一种肠2B型磷酸钠协同转运蛋白抑制剂的硫酸盐及其结晶形式的制作方法

本发明涉及n¹-甲基-n¹-(2-吗啡啉乙基)-n³-(3-(4-苯乙基苯基氨基甲酰基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-基)间苯二甲酰胺硫酸盐、其i型结晶及制备方法。

背景技术：

无机磷酸盐(pi)是骨矿物质的必要组分，人体磷酸盐的大约80％在体外的胞外基质(如骨和牙)中，18％在细胞内，2％在细胞外液中。正常生理条件下，小肠摄取过量的磷酸盐，磷酸盐的体内平衡依赖于肾脏的排泄和重吸收功能来调节。体内磷酸盐过多或过少均导致机体功能紊乱而致病：如过低则导致低磷酸盐血症、软骨病、佝偻病和心脏功能紊乱；过高则诱发高磷酸盐血症、软组织和血管钙化以及肾功能障碍。磷酸盐过高是心血管疾病和慢性肾病(ckd)患者的死亡率增高的重要因素。

小肠对磷酸盐的吸收主要通过两种途径，被动运输和主动运输，其中主动运输就是通过钠依赖型的钠/磷共转运通道蛋白进行的。最近的研究表明，磷酸钠协同转运蛋白2b(npt2b)是治疗慢性肾病(ckd)中高磷酸盐血症的重要靶点(jpharmsci.2011sep；100(9):3719-30)。磷酸钠协同转运蛋白包括i型家族(npt1、npt3、npt4)，ii型家族(npt2a，npt2b，npt2c)，iii型家族(pit1，pit2)。其中npt2b在整个上消化道均有表达，介导一半左右的食物中磷酸盐的吸收，用于维持磷酸盐的体内平衡。npt2b在其他组织中也有表达，npt2b抑制剂有必要保持不可吸收的特性和能在肠腔内保持的特点(currentpharmaceuticaldesign,2012,18,1434-1445)。研究发现，npt2b突变引起的npt2b失活会导致常染色体隐性遗传病肺泡微结石(pam)的发生，暗示npt2b在肺泡的主要功能是移除多余的磷酸盐。

激素如雌性激素、糖皮质激素、成纤维细胞生长因子23(fgf23)、1,25(oh)维他命d3(1,25(oh)2d3)和饮食摄入的磷酸盐均影响小肠刷状缘膜的磷摄取或npt2b的表达。小肠内npt2b的缺失也导致fgf23表达的减少。fgf23的主要功能是通过降低磷酸盐共转运蛋白的表达和促进1,25(oh)2d3的合成来调节肾脏磷酸盐的排泄，npt2b作为磷酸盐传感器，调控体内激素的平衡，维持全身系统的平衡。

本申请人的wo2016026372提供了一种如下所示的肠2b型磷酸钠协同转运蛋白抑制剂，其化学名为n¹-甲基-n¹-(2-吗啡啉乙基)-n³-(3-(4-苯乙基苯基氨基甲酰基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-基)间苯二甲酰胺，已经发现该化合物表现出在结肠和空肠部位有优异的效果和作用。

本领域技术人员知道，自由碱形式的化合物由于其特定的缺陷往往不能直接药用，多数药物需要提供其它形式的活性化合物来改进这些缺陷，将自由碱形式的化合物转化为其可药用盐即为一种常用的方法。另外，药用的活性成分的晶型结构往往影响到该药物的化学稳定性，结晶条件及储存条件的不同有可能导致化合物的晶型结构的变化，有时还会伴随着产生其他形态的晶型。一般来说，无定型的药物产品没有规则的晶型结构，往往具有其它缺陷，比如产物稳定性较差，析晶较细，过滤较难，易结块，流动性差等。因此，改善上述产物的各方面性质是很有必要的，我们需要深入研究找到晶型纯度较高并且具备良好化学稳定的新晶型。

