全真一气汤多糖的工业化提取纯化的方法
【专利摘要】本发明公开了一种全真一气汤多糖的工业化提取纯化的方法，属于中药提取技术，旨在提供一种方法简单，多糖含量高的提取纯化方法；该方法包括称取各组分，除熟地外的其余药材干燥粉碎；将熟地切段，用超声提取法提取，离心分离取上清液；将上清液浓缩，调至药液乙醇含量为75-85％，静置离心分离，取下层沉淀干燥得粗多糖A；取粗多糖A加水溶解，摇匀，酸调节pH至5-6，加入木瓜蛋白酶,酶解，灭活离心除去沉淀，取下层液得粗多糖酶解液A；向粗多糖酶解液A中加入氯仿-正丁醇溶液，震荡，静置过夜，收集上层水相溶液，得到多糖溶液A；加水配制成溶液，调节多糖溶液的pH至4.5-5.5，加入大孔树脂吸附，过滤得粗多糖，将溶液超滤；即可得到精制多糖。
【专利说明】全真一气汤多糖的工业化提取纯化的方法【技术领域】
[0001]本发明涉及一种多糖的提取纯化方法，尤其涉及一种绿全真一气汤多糖的工业化提取纯化的方法；属于中药提取【技术领域】。
【背景技术】
[0002]全真一气汤为明清医学大家冯兆张《冯氏锦囊秘录》中的著名方剂。由熟地黄、白术、人参、麦冬、五味子、附子、牛膝组成。临床广泛用于治疗各种老年虚损性疾病，如胃肠疾病，慢性阻塞性肺病、肺癌、等辩证属气血阴阳俱虚免疫功能低下者，疗效显著。现代研究表明，多糖具有调节免疫，降血脂，抗肿瘤，抗炎，抗衰老等生理功能。
[0003]目前有关全真一气汤多糖的提取研究报道很少，本课题组近年对全真一气汤多糖进行了一定程度的探讨，发现其主要的药理作用为增强免疫力，对正常小鼠及环磷酰胺免疫抑制小鼠的非特异性免疫功能有不同程度的增强作用，可提高环磷酰胺抑制的体液免疫功能，具有肠道粘膜免疫调节作用，其主要机理为升高免疫抑制小鼠血清IL-6和TNF- α水平，刺激免疫抑制小鼠机体的细胞因子分泌，从而达到调节免疫功能的作用。
[0004]陈虹在硕士论文中虽然提供了《全真一气汤总多糖的提取与质量控制初步研究》，但是所得的多糖含量不高，提取率也比较低。
【发明内容】
[0005]针对上述不足，发明目的在于提供一种提取纯化方法简单，多糖含量高的全真一气汤多糖的提取纯化方法。
[0006]为此，本发明提供的技术方案是这样的:该全真一气汤多糖的工业化提取纯化的方法，依次包括下述步骤:
[0007]I)按全真一气汤配方比例称取熟地黄、白术、人参、麦冬、五味子、附子、牛膝，除熟地外，其余药材干燥，粉碎；
[0008]2)将熟地切段，与步骤I)粉碎后的药材混合，用超声提取法提取药材1-3次，每次7-9倍水提取25-35min后粗滤,静置过夜后离心分离,取上清液；
[0009]3)将步骤2)中的上清液浓缩至相对密度为1.15-1.2，用乙醇调至药液乙醇含量为75-85%，静置离心分离，取下层沉淀用乙醇洗涤后于55-65°C真空干燥得粗多糖A ;
[0010]4)取步骤3)粗多糖A加水溶解,摇匀，酸调节pH至5-6,加入木瓜蛋白酶，在45-55°C,酶解4-6h，灭活，离心除去沉淀，取下层液得粗多糖酶解液B ;
[0011]5)向步骤4)粗多糖酶解液B中加入其体积1/4-1/6的氯仿-正丁醇溶液，震荡，静置过夜，收集上层水相溶液，得到多糖溶液B ；
[0012]6)取步骤5)多糖溶液A，加水配制成浓度为3_5mg/ml的溶液，调节多糖溶液的pH至4.5-5.5，加入大孔树脂在45-55°C水浴下搅拌l_3h，过滤的粗多糖B ；
[0013]7)取步骤6)粗多糖B加水制成浓度为0.15-0.25mg/mL的溶液，进行超滤，收集截留液，浓缩后在55-65°C真空干燥，得到精多糖。[0014]进一步的，上述的全真一气汤多糖的工业化提取纯化的方法，步骤I)所述的干燥温度均为60°C。
