本发明涉及6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤衍生物及其制备方法与应用。
背景技术：
：癌症是世界范围内引起死亡的主要原因，其发病率还在不断上升。每年有1270万人会发现自己患有癌症，有760万人因此死亡。美国癌症学会负责人约翰·塞弗林说，如今全球8名死者中就有1人死于癌症。据WHO报告预计，在全球范围内，新增癌症病例和癌症患者死亡率也将会以每年1％的速度递增，而在中国、俄罗斯和印度这些国家增长速度会更快。报告说：“全球癌症患者在上世纪最后30年里翻了一番，估计这一数字在2020年前将再翻一番，2030年前将增至上世纪最后30年的3倍。”这意味着到2030年，全球将新增2700万癌症病例，死于癌症的人数将达到1700万人。美国临床肿瘤学协会主席道格拉斯·布雷尼在一份声明中写道：“很多人没有意识到，在一些贫困国家，由癌症导致的死亡人数已经超过了死于艾滋病、疟疾和结核病的人数总量。在中国，每年有160万癌症患者。世界卫生组织预测癌症将是21世纪的人类的“头号杀手”。癌症治疗的方法主要可分为三个大类：外科手术切除、局部放射治疗(放疗)和使用药物的化学治疗(化疗)。癌症的化学治疗近年来有飞速发展，新抗癌药不断出现。以前，临床治疗中使用的药物有烷化剂、代谢抑制剂、植物的生物碱等抗癌剂、抗生素、免疫促进剂、免疫调节剂等多种，但是这些药物治疗还不能说是很成熟。细胞周期是细胞生命活动的基本特征。一个完整的细胞周期受多种蛋白酶的调控，调控失调会导致细胞过度增殖，从而引发肿瘤。细胞周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependentkinases，CDKs)是细胞周期调控机制的核心，CDKs与相应的细胞周期素(cyclin)结合是细胞周期各类分子事件的启动和进行的必要条件。以细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)为靶点的药物可以阻断细胞周期，控制细胞增殖，从而达到抗肿瘤的目的。研究发现细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)依赖与细胞周期蛋白的结合来执行细胞周期有序进行中的关键功能；在增殖紊乱方面有潜在的治疗作用的，尤其对癌细胞有相当好的治疗效果。当缺乏细胞周期蛋白质或CDK抑制物存在时，它们即失去活性，细胞增殖停滞，甚至死亡。2，6，9-三取代嘌呤是CDKs的选择性ATP拮抗剂，是可以专一性抑制CDK的小分子化合物中的一种，是治疗癌症、神经退行性疾病、血管球性肾炎和病毒性感染等疾病的潜在药物。肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)的成员，归属于人类肠道病毒A。EV71可导致大范围的暴发流行，可伴有严重的中枢神经系统并发症或致死性肺水肿，其感染危害比较严重。EV71为目前肠病毒群中最晚发现的病毒，其感染性强且致病率高，尤其是神经系统方面的并发症。其它同属于肠病毒群之病毒尚包括小儿麻痹病毒(Polioviruses；具3种型别)、柯萨奇病毒(Coxsackieviruses；A型具有23种型别、B型具有6种型别)、伊科病毒(Echoviruses；具31种型别)及肠病毒(Enteroviruses68～72型)。肠道病毒71型(英文名为：Humanenterovirus71)。简称EV71。1957年，新西兰首次爆发大规模疫情并报道。1958年，首次分离出柯萨奇病毒(Coxsackieviruses)。1959年，有了手足口病(hand-footandmouthdisease；HFMD)的命名。人类肠病毒71型1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来的。人是肠道病毒唯一的传染来源，人群对肠道病毒EV71普遍易感，感染后可获得免疫力。由于不同病原型别感染后抗体缺乏交叉保护力，因此，人群可反复感染发病。而且，该病易于传播，容易发生流行，预防控制难度大。20世纪70年代中期，保加利亚、匈牙利等国家相继暴发以中枢神经系统疾病为主要临床特征的EV71型手足口病流行，并导致较高的病死率和致残率。1997年以来，EV71感染为主的手足口病在马来西亚、中国台湾、新加坡等地大规模暴发流行。1998年中国台湾发生迄今最大的一次主要为EV71型手足口病流行，共报告129106例手足口病或疱疹性咽峡炎病例，其中重症患1405例，死亡78例。中国内地自1981年在上海始见本病，此后北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北及广东等十几个省市均有EV71型手足口病的发生和流行。近年来，EV71的流行在亚太地区呈上升趋势，其中最令人关注的是该地区的EV71感染出现越来越严重的中枢神经系统症状。但其产生中枢神经系统症状的机制、病毒结构特征与毒力的关系目前还不明确，且缺乏有效预防其感染的药物。2008年3月10日至5月31日短短时间内安徽阜阳共报告手足口病7470例，共发现111例重症病例，其中死亡23例，病死率0.31％。目前肠病毒感染除了小儿麻痹病毒有疫苗外，其余肠病毒感染并无特殊治疗药物，故临床上对无并发症患者之治疗只能采取支持性疗法，而对有并发症的患者也只能对症治疗，采取一些降低颅压、降温、辅助抗病毒等的治疗。目前为止抗EV71病毒的治疗药物仅利巴韦林等广谱抗病毒药物，但抗病毒疗效一般。所以，有效的预防和控制EV71病毒的方法已成当务之急。根据以上分析，研究特异性高、毒副作用小的新型抗EV71病毒感染的药物对治疗与预防EV71病毒感染及其相关性疾病具有重要现实意义。(R)-6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤是细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependkinases，CDKs)家族中CDC2/cyclinB、CDK2/cyclinA、CDK2/cyclinE、CDK5/p35的选择性抑制剂。