技术实现要素：

本发明提供了n¹-甲基-n¹-(2-吗啡啉乙基)-n³-(3-(4-苯乙基苯基氨基甲酰基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-基)间苯二甲酰胺硫酸盐(如式(i)所示)，

式(i)所示化合物的可由硫酸和n¹-甲基-n¹-(2-吗啡啉乙基)-n³-(3-(4-苯乙基苯基氨基甲酰基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-基)间苯二甲酰胺反应得到。

式(i)所示化合物相对于n¹-甲基-n¹-(2-吗啡啉乙基)-n³-(3-(4-苯乙基苯基氨基甲酰基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-基)间苯二甲酰胺来说，其溶解度和生物利用度大大提高，更加适合药用。

式(i)所示化合物在不同结晶条件下得到的一系列结晶产物，对所得结晶产物进行了x-衍射及dsc检测，发现式(i)所示化合物在常规的结晶条件下，可以得到一种稳定性良好的晶型，我们称其为i型结晶。本申请中的i型结晶的dsc图谱显示在<350℃无吸热峰，x-射线粉末衍射图谱如图1所示，使用cu-ka辐射，以2θ角度和晶面间距(d值)表示的x-射线粉末衍射图谱，其中在约3.40(25.93)，5.45(16.21)，8.22(10.75)，10.55(8.38)，10.97(8.06)，13.68(6.47)，14.30(6.19)，18.16(4.88)，19.66(4.51)和20.52(4.33)附近有特征峰。

本发明还提供了制备n¹-甲基-n¹-(2-吗啡啉乙基)-n³-(3-(4-苯乙基苯基氨基甲酰基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-基)间苯二甲酰胺硫酸盐的i型结晶的方法。该方法包括如下步骤：

(1)将硫酸和n¹-甲基-n¹-(2-吗啡啉乙基)-n³-(3-(4-苯乙基苯基氨基甲酰基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-基)间苯二甲酰胺，或者将任意晶型或无定型的式(i)所示化合物加热溶解于适量的有机溶剂中，冷却、析晶，所述有机溶剂选自二甲基亚砜/水、n，n-二甲基甲酰胺/水、n，n-二甲基乙酰胺/水；

(2)过滤结晶并洗涤，干燥。

在本发明的一个实施方案中，优选的混合有机溶剂为二甲基亚砜/水的混合溶剂，二者比例没有特别限制，在本发明优选的实施方案中，二者体积比为1：1。

重结晶的方法没有特别限定，可以用通常的重结晶操作方法进行。例如，可以用原料式(i)所示化合物在有机溶剂加热溶解后慢慢冷却析晶，结晶完成后，经过滤干燥，即可得到所需要的结晶。需特别说明的是，所滤取的结晶体通常在减压下，在30～100℃左右，优选在40～60℃加热条件下进行减压真空干燥，就能达到去除重结晶溶剂的效果。

通过差示扫描热分析(dsc)、x-衍射图谱测定，对得到的式(i)所示化合物结晶体进行了晶型研究，同时对所得结晶的溶剂残留进行了检测。

按照本发明的方法制备的式(i)所示化合物i型结晶不含有或仅含有较低含量的残留溶剂，符合国家药典规定的有关医药产品残留溶剂的限量要求，因而本发明的结晶可以较好地作为医药活性成分使用。

经研究表明，本发明制备的式(i)所示化合物的i型结晶在高温、高湿的条件下稳定性良好，在光照条件下稳定性有所下降，需避光保存，且在研磨、压力和受热等条件下，晶型稳定性良好，能够满足生产运输储存的药用要求，生产工艺稳定可重复可控，能够适应于工业化生产。

附图说明

图1式(i)所示化合物i型结晶的x-射线粉末衍射图谱。

图2式(i)所示化合物i型结晶的dsc图谱。

具体实施方式

以下将结合实施例更详细地解释本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质和范围。

实验所用的测试仪器

1、dsc谱

仪器型号：mettlertoledodsc1stare^esystem

吹扫气：氮气

升温速率：10.0℃/min

温度范围：40-350℃

2、x-射线衍射谱

仪器型号：brukerd8focusx-射线粉末衍射仪

射线：单色cu-kα射线(λ＝1.5406)

