松中过表达，获得转基因植株。结果显示LaMIR166a基因过表达的转基因植株在生根培养基a17上培养4个月时，有大量的侧根发生，且植株生长良好；而非转基因对照植株，只有主根伸长，没有侧根发生，且相比之下植株生长缓慢。这说明过表达miR166a可促进落叶松组培苗的生长速率、促进侧根的发生，从而提高其移栽成活率。附图说明图1为前体miR166a的RNA二级结构。方框内为成熟miR166a的序列。图2为转基因落叶松的PCR检测结果。其中，A为目的基因LaMIR166a的扩增结果；各泳道模板DNA分别是：水，阴性对照（CK-，未转基因的落叶松胚性细胞系），a1～a5、阳性对照（CK+，导入重组表达载体pSuper::MIR166a的转基因落叶松胚性细胞系）；泳道M为DNA分子量标准。B为潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）的扩增结果；各泳道模板DNA分别是：水，阴性对照（CK-，未转基因的落叶松胚性细胞系），a1～a5、阳性对照（CK+，导入重组表达载体pSuper::MIR166a的转基因落叶松胚性细胞系）；泳道M为DNA分子量标准。C为农杆菌毒性基因VirG的扩增结果；各泳道模板DNA分别是：水，阴性对照（CK-，未转基因的落叶松胚性细胞系），a1～a5、阳性对照（CK+，农杆菌GV3101）泳道M为DNA分子量标准。图3为转基因落叶松的qRT-PCR检测结果。图4为在生根培养基a17上培养4个月时转基因落叶松组培苗的形态。其中，A为未转基因落叶松组培苗；B为转入重组表达载体pSuper::MIR166a的转基因落叶松组培苗a4。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。pSuper1300+载体：记载于“朱彩虹,李水根,齐力旺,韩素英.农杆菌介导的日本落叶松胚性细胞遗传转化研究.中国生物工程杂志,2013,33（5）:75-80”一文。农杆菌GV3101：记载于“赵湛,李文生.不同根癌农杆菌菌株类型对木霉菌遗传转化效率的影响.北方园艺,2006年03期”一文。实施例1、miR166a过表达转基因植物的获得及鉴定本实施例中所涉及的miR166a为日本落叶松（Larixleptolepis）的miR166a。其中，成熟miR166a序列的序列为序列表中序列1；前体miR166a序列的序列为序列表中序列2；前体miR166a序列的全长cDNA为序列表中序列3，命名为LaMIR166a基因。其中，前体miR166a的RNA二级结构如图1所示。一、重组表达载体pSuper::MIR166a的构建1、引物设计根据序列表中序列3所示的前体miR166a序列的全长cDNA（LaMIR166a基因），在该cDNA上的miR166a茎环结构序列的两端各约200bp处设计引物，如下：引物1：5’-CCCAAGCTTGCAACACCATACTTACGCC-3’（下划线部分为HindIII的识别序列，其后的序列为序列3的第27-45位；引物2：5’-GGGGTACCCCCTGGAAAACTCACCTATAC-3’（下划线部分为KpnI的识别序列，其后的序列为序列3的第519-539位的反向互补序列）2、PCR扩增提取日本落叶松（Larixspp.）的总RNA，反转录后得到cDNA序列。以所得cDNA为模板，采用上述引物对，进行PCR扩增，经测序鉴定PCR产物的核苷酸序列为“CCCAAGCTT+序列表的序列3的第27-539位+GGTACCCC”。3、载体构建用限制性内切酶HindIII和KpnI双酶切步骤2所得PCR产物，胶回收后与经过同样双酶切的pSuper1300+载体的骨架大片段相连，获得重组质粒。对所得重组质粒进行HindIII和KpnI双酶切鉴定，鉴定正确（得到大小约为10kbp和525bp）后送样测序。将经测序表明在pSuper1300+载体的多克隆位点HindIII和KpnI之间插入序列表中序列3的第27-539位所示的DNA分子后得到的重组质粒，命名为pSuper::MIR166a。