近年来，对(R)6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤生物化学特性及细胞生物学效应的研究发现，其能够通过选择性地替代CDK与ATP结合部位的C2、N6、N9位上的腺嘌呤结合，从而阻滞哺乳类动物细胞周期G1-S和G2-M转换，使细胞在G2期积累，最终导致死亡。在体外细胞试验中对多种肿瘤细胞有生长抑制作用。2009年，Cyclacel公司已完成(R)-6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤抗肿瘤的二期随机临床试验。在抗病毒研究方面，目前，还没有关于(R)-6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤抗EV71等引起手足口病病毒感染的报道。技术实现要素：本发明的目的是提供一种2，6，9-三取代嘌呤6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤衍生物及其药学上可接受的盐。本发明所提供的衍生物的结构式如式I所示：其中，R2为氢原子且R1选自下述基团中的任意一种：(R)-(1-羟甲基)丙基、(S)-(1-羟甲基)丙基、(R)-(1-羟甲基)乙基、(S)-(1-羟甲基)乙基、2-羟基乙基、2-羟基丙基、2-胺基乙基、6-羟基己基、1-羟甲基-2-羟基乙基、2-羟基-1-甲基-1-(羟甲基)乙基、2，3-二羟基丙基、1-(羟甲基)乙基苯乙基和[(羟甲基)乙基-2-甲基]丙基；或R1和R2均为羟乙基或异丙羟基。R3选自下述基团中的任意一种：苄氨基、取代的苄氨基、糠氨基和2-噻吩基甲胺基；所述取代的苄氨基中苯环上的任意位置被下述任意一个基团取代：氟原子、氯原子、甲氧基、甲基、乙基、异丙基和三氟甲基。R4选自下述基团中的任意一种：甲基、乙基、丙基、环丙基、环丙甲基、丁基、苄基、丁腈基。上述式I所示的化合物具体可选自下述任意一种：化合物01(S)-6-(苄氨基)-2-[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-甲基嘌呤；化合物02(R)-6-(苄氨基)-2-[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-甲基嘌呤；化合物036-(苄氨基)-2-(2-羟乙基氨基)-9-甲基嘌呤；化合物04(S)-6-(苄氨基)-2[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-乙基嘌呤；化合物05(R)-6-(苄氨基)-2[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-乙基嘌呤；化合物066-(苄氨基)-2-(2-羟乙基氨基)-9-乙基嘌呤；化合物07(S)-6-(苄氨基)-2[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-丙基嘌呤；化合物08(R)-6-(苄氨基)-2[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-丙基嘌呤；化合物096-(苄氨基)-2-(2-羟乙基氨基)-9-丙基嘌呤；化合物10(S)-6-(苄氨基)-2[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-环丙甲基基嘌呤；化合物11(R)-6-(苄氨基)-2[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-环丙甲基嘌呤；化合物126-(苄氨基)-2-(2-羟乙基氨基)-9-环丙甲基嘌呤；化合物13(S)-6-(苄氨基)-2[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-丁基嘌呤；化合物14(R)-6-(苄氨基)-2[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-丁基嘌呤；化合物156-(苄氨基)-2-(2-羟乙基氨基)-9-丁基嘌呤；化合物16(S)-6-(苄氨基)-2[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-苄基嘌呤化合物17(R)-6-(苄氨基)-2[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-苄基嘌呤化合物186-(苄氨基)-2-(2-羟乙基氨基)-9-苄基嘌呤；化合物19(S)-6-(苄氨基)-2[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-丁腈基嘌呤；化合物20(R)-6-(苄氨基)-2[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-丁腈基嘌呤；化合物216-(苄氨基)-2-(2-羟乙基氨基)-9-丁腈基嘌呤；化合物22(S)-6-(3-氟苄氨基)-2[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-甲基嘌呤；化合物23(R)-6-(3-氟苄氨基)-2[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-甲基嘌呤；化合物246-(3-氟苄氨基)-2-(2-羟乙基氨基)-9-甲基嘌呤；化合物25(S)-6-(3-氟苄氨基)-2[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9一乙基嘌呤；化合物26(R)-6-(3-氟苄氨基)-2[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-乙基嘌呤；化合物276-(3-氟苄氨基)-2-(2-羟乙基氨基)-9-乙基嘌呤；化合物28(S)-6-(3-氟苄氨基)-2[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-丙基嘌呤；化合物29(R)-6-(3-氟苄氨基)-2[