扫描方式：θ/2θ，扫描范围：2-40°

电压：40kv，电流：40ma

实施例1

n¹-甲基-n¹-(2-吗啡啉乙基)-n³-(3-(4-苯乙基苯基氨基甲酰基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-基)间苯二甲酰胺的合成

第一步：2-氰基-n-(4-苯乙基苯基)乙酰胺的合成

将4-苯乙基苯胺a(2.15g，10.91mmol，采用公知的方法文献“journalofmedicinalchemistry，56(5)，2139-2149；2013”制备而得)和2-氰基乙酸(1.39g，16.37mmol)溶解于5mln，n-二甲基甲酰胺中，降温至0℃，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(3.14g，16.37mmol)，升至室温，搅拌反应2h。加入10ml水，搅拌30min，固体析出，过滤，滤饼烘干，得到粗品标题产物2-氰基-n-(4-苯乙基苯基)乙酰胺b(2.68g，白色固体)，产物不经纯化直接进行下一步反应。

msm/z(esi):263.3[m-1]

第二步：2-氰基-2-亚环己基-n-(4-苯乙基苯基)乙酰胺的合成

将粗品2-氰基-n-(4-苯乙基苯基)乙酰胺b(2.68g，10.13mmol)和环己酮(2.88g，29.38mmol)溶解于6ml甲苯中，加入吗啡啉(900mg，10.33mmol)，升温至120℃，搅拌反应2h。反应液减压浓缩，用乙醚和石油醚打浆纯化所得残余物，得到标题产物2-氰基-2-亚环己基-n-(4-苯乙基苯基)乙酰胺c(2.52g，浅褐色固体)，产率：72.2％。

msm/z(esi):345.2[m+1]

第三步：2-氨基-n-(4-苯乙基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-3-甲酰胺的合成

将2-氰基-2-亚环己基-n-(4-苯乙基苯基)乙酰胺c(2.52g，7.32mmol)和硫(246mg，7.68mmol)溶解于10mln，n-二甲基甲酰胺中，加入吗啡啉(670mg，7.68mmol)，升温至50℃，搅拌反应2h。加入50ml饱和氯化钠溶液，用乙酸乙酯萃取(20ml×3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤(50ml×1)，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用异丙醇打浆纯化所得残余物，得到标题产物2-氨基-n-(4-苯乙基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-3-甲酰胺d(1.69g，黄色固体)，产率：61.2％。

msm/z(esi):377.2[m+1]

第四步：n¹-甲基-n¹-(2-吗啡啉乙基)-n³-(3-(4-苯乙基苯基氨基甲酰基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-基)间苯二甲酰胺的合成

将2-氨基-n-(4-苯乙基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-3-甲酰胺d(200mg，0.53mmol)和3-(甲基(2-吗啡啉乙基)氨甲酰基)苯甲酸(292mg，1mmol，采用专利申请“wo2012006477”公开的方法制备而得)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(153mg，0.80mmol)和4-二甲氨基吡啶(97mg，0.80mmol)溶解于5mln，n-二甲基甲酰胺中，升温至30℃，搅拌反应12h。加入30ml水，用乙酸乙酯萃取(30ml×3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤(50ml×1)，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂(二氯甲烷和甲醇体系)纯化所得残余物，得到标题产物n¹-甲基-n¹-(2-吗啡啉乙基)-n³-(3-(4-苯乙基苯基氨基甲酰基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-基)间苯二甲酰胺e(174mg，黄色固体)，产率：50.3％。

msm/z(esi):651.5[m+1]

¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.99-8.10(m,2h),7.59-7.77(m,2h),7.50-7.59(m,1h),7.46(d,2h),7.27-7.32(m,1h),7.04-7.23(m,5h),3.91(s,1h),3.76(s,3h),3.58(s,2h),3.39(s,1h),3.04(s,4h),2.88(s,3h),2.74(s,5h),2.50(s,2h),2.24(s,2h),1.90(s,4h).