在重组表达载体pSuper::MIR166a中，启动序列表中序列3的第27-539位所示的DNA分子转录的启动子为Super启动子。当然，在构建重组表达载体pSuper::MIR166a的过程中，也可以采用序列表中序列3所示的DNA分子为模板进行PCR扩增。二、转基因落叶松的获得1、转基因落叶松胚性细胞系的获得（1）重组农杆菌的制备YEB液体培养基（1L）：牛肉浸膏5g+酵母膏5g+胰蛋白胨5g+蔗糖5g+MgSO4·7H2O0.493g，溶剂为水；pH7.0。YEB固体培养基（1L）：牛肉浸膏5g+酵母膏5g+胰蛋白胨5g+蔗糖5g+MgSO4·7H2O0.493g+琼脂粉15g，溶剂为水；pH7.0。将步骤一得到的重组表达载体pSuper::MIR166a导入农杆菌GV3101。具体操作如下：将10μL重组表达载体pSuper::MIR166a加入到200μL农杆菌GV3101的感受态细胞中，轻轻混匀；冰浴30min，液氮冷冻3～5min，37℃水浴5min；加入1mLYEB液体培养基，28℃，180rpm振荡培养4h；4000rpm、室温离心8min，弃上清，加入200μLYEB液体培养基重悬菌体，涂布于YEB固定培养基（含利福平，庆大霉素和卡那霉素各50mg/L）；28℃，黑暗培养2d，挑取单菌落并PCR检测验证，所采用引物为步骤一中的引物1和引物2，将经PCR扩增得到大小约为525bp目的条带的重组农杆菌命名GV3101/MIR166a。同时设置转入pSuper1300+空载体的农杆菌作为对照，将所得对应重组农杆菌命名为GV3101/pSuper1300+。（2）受体材料的准备及预培养将落叶松胚性细胞转接到新的培养基S0（具体为“申请号为200510090282.X，授权公告号为CN100427586C的专利”中记载的增殖培养基）上15d后，挑取表面生长旺盛的胚性组织约1g作为遗传转化的受体材料。（3）农杆菌液制备。培养基Y0（1L）：具体为“申请号为200510090282.X，授权公告号为CN100427586C的专利”中记载的增殖培养基中不加琼脂。浸染液Y1（1L）：培养基Y0+AS10-40mg；pH5.75～5.85。取出储存于－80℃的甘油农杆菌（重组农杆菌GV3101/MIR166a或重组农杆菌GV3101/pSuper1300+），置于冰上使其溶解，再置于4℃保存备用。取出已解冻的重组农杆菌，在YEB固体培养基（添加利福平霉素，庆大霉素、卡那霉素各50mg/L）上划板，25℃黑暗培养。大约48h后，重组农杆菌长出。从平板上挑取单菌落，接种于YEB液体培养基（添加与上述相同的抗生素）中，28℃、黑暗、180rpm震荡培养。约18h后，重组农杆菌长至对数期，菌液浓度约为0.6～0.8（OD600nm）时，将其转移至离心管中，配平后转移到低温高速离心机，4000rpm，4℃离心10min。小心倒去上清，将收集到的菌液用浸染液Y1重悬。转移到已灭菌的三角瓶中，并调至所需浓度0.4（OD600nm）。（4）侵染、共培养及抗性筛选。培养基S1（1L）：培养基S0+AS10-40mg；pH5.75～5.85。培养基S2（1L）：培养基S0+头孢霉素200-700mg；pH5.75～5.85。培养基S3（1L）：培养基S0+头孢霉素200-700mg+潮霉素3-20mg；pH5.75～5.85。将收集到的胚性细胞加入到上述已制备好的重组农杆菌液中20-30min。将三角瓶静置，倒去上层液体。将胚性细胞转移至固体培养基S1上。将接种后的材料置于暗培室中，25℃共培养3-5d。待胚性组织块周围长出重组农杆菌后，用镊子小心挑取，转移至已灭菌的三角瓶中。反复清洗后至上清液呈清亮透澈，倒去上层液体，用含头孢霉素的液体培养基S2清洗20min。收集胚性细胞，转移至含抑菌抗生素的培养基S2上，恢复培养3-7d。将恢复培养的愈伤组织转移至筛选培养基S3上，等待抗性组织的长出，将抗性组织再次筛选，直到抗性稳定，获得转入重组表达载体pSuper::MIR166a的转基因落叶松胚性细胞系，以及转入pSuper1300+空载体的转基因落叶松胚性细胞系。