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-丙基嘌呤；化合物306-(3-氟苄氨基)-2-(2-羟乙基氨基)-9-丙基嘌呤；化合物31(S)-6-(3-氟苄氨基)-2[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-环丙甲基基嘌呤；化合物32(R)-6-(3-氟苄氨基)-2[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-环丙甲基嘌呤；化合物336-(3-氟苄氨基)-2-(2-羟乙基氨基)-9-环丙甲基嘌呤；化合物34(S)-6-(3-氟苄氨基)-2[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-丁基嘌呤；化合物35(R)-6-(3-氟苄氨基)-2[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-丁基嘌呤；化合物366-(3-氟苄氨基)-2-(2-羟乙基氨基)-9-丁基嘌呤；化合物37(R)-6-(3-氟苄氨基)-2[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤；化合物38(R)-6-(3-氟苄氨基)-2[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-苄基嘌呤；化合物396-(3-氟苄氨基)-2-(2-羟乙基氨基)-9-苄基嘌呤；化合物40(S)-6-(4-氟苄氨基)-2[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-乙基嘌呤；化合物41(R)-6-(4-氟苄氨基)-2[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-乙基嘌呤；化合物426-(4-氟苄氨基)-2-(2-羟乙基氨基)-9-乙基嘌呤；化合物43(S)-6-(4-氟苄氨基)-2[[(1-羟甲基)乙基]氨基]-9-乙基嘌呤；化合物446-(4-氟苄氨基)-2-[(6-羟基己基)氨基]-9-乙基嘌呤；化合物456-(苄氨基)2-[(6-羟基己基]氨基]-9-乙基嘌呤；化合物466-(3-氟苄氨基)-2-[N，N-二羟乙基氨基]-9-乙基嘌呤；化合物476-(3-氟苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)乙基苯乙基]氨基]-9-乙基嘌呤；化合物486-(3-氟苄氨基)-2[[2-羟基-1-甲基-1-(羟甲基)乙基]氨基]-9-乙基嘌呤；化合物496-(3-氟苄氨基)-2[[2，3-二羟基丙基]氨基]-9-乙基嘌呤；化合物506-(3-氟苄氨基)-2[[[(羟甲基)乙基-2-甲基]丙基]氨基]-9-乙基嘌呤；化合物516-(3-氟苄氨基)-2[[(1-羟甲基)-2-羟基乙基]氨基]-9-乙基嘌呤；化合物526-(苄氨基)-2[[2-羟基-1-甲基-1-(羟甲基)乙基]氨基]-9-乙基嘌呤；化合物536-(苄氨基)-2-[(2，3-二羟基丙基)氨基]-9-乙基嘌呤；化合物546-(苄氨基)-2-[N，N-二羟乙基氨基]-9-乙基嘌呤；化合物556-[(2-氯苄基)氨基]-2-[(2-羟乙基)氨基-9-乙基嘌呤；化合物566-[(2-甲氧基苄基)氨基]-2-[(2-羟乙基)氨基-9-乙基嘌呤；化合物576-[(3-甲氧基苄基)氨基]-2-(2-羟乙基氨基)-9-乙基嘌呤；化合物586-[(4-三氟甲基苄基)氨基]-2-(2-羟乙基氨基)-9-乙基嘌呤；化合物596-[(3，5-二氟苄基)氨基]-2-(2-羟乙基氨基)-9-乙基嘌呤；化合物606-呋喃基甲胺基-2-(2-羟乙基氨基)-9-乙基嘌呤；化合物616-(2-噻吩基甲氨基)-2-(2-羟乙基氨基)-9-乙基嘌呤；化合物626-[(3-氟苄胺基]-2-(2-羟丙基氨基)-9-乙基嘌呤；化合物636-[(3-氟苄胺基)]-2-(2-胺乙基氨基)-9-乙基嘌呤；化合物646-[(3-氟苄胺基)]-2-二(2-羟丙基氨基)-9-乙基嘌呤；化合物656-[(3-甲基苯胺基)]-2-(2-羟乙基氨基)-9-乙基嘌呤；化合物666-[(4-异丙基苯胺基)]-2-(2-羟乙基氨基)-9-乙基嘌呤；化合物676-[(N-甲基苯胺基)]-2-(2-羟乙基氨基)-9-乙基嘌呤；化合物686-[(3，4-二甲氧基苄基)氨基]-2-(2-羟乙基氨基)-9-乙基嘌呤。上述式I所示的化合物药学上可接受的盐为式I所示的化合物与合适的酸或碱形成的盐。所述酸为：无机酸，如盐酸、硫酸或磷酸；有机羧酸，如未取代或取代(如被卤代)的1至4个碳原子链烷羧酸，例如：饱和或不饱和的二元羧酸，具体为草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或四邻苯二甲酸，羟基羧酸，具体为抗坏血酸、羟基乙酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或有机磺酸，如未取代或取代(如被卤代)的(C1-C4)烷基磺酸或芳基磺酸，具体为甲磺酸或对甲苯磺酸。本发明提供的式I所示化合物是以2，6-二氯嘌呤为原料，对其2、6、9位进行取代制备得到的。其制备方法的化学反应流程图如图1所示。具体制备方法包括下述步骤：1)使2，6-二氯嘌呤与R3H进行反应，得到式II所示的化合物；2)使式II所示的化合物与R4X进行反应，得到式III所示的化合物；3)使式III所示的化合物与NHR1R2进行反应，得到所述式I所示的化合物；其中，式II中R3的定义同式I，式III中R4的定义同式I。所述R3H中R3的定义同式I，R3H具体可为：苄胺、取代的苄胺、糠胺或2-噻吩基甲胺基。所述取代的苄胺包括3-氟苄胺、4-氟苄胺、2-氟苄胺、2-甲氧基苄胺、3-甲氧基苄胺、2-氯苄胺、4-甲氧基苄胺、3，4-二氟苄胺、3，4-二甲氧基苄胺等。所述R4X中R4的定义同式I，X代表卤素(如氯、溴、碘)，R4X具体可为：碘甲烷、溴乙烷、溴丙烷、溴代环丙烷、溴代环丙甲烷、溴丁烷、氯苄或4-溴丁腈。