实施例2

取(500mg，0.77mmol)n¹-甲基-n¹-(2-吗啡啉乙基)-n³-(3-(4-苯乙基苯基氨基甲酰基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-基)间苯二甲酰胺(按实施例1制备)于25ml单口瓶中，加入5ml二甲基亚砜，40℃加热溶清，再加入5ml水，然后滴加硫酸水溶液(27.5％，356mg，1.00mmol)，滴毕，40℃反应1h，停止加热，搅拌析晶。次日，抽滤，干燥得固体492mg，收率为85.6％。该结晶样品的x-射线衍射见图1，其中在约3.40(25.93)，5.45(16.21)，8.22(10.75)，10.55(8.38)，10.97(8.06)，13.68(6.47)，14.30(6.19)，18.16(4.88)，19.66(4.51)和20.52(4.33)附近有特征峰。dsc谱图见图2，dsc在<350℃无吸热峰，将此晶型定义为i晶型。

实施例3

取(500mg，0.77mmol)n¹-甲基-n¹-(2-吗啡啉乙基)-n³-(3-(4-苯乙基苯基氨基甲酰基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-基)间苯二甲酰胺(按实施例1制备)于25ml单口瓶中，加入5mln，n-二甲基甲酰胺，40℃加热溶清，再加入5ml水，然后滴加硫酸水溶液(27.5％，356mg，1.00mmol)，滴毕，40℃反应1h，停止加热，搅拌析晶。次日，抽滤，干燥得固体473mg，收率为82.3％。该结晶样品的x-射线衍射和dsc图谱经研究比对，确定产物为i晶型。

实施例4

取(500mg，0.77mmol)n¹-甲基-n¹-(2-吗啡啉乙基)-n³-(3-(4-苯乙基苯基氨基甲酰基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-基)间苯二甲酰胺(按实施例1制备)于25ml单口瓶中，加入5mln，n-二甲基乙酰胺，40℃加热溶清，再加入5ml水，然后滴加硫酸水溶液(27.5％，356mg，1.00mmol)，滴毕，40℃反应1h，停止加热，搅拌析晶。次日，抽滤，干燥得固体435mg，收率为75.7％。该结晶样品的x-射线衍射和dsc图谱经研究比对，确定产物为i晶型。

实施例5

取(500mg，0.67mmol)式(i)所示化合物(按实施例2制备)于25ml单口瓶中，加入5ml二甲基亚砜，40℃加热溶清，再加入5ml水，40℃搅拌10min，停止加热，搅拌析晶。次日，抽滤，干燥得固体403mg，收率为80.6％。该结晶样品的x-射线衍射和dsc图谱经研究比对，确定产物为i晶型。

实施例5

取(500mg，0.67mmol)式(i)所示化合物(按实施例2制备)于25ml单口瓶中，加入1.5mln，n-二甲基乙酰胺，40℃加热溶清，再加入5ml水，40℃搅拌10min，停止加热，搅拌析晶。次日，抽滤，干燥得固体412mg，收率为82.4％。该结晶样品的x-射线衍射和dsc谱图经研究比对，确定产物为i晶型。

实施例6

将实施例2所得的i型结晶产物样品敞口平摊放置，考察在光照(4500lux)，加热(40℃，60℃)，高湿(rh75％，rh90％)条件下样品的稳定性。考察取样时间为5天和10天，hplc检测纯度见表1。

表1、式(i)所示化合物i晶型样品的稳定性比较

稳定性考察结果表明式(i)所示化合物i型结晶在敞口放置的条件下，经光照、高温和高湿条件下的稳定性发现，高湿、高温对其影响不大，光照条件下有所下降，需避光保存。

实施例7

将按实施例2方法制得的式(i)所示化合物i型结晶进行研磨、加热及压片处理，研究结果表明晶型稳定，详细的实验数据参见下表2。

表2、式(i)所示化合物i晶型特殊稳定性研究