其中，转入重组表达载体pSuper::MIR166a的转基因落叶松胚性细胞系共获得了5个，分别记为pSuper::MIR166a1-5（简称a1-a5）。2、转基因落叶松胚性细胞系的鉴定（1）PCR检测分别提取步骤1获得的5个转入重组表达载体pSuper::MIR166a的转基因落叶松胚性细胞系a1-a5，以及转入pSuper1300+空载体的转基因落叶松胚性细胞系的基因组DNA。同时以非转化的落叶松胚性细胞系为阴性对照，以重组表达载体pSuper::MIR166a和重组农杆菌GV3101/MIR166a菌液为阳性对照。分别设计目的基因（位于载体上，跨目的基因LaMIR166a）特异性引物和潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）特异性引物。另外，为了排除阳性转化细胞受农杆菌污染而出现的假阳性，设计VirG基因（位于T-DNA之外）特异性引物检测农杆菌。目的基因LaMIR166a的特异性引物，如下：上游引物：5’-AGATACGCTGACACGCCAA-3’；下游引物：5’-CCGGACACGCTGAACTTG-3’。潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）特异性引物，如下：上游引物：5’-ATGGCATCTGCAACATTGTCCA-3’；下游引物：5’-ATAGATACGCTGACACGCCA-3’。VirG基因（位于T-DNA之外）特异性引物，如下：上游引物：5’-GATTTTATTGCCAAGCCTTTT-3’；下游引物：5’-TACTTCTGTCATACACCTCCTCC-3’。采用Ex-Taq酶（Takara）进行PCR扩增，反应体系如下：Ex-Taqmix10μL，上下游引物各1μL，模板DNA1μL，加水补至20μL。1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。如图2所示，其中目的基因LaMIR166a（图2中A）特异性引物在5个转入重组表达载体pSuper::MIR166a的转基因落叶松胚性细胞系a1-a5和阳性对照中均扩增出大小约为800bp的目的条带，而在转入pSuper1300+空载体的转基因落叶松胚性细胞系和非转基因落叶松胚性细胞系中未能扩出目的条带，与预期结果一致；潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）（图2中B）特异性引物在5个转入重组表达载体pSuper::MIR166a的转基因落叶松胚性细胞系a1-a5、转入pSuper1300+空载体的转基因落叶松胚性细胞系和阳性对照中均扩增出大小约为500bp的目的条带，而在非转基因落叶松胚性细胞系中未能扩出目的条带。由此证明5个转入重组表达载体pSuper::MIR166a的转基因落叶松胚性细胞系a1-a5均携带有目的基因和潮霉素磷酸转移酶基因片段。农杆菌毒性基因VirG（图2中C）的特异性引物的扩增结果表明只在农杆菌中扩增出目的条带，因此5个转入重组表达载体pSuper::MIR166a的转基因落叶松胚性细胞系a1-a5均没有受到农杆菌残留的污染，从而排除了假阳性。（2）qRT-PCR检测以步骤1获得的5个转入重组表达载体pSuper::MIR166a的转基因落叶松胚性细胞系a1-a5，转入pSuper1300+空载体的转基因落叶松胚性细胞系，以及非转化的落叶松胚性细胞系为实验材料。提取各实验材料的总RNA。为了排除基因组DNA对后续试验的干扰，在1μg总RNA中加入1μLDNase（Fermentas，加拿大）进行消化去除RNA中残留的基因组DNA。再加入1μLbuffer，加水补至10μL；37℃反应30min；加入1μLEDTA，65℃孵育10min使DNase酶失活以终止反应。使用反转录试剂盒（Fermentas），将RNA反转录成cDNA。在上一步消化好的RNA中加入以下组分：1μLoligo（dT）引物，4μLBuffer，1μLRNaseInhibitor，2μLdNTPmix，1μL反转录酶。