所述NHR1R2中R1、R2的定义同式I，NHR1R2具体可为：(R)-氨基丁醇、(S)-氨基丁醇、(R)-氨基丙醇、二乙醇胺、2-羟基丙胺、乙二胺、二异丙醇胺、氨基己醇、L-缬氨醇、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇、3-氨基-1，2-丙二醇、D-苯甘氨醇或2-氨基-1，3-丙二醇。上述步骤1)中所述反应在丁醇(BuOH)溶剂中进行。所述反应的反应温度为80-110℃，具体可90℃。上述步骤2)中所述反应在二甲基亚砜(DMSO)溶剂中进行。所述反应还需加入碱作为缚酸剂，所述碱具体可为碳酸钾、碳酸钠等。上述步骤3)中所述反应在惰性气氛中进行。所述反应的反应温度为140-170℃，具体可为160℃；所述反应时间为5h-8h。上述步骤3)中所述反应原配料比n(化合物NHR1R2)∶n(化合物III)＝4∶1-8∶1。本发明的另一个目的是提供式I所示化合物的应用。本发明所提供的式I所示化合物或其药学上可接受的盐的应用包括下述方面：其一，可用于制备预防和/或治疗EV71(肠道病毒71型)病毒(Humanenterovirus71)感染的药物；其二，可用于制备真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂；其三，可用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物；其四，可用于制备细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)抑制剂。所述真核生物为哺乳动物；所述肿瘤细胞为癌细胞；所述癌细胞为肝癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、宫颈癌细胞或喉癌细胞；所述肝癌细胞具体为人肝癌细胞HepG-2或人肝癌细胞PLC/PRF/5，所述肺癌细胞具体为人肺癌细胞A549，所述乳腺癌细胞具体为人乳腺癌细胞MCF-7或人乳腺导管癌细胞BT-474，所述宫颈癌细胞具体为人宫颈癌细胞Hela，所述喉癌细胞具体为人喉癌上皮细胞Hep-2。所述肿瘤为癌，所述癌具体为下述至少一种：肝癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌和喉癌。本发明通过体外细胞试验证明，式I所示化合物(即CDKs小分子选择性抑制剂6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤衍生物)能有效抑制多种肿瘤细胞的生长，可发展成为抗肿瘤的药物。式I所示化合物中优选的具有抗肿瘤作用的化合物可为上述化合物4，5，6，25，26，27，46，48，49，52，53，54。最优选的具有抗肿瘤作用的化合物如下式所示：本发明通过动物实验证明，式I所示化合物(即CDKs小分子选择性抑制剂6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤衍生物)在体内具有显著的抗EV71病毒作用，可发展成为治疗和预防EV71(肠道病毒71型)病毒(Humanenterovirus71)感染的药物。式I所示化合物中优选的具有抗EV71病毒活性的化合物为：化合物05(R)-6-(苄氨基)-2-[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-乙基嘌呤；化合物25(S)-6-(3-氟苄氨基)-2-[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-乙基嘌呤；化合物26(R)-6-(3-氟苄氨基)-2-[[(1-羟甲基)丙基]氨基]-9-乙基嘌呤；化合物276-(3-氟苄氨基)-2-(2-羟乙基氨基)-9-乙基嘌呤；化合物486-(3-氟苄氨基)-2-[[2-羟基-1-甲基-1-(羟甲基)乙基]氨基]-9-乙基嘌呤；化合物496-(3-氟苄氨基)-2-[[2，3-二羟基丙基]氨基]-9-乙基嘌呤；化合物526-(苄氨基)-2-[[2-羟基-1-甲基-1-(羟甲基)乙基]氨基]-9-乙基嘌呤；化合物536-(苄氨基)-2-[[2，3-二羟基丙基]氨基]-9-乙基嘌呤；以式I所示化合物为活性成分制备的预防和/或治疗EV71病毒感染的药物以及预防和/或治疗肿瘤的药物也均属于本发明的保护范围。所述药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。以式I化合物或其药学上可接受的盐为活性成分制备的药物可以制成注射液、悬浮剂、粉剂、片剂、颗粒剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。本发明提供的药物，依不同情况包括特定药物的药物动力学、药代动力学、给药模式、给药途径、受者的年龄、体重、肝肾功能状态、疾病的性质、程度及治疗时限等，以适宜的剂量给药。本发明通过对6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤中2、6、9位基团的修饰，获得了一系列的衍生物。并通过体内外试验证明，其能有效抑制CDK1的活性，并抑制多种肿瘤细胞的生长，而且具有显著的抗EV71病毒作用，可为预防和/或治疗EV71(肠道病毒71型)病毒(Humanenterovirus71)感染和抗肿瘤提供新的有效药物。附图说明图1为制备本发明式I所示化合物的化学反应流程图。图2为式I所示化合物对细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制活性图。图3为化合物4、5、25、26对EV71病毒感染小鼠存活率的影响图。图4为化合物48、49、52、53对EV71病毒感染小鼠存活率的影响图。图5为化合物27对EV71病毒感染小鼠存活率的影响图。图6为化合物4、5、25、26对EV71病毒感染小鼠体重的影响图。图7为化合物48、49、52、53对EV71病毒感染小鼠体重的影响图。图8为化合物27对EV71病毒感染小鼠体重的影响图。具体实施方式下面结合具体实施案例对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于以下实施案例，所述方法如无特别说明均为常规方法。所述材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。实施例16-(苄氨基)-2-[[2-羟基-1-甲基-1-(羟甲基)乙基]氨基]-9-乙基嘌呤(化合物52)的合成在250ml单口瓶中加入2，6-二氯嘌呤(10g，52.91mmol)，正丁醇(150ml)，加热至90℃使其溶解，加入三乙胺(14ml，100.44mmol)，苄胺(6.7ml，61.36mmol)，反应10min后，析出白色固体，继续反应3小时后，停止加热。冷却至5-10℃后，过滤。先用100ml水洗涤，除去三乙胺盐酸盐，再用30ml×3的乙醇洗涤，除去正丁醇和水，真空或常压干燥，得白色固体(化合物3a，即2-氯-6-(苄氨基)嘌呤)14g。在250ml单口瓶中，加入化合物3a(10g，36.01mmol)，加入二甲基亚砜100ml，加热至25℃，加入碳酸钾(10g，72.36mmol)，溴乙烷(5.5ml，73.69mmol)，反应3小时后，加入200ml水，析出白色或类白色固体。搅拌30min后，过滤，用100ml水洗涤。将产品用90-100ml乙醇加热沸腾重结晶，得到鳞片状无色晶体(化合物4a，即2-氯-6-(苄氨基)-9-乙基嘌呤)8.8g。在带有三通活塞50ml单口瓶中，加入化合物4a(2.8g，9.8mmol)，2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇(7.8ml，81.51mmol)，氮气保护，反应温度升至170℃，反应8小时后停止加热，冷却至室温后，加入50ml水，析出白色固体，搅拌30min，过滤。用50ml乙酸乙酯溶解产品，加无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，过硅胶柱(流动相乙酯∶甲醇＝20∶1，v/v)，得化合物A即6-(苄氨基)-2-[[2-羟基-1-甲基-1-(羟甲基)乙基]氨基]-9-乙基嘌呤。结构确证数据如下：1HNMR(CDCl3)：δ1.31(s，3H，CCH3)，1.47(t，3H，CH2CH3)，3.72(d，2H，CH20H)，3.93(d，2H，HOCH2)，4.06(q，2H，CH2CH3)，4.75(bs，2H，CH2)，6.24(bs，1H)，7.32(m，5H，Hphenyl)，7.46(s，1H，H-8)。实施例26-(苄氨基)-2-[(2，3-二羟基丙基)氨基]-9-乙基嘌呤(化合物53)的合成在带有三通活塞50ml单口瓶中，加入实施例1中制备的化合物4a(2.8g，9.8mmol)，2，3-二羟基丙胺(3.8ml，49.00mmol)，氮气保护，反应温度升至160℃，反应5小时后停止加热，冷却至室温后，加入50ml水，析出白色固体，搅拌30min，过滤。用50ml乙酸乙酯溶解产品，加无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，结晶，得化合物B即6-(苄氨基)-2-[(2，3-二羟基丙基)氨基]-9-乙基嘌呤。结构确证数据如下：1HNMR(DMSO-d6)：δ1.34(s，3H，CCH3)，3.52(m，4H，(CH20H)2)，3.89(m，1H，CHNH)，4.00(q，2H，CH2CH3)，4.60(bs，4H，phenyl-CH2，OH)，5.79(bs，1H)，7.32(m，5H，Hphenyl)，7.45(s，1H，H-8)。实施例3(S)-6-(苄氨基)-2-[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-乙基嘌呤(化合物4)的合成在带有三通活塞50ml单口瓶中，加入实施例1中制备的化合物4a(2.8g，9.8mmol)，D-2-氨基丁醇(7.5ml，81.51mmol)，在搅拌条件下，氮气保护，反应温度升至160℃，反应6小时后停止加热，冷却至室温后，加入50ml水，析出白色固体，搅拌30min，过滤。用50ml乙酸乙酯溶解产品，加无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至10ml，结晶，得白色固体。结构确证数据如下：1HNMR(CDCl3)：δ1.03(t，3H，CH2CH3)，1.47(t，3H，CH2CH3)，1.58(m，2H，CH2(CH2)CH3)，3.64(m，1H，CHNH)，3.81(m，1H，HOCH)，3.88(m，1H，HOCH)，4.08(q，J＝7.2，2H，CH2CH3)，4.76(bs，2H，CH2)，4.91(bs，1H)，6.00(bs，1H)，7.30(m，5H，Hphenyl).7.45(s，1H，H-8)实施例4(R)-6-[(3-氟苄基)氨基]-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-乙基嘌呤(化合物26)的合成在250ml单口瓶中加入2，6-二氯嘌呤(10g，52.91mmol)，正丁醇(150ml)，加热至90℃使其溶解，加入三乙胺(14ml，100.44mmol)，3-氟苄胺(7ml，61.36mmol)，反应10min后，析出白色固体，继续反应3小时后，停止加热。冷却至5-10℃后，过滤。先用100ml水洗涤，除去三乙胺盐酸盐，再用30ml×3的乙醇洗涤，除去正丁醇和水，真空或常压干燥。得白色固体(化合物3b，即2-氯-6-(3-氟苄氨基)-嘌呤)14g，收率95.89％。在250ml单口瓶中，加入化合物3b(10g，36.01mmol)，加入二甲基亚砜100ml，加热至25℃，加入碳酸钾(10g，72.36mmol)，溴乙烷(5.5ml，73.69mmol)，反应3小时后，加入200ml水，析出白色或类白色固体。搅拌30min后，过滤，用100ml水洗涤。将产品用90-100ml乙醇加热沸腾重结晶，得到鳞片状无色晶体(化合物4b，即2-氯-6-(3-氟苄氨基)-9-乙基嘌呤)8.8g，产率88％。