反应条件42℃，60min；72℃，5min；反应完成后存于-80℃备用。qRT-PCR采用试剂盒SYBRPremixEXTaqKit（宝生物工程），按照试剂盒说明书进行操作。将cDNA稀释后，取2μL在7500Real-timePCRSystem（AppliedBiosystems,USA）上进行qRT-PCR扩增检测LaMIR166a基因表达量。建立20μL反应体系如下：SYBRPremixExTaqTM10μL，正向引物（浓度10μM）0.4μL，反向引物（浓度10μM）0.4μL，ROXReferenceDyeII0.4μL，cDNA2.0μL，dH2O6.8μL。正向引物：5’-CTTACGCCGCCGTCTATTCA-3’（序列3的第38-57位）；反向引物：5’-GCCAACCATTCCCAAGCTAT-3’（序列3的第193-212位的反向互补序列）。反应程序：95℃，30s；95℃，5s，60℃，34s，重复40个循环。内参基因采用LaEF1A1（GenBank：JX157845）。内参基因的扩增引物为5’-GACTGTACCTGTTGGTCGTG-3’和5’-CCTCCAGCAGAGCTTCAT-3’。使用相对定量方法对数据进行计算和统计，每个样品重复4次，取平均值。PCR之后通过溶解曲线分析（采用机器默认程序）和1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，验证PCR结果为特异性扩增。LaMIR166a基因的相对表达量（利用qRT-PCR技术，采用2-ΔΔCt方法计算）的qRT-PCR检测结果如图3所示，步骤1获得的5个转入重组表达载体pSuper::MIR166a的转基因落叶松胚性细胞系a1-a5中LaMIR166a基因的表达水平均比作为对照的未转基因落叶松胚性细胞系显著升高，且在a4中的表达水平最高。对于转入pSuper1300+空载体的转基因落叶松胚性细胞系，其LaMIR166a基因的表达水平与作为对照的未转基因落叶松基本一致，无显著差异。3、转基因落叶松的获得将经上述鉴定LaMIR166a基因的表达量最高的转入重组表达载体pSuper::MIR166a的转基因落叶松胚性细胞系a4，转接到成熟培养基（具体为“申请号为200510090282.X，授权公告号为CN100427586C的专利”中记载的成熟培养基）上诱导体细胞胚的发生与成熟，获得发育良好的成熟体细胞胚，将其置于生根培养基a17（1/2MS+IBA1.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5.5g/L）直至生根发芽。将生长良好的组培苗，移栽到温室继续培养，最终获得转入重组表达载体pSuper::MIR166a的转基因落叶松a4。实施例2、转基因落叶松的功能鉴定以实施例1获得的转入重组表达载体pSuper::MIR166a的转基因落叶松a4、转入pSuper1300+空载体的转基因落叶松，以及未转基因的落叶松为实验材料。将各实验材料的成熟体细胞胚置于生根培养基a17（1/2MS+IBA1.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5.5g/L）上，于4℃、黑暗环境下处理7d，然后置于25℃、光照（16h/8h）条件下培养，观察并记录各实验材料的植株形态、植株生长速率、根系发育情况等。待各实验材料的植株生根发芽后，将生长良好的组培苗移栽到温室继续培养。实验重复三次。结果显示，在生根培养基a17上培养4个月时，未转基因的落叶松的组培苗只有主根伸长，没有侧根发生，植株生长缓慢；相比而言，转入重组表达载体pSuper::MIR166a的转基因落叶松a4的组培苗侧根大量发生，植株生长速率显著快于未转基因的对照植株。其形态具体如图4所示。而对于转入pSuper1300+空载体的转基因落叶松而言，其植株形态、植株生长速率、根系发育情况等均与未转基因的对照植株基本一致，无显著差异。以上结果说明，过表达MIR166a可促进落叶松组培苗侧根的发生，从而利于提高其移栽成活率。