在带有三通活塞50ml单口瓶中，加入化合物4b(3.0g，9.8mmol)，L-2-氨基丁醇(7.5ml，81.51mmol)，在搅拌条件下，氮气保护，反应温度升至160℃，反应6小时后停止加热，冷却至室温后，加入50ml水，析出白色固体，搅拌30min，过滤。用50ml乙酸乙酯溶解产品，加无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至10ml，结晶，得白色固体。结构确证数据如下：1HNMR(CDCl3)：δ1.01(t，3H，CH2CH3)，1.47(t，3H，CH2CH3)，1.56(m，2H，CH2CH3)，3.62(m，CHNH)，3.82(m，1H，HOCH)，3.88(m，1H，HOCH)，4.07(q，J＝7.2，2H，CH2CH3)，4.76(bs，2H，CH2)，4.91(bs，1H)，6.00(bs，1H)，6.96(td，J1＝8.4，J2＝2.0，1H，Hphenyl)，7.07(d，J＝9.6，1H，Hphenyl)，7.13(d，J＝7.6，1H，Hphenyl)，7.28(m，1H).7.45(s，1H，H-8)。实施例5(R)-6-[(3-氟苄基)氨基]-2-[[(2-羟基)丙基]氨基]-9-乙基嘌呤(化合物27)的合成在带有三通活塞50ml单口瓶中，加入实施例4制备的化合物4b(3.0g，9.8mmol)，乙醇胺(3.0ml，49.00mmol)，在搅拌条件下，氮气保护，反应温度升至160℃，反应5小时后停止加热，冷却至室温后，加入50ml水，析出白色固体，搅拌30min，过滤。用50ml乙酸乙酯溶解产品，加无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至10ml，结晶，得白色固体。结构确证数据如下：1H-NMR(CDCl3)：1.34(t，3H，CH2CH3)，3.30(m，2H，CH2NH)，3.48(m，1H，HOCH2)，4.00(q，2H，CH2CH3)，4.64(bs，2H，CH2)，6.23(bs，1H)，7.02(t，1H，Hphenyl)，7.16(d，1H，Hphenyl)，7.19(d，1H，Hphenyl)，7.32(m，1H，Hphenyl)，7.45(s，1H，H-8)，7.92(bs，1H).实施例6式I化合物在体外对肿瘤细胞的生长抑制作用的活性初筛材料与方法1.肿瘤细胞和药物配置HepG2细胞培养液为含10％胎牛血清的DMEM(GIBCO)培养液。加入衍生物作用前使用含2％胎牛血清的维持液。6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤衍生物用DMSO溶解为20mM，再用PBS稀释到1mM，分装后储存在-20℃备用。2.式I化合物对肝癌细胞HepG2的生长抑制作用肝癌细胞HepG2在含10％胎牛血清的培养基(GIBCO)中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，以8000～10000个细胞/孔将细胞接种至96孔细胞培养板中，次日75～80％长满。用DMEM稀释式I化合物(即6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤衍生物)至200μM。将长满75～80％细胞的含10％胎牛血清的DMEM培养基(GIBCO)的96孔板换成含2％胎牛血清的维持液备用。把式I化合物分别设立10、20μM两个浓度梯度加入96孔板内，每个序列设三个复孔，并设立肿瘤细胞对照组，37℃培养2d。镜下观察式I化合物对细胞形态的影响。利用CellCountingKit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model680)上测定细胞病变程度(以OD450表示)，并以如下公式计算药物的肿瘤抑制率：(OD肿瘤细胞-OD试验)/OD肿瘤细胞×100。重复试验二次，计算平均值。结果式I化合物对肝癌细胞HepG2生长的抑制结果，如表1所示。表1结论化合物4，5，6，25，26，27，46，48，49，52，53，54对肝癌细胞HepG2的增殖抑制率大于50％，可能发展成为抗肿瘤药物。实施例7考察初筛化合物4，5，6，25，26，27，46，48，49，52，53，54对BHK-21正常细胞毒性作用及其CC50材料与方法1.BHK-21细胞和药物配置BHK-21细胞培养液为含7％胎牛血清的DMEM(GIBCO)培养液。加入衍生物作用前使用含0.7％胎牛血清的维持液。6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9一异丙基嘌呤衍生物用DMSO溶解为20mM，再用DMEM(GIBCO)培养液稀释到1mM，分装后储存在-20℃备用。2.6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤衍生物对BHK-21细胞的毒性作用检测将BHK-21细胞铺96孔细胞培养板，次日75～80％长满。将长满75～80％的BHK-21细胞换成含0.7％胎牛血清的维持液备用。把6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤衍生物分别设立20、40、80、160、320μM五个浓度梯度，每个浓度设立三个复孔，并设立不加药物的BHK-21细胞做阴性对照组，37℃培养2d，镜下观察6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤衍生物对细胞形态的影响。利用CellCountingKit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model680)上测定细胞病变程度(以OD450表示)，并计算半数毒性剂量CC50。结果化合物4，5，6，25，26，27，46，48，49，52，53，54对BHK-21正常细胞毒性作用及其CC50，如表2所示。表2化合物CC50(μM)化合物CC50(μM)4215461265175487961934911325755237326211533272718754142实施例8考察化合物4，5，6，25，26，27，46，48，49，52，53，54对多种肿瘤细胞的生长抑制作用及其半数抑制浓度IC50材料与方法1.肿瘤细胞和药物配置A549细胞培养液为含10％胎牛血清的F12K(GIBCO)培养液。HepG2，MCF-7，Hela，PLC/PRF/5细胞培养液为含10％胎牛血清的DMEM(GIBCO)培养液。BT-474细胞培养液为含10％胎牛血清的RPMI1640(GIBCO)培养液。HCT-116细胞培养液为含10％胎牛血清的MCCOY’5A(GIBCO)培养液。Hep-2细胞培养液为含10％胎牛血清的MEM(GIBCO)培养液。加入衍生物作用前使用相应的2％胎牛血清的维持液。6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤衍生物用DMSO溶解为20mM，再用DMEM(GIBCO)培养液稀释到200μM，分装后储存在-20℃备用。2.6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤衍生物对各种肿瘤细胞的生长抑制作用及其半数抑制浓度IC50肿瘤细胞在含10％胎牛血清的培养基(GIBCO)中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，以8000～10000个细胞/孔将细胞接种至96孔细胞培养板中，次日75～80％长满。用DMEM稀释6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤衍生物至200μM。将长满75～80％细胞的含10％胎牛血清的DMEM培养基(GIBCO)的96孔板换成含2％胎牛血清的维持液备用。把6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤衍生物分别设立2.5、5、10、20、40μM五个浓度梯度加入96孔板内，每个序列设三个复孔，并设立肿瘤细胞对照组，37℃培养2d。镜下观察6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤衍生物对细胞形态的影响。利用CellCountingKit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model680)上测定细胞病变程度(以OD450表示)，并以如下公式计算药物的肿瘤抑制率：(OD肿瘤细胞-OD试验)/OD肿瘤细胞×100。重复试验二次，计算平均值。并根据CC50和IC50求得治疗指数TI＝CC50/IC50。结果化合物4，5，6，25，26，27，46，48，49，52，53，54在0-40μM范围内可剂量依赖性的抑制人肝癌细胞HepG2的生长，其IC50及治疗指数TI值如表3所示。表3化合物IC50(μM)治疗指数TI化合物IC50(μM)治疗指数TI414.414.94635.63.5514.811.84817.04.6642.64.54911.89.6259.38.1521721.9267.926.75318.118.12713.713.65415.59.2化合物4，5，6，25，26，27，46，48，49，52，53，54在0-40μM范围内可剂量依赖性的抑制人肺癌细胞A549的生长，其IC50及治疗指数TI值如表4所示。表4化合物IC50(μM)治疗指数TI化合物IC50(μM)治疗指数TI41415.44619.46.5518.79.4487.510.5615.312.6499.711.6256.611.45214.825.22615.613.5531719.22716.411.45425.55.6化合物4，5，6，25，26，27，46，48，49，52，53，54在0-40μM范围内可剂量依赖性的抑制人乳腺癌细胞MCF-7的生长，其IC50及治疗指数TI值如表5所示。表5化合物4，5，6，25，26，27，46，48，49，52，53，54在0-40μM范围内可剂量依赖性的抑制人宫颈癌细胞Hela的生长，其IC50及治疗指数TI值如表6所示。表6化合物IC50(μM)治疗指数TI化合物IC50(μM)治疗指数TI414.414.946532.4514.811.84819.64641.64.64922.15.1259.38.15226.514.1267.926.75333.89.72713.713.654344.2化合物4，5，6，25，26，27，46，48，49，52，53，54在0-40μM范围内可剂量依赖性的抑制人肝癌细胞PLC/PRF/5的生长，其IC50及治疗指数TI值如表7所示。表7化合物IC50(μM)治疗指数TI化合物IC50(μM)治疗指数TI429.37.346323.9523.17.648213.8648.64.04919.75.72519.93.85229.412.726307.05325.812.727209.45434.54.1化合物4，5，6，25，26，27，46，48，49，52，53，54在0-40μM范围内可剂量依赖性的抑制人乳腺导管癌细胞BT-474的生长，其IC50及治疗指数TI值如表8所示。表8化合物4，5，6，25，26，27，46，48，49，52，53，54在0-40μM范围内可剂量依赖性的抑制人喉癌上皮细胞Hep-2的生长，其IC50及治疗指数TI值如表9所示。表9化合物IC50(μM)治疗指数TI化合物IC50(μM)治疗指数TI423.49.24655.22.3520.18.74828.52.8645.44.34920.45.52519.83.85235.310.62613.815.35331.210.52756.63.35438.53.7Roscovitine(即(R)-6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤)对以上7种肿瘤细胞中的IC50及其治疗指数TI如表10所示。表10肿瘤细胞HepG2A549MCF-7HelaPLC/PRF/5BT-474Hep-2IC5025.628.149.225.647.514.251.1TI16.515.18.616.58.929.88.3结论7种细胞(A549，HepG2，MCF-7，BT-474，Hep-2，PLC/PRF/5，Hela)中TI值大于roscovitine：52，266种细胞(A549，Hela，HepG2，MCF-7，Hep-2，PLC/PRF/5)中TI值大于roscovitine：45种细胞(A549，HepG2，MCF-7，Hep-2，PLC/PRF/5)TI值大于roscovitine：534种细胞(Hela，HepG2，MCF-7，PLC/PRF/5)中TI值大于roscovitine：27实施例9考察化合物26，27，52，53对细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependentkinases，CDK)的抑制活性材料与方法采用CDK1-细胞周期素B激酶检测试剂盒(货号：CY-1164，Abnova公司)检测6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤衍生物26，27，52，53对细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependentkinases1，CDK1)的抑制作用。从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂放回铝箔袋内封存于4℃。留空白孔，将样品分别用激酶缓冲液稀释，实验设置阴性对照孔、溶剂对照孔、受试药物孔，实验中每孔加10μl细胞周期蛋白激酶CDK1，10μl样品和80μl激酶反应缓冲液，用封板胶纸封住反应孔，30℃孵育30min后，甩掉孔内液体，每孔加洗涤液350μl，静置30秒后甩尽孔内液体，在厚迭吸水纸上拍干，重复上述操作洗板5次，加100μl试剂盒自带的抗磷酸化Cdc7T376单克隆抗体TK-H7(Anti-phosphoCdc7T376MonoclonalAntibodyTK-H7)，用封板胶纸封住反应孔，25℃孵育30min后，甩掉孔内液体，洗板5次，加入100μl的试剂盒自带HRP标记的抗鼠IgG(HRP-conjugatedAnti-mouseIgG)，用封板胶纸封住反应孔，25℃孵育30min后，甩掉孔内液体，洗板5次，加100μl显色底物，用封板胶纸封住反应孔，25℃孵育5-15min后，加100μl终止液，30min内用酶标仪在450nm波长处检测吸光度。并以如下公式计算药物对激酶的抑制率：(OD溶剂对照-OD试验)/OD溶剂对照×100。结果6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤衍生物26，27，52，53在浓度为5、10、20、40和80μM时对细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependentkinases1，CDK1)的抑制活性见图2，经软件计算52、53、26、27的半数抑制浓度IC50分别为13.6、14.0、18.7、35.6μM。结论6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤衍生物26，27，52，53在浓度为5、10和20μM时对细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependentkinases1，CDK1)有抑制活性。实施例10考察6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤衍生物对EV71病毒感染小鼠存活率影响及对EV71病毒感染所致乳小鼠体重的影响材料与方法1.ICR乳鼠、病毒和对照药物动物模型为SPF级7日龄ICR乳鼠，EV71病毒株为国际标准株BrCr株。阳性对照药物为IFNα-2a。2.6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤衍生物体内抗EV71病毒活性检测订购SPF级7日龄ICR乳鼠12窝，实验开始前对其进行称重并分组。小鼠分别设立6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤衍生物4，5，25，26，27，48，49，52，53组，剂量均为4mg/kg/d，同时设立正常生理盐水对照组、EV71病毒感染对照组、IFNα-2a阳性药物对照组。对已经分组的小鼠进行实验，先在小鼠一侧腰窝处用碘伏进行消毒，然后用75％的酒精进行消毒，接着根据体重注射相应剂量的生理盐水、病毒或药物。正常生理盐水对照组连着注射五天生理盐水；病毒组第一天注射病毒，后面四天注射相同剂量是生理盐水；IFNα-2a阳性药物对照组及6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤各剂量给药组第一天先根据体重注射一定量EV71病毒，1小时后注射药物，以后连续给四天药物，给药结束后持续观察2周，每天称量记录体重并计算存活率。结果EV71病毒感染对照组在病毒感染6天时开始出现死亡，至感染后第14天，存活率降低至20％，6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤衍生物4给药组未显示出显著疗效，而衍生物5，25，26，48，49，52，53，27组均显示出显著的保护作用，在感染后第14天，存活率分别为80％，100％，80％，83.3％，91.7％，81.8％，100％和100％，均高于50％(图3，4，5)。在体重增加方面，6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤衍生物5，25，26，49，52，53，27组小鼠体重增加显著高于病毒感染对照组(图6，7，8)。结论6-(苄氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤衍生物5，25，26，27，48，49，52，53，27可以提高EV71病毒感染小鼠的存活率，减轻EV71病毒感染引起的乳小鼠体重增加缓慢。当前第1页1 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