[0015]进一步的，上述的全真一气汤多糖的工业化提取纯化的方法，步骤2)所述的超声条件为在室温下超2s停2s，功率800w。
[0016]上述的全真一气汤多糖的工业化提取纯化的方法，步骤2)、步骤3)和步骤4)所述的离心条件均为5000rpmX lOmin。
[0017]进一步的，上述的全真一气汤多糖的工业化提取纯化的方法，步骤3)所述的上清液浓缩是在60°C旋转蒸发至药液相对密度为1.15-1.2。
[0018]进一步的，上述的全真一气汤多糖的工业化提取纯化的方法，步骤4)所述的酸为冰醋酸。
[0019]进一步的，上述的全真一气汤多糖的工业化提取纯化的方法，取步骤2)粗多糖A:水:木瓜蛋白酶的质量比是1:50:1.5。
[0020]进一步的，上述的全真一气汤多糖的工业化提取纯化的方法，步骤4)所述的灭活是在沸水浴灭活5min。
[0021]进一步的，上述的全真一气汤多糖的工业化提取纯化的方法，步骤7)所述的超滤进料流速为10-14mL/min，压力为0.08_012MPa，使得透过量与截留量的体积比为1:1，当溶液全部进入超滤柱时，记为超滤一次，将截留液中加200mL蒸馏水，继续超滤，循环25次后，收集截留液。
[0022]与现有技术相比，本发明提供的技术方案:操作简单，多糖含量高，纯度高，并且易于工业化生产，通过脱蛋白，超滤处理后，多糖含量均上升较高。虽然脱蛋白处理本身并没有提高粗多糖中的多糖含量，但是这个步骤对于整个多糖的精制过程是必不可少的。
[0023]全真一气汤具有较显著的临床疗效，对其进行深入的作用机理研究，阐明其科学内涵，具有重要的临床意义。特别是对于其作用的物质基础，有必要进行深入研究。全真一气汤中多种药材含有多糖类成分，而现代研究亦证明，多糖类成分具有多种生理活性，如提高免疫力、抗病毒等。
【具体实施方式】
[0024]下面结合【具体实施方式】对本发明的权利要求做进一步的限制，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改仍在本发明权利要求保护范围之内。
[0025]实施例1
[0026]本发明提供的全真一气汤多糖的工业化提取纯化的方法，依次包括下述步骤:
[0027]I)提取
[0028]按全真一气汤配方比例称取药材饮片，共6剂，除熟地外，其余药材60°C干燥，粉碎为粗颗粒。熟地切成小段。采用超声提取法提取药材2次，每次8倍水提取30min (超声条件:超2s停2s，功率800w，室温)。合并提取液，用尼龙网(200目)粗滤，静置过夜后离心处理(5000rpmX10min)，得上清液，60°C旋转蒸发至药液的相对密度为1.15-1.2，用乙醇调至药液乙醇含量为80%，静置24h，5000rpm离心10min，沉淀用80%的乙醇洗涤一次后于60°C真空干燥得粗多糖A。
[0029]2)脱蛋白[0030]3)取步骤I)粗多糖A2.0g于三角瓶中，加水10mL溶解，摇匀，冰醋酸调节pH至
5.5,加入木瓜蛋白酶3g, 50°C,酶解5h,沸水浴灭活5min, 5000rpmX 1min离心除去沉淀。得粗多糖酶解液。采用Sevag法，在上述酶解液中加入其体积1/5的氯仿-正丁醇溶液，震荡30min，静置过夜，收集上层水相溶液，重复三次，得到脱蛋白粗多糖B。
[0031]3)除色素
[0032]4)取步骤2)脱蛋白粗多糖B，加水配制成浓度约为4mg/ml的溶液，用冰醋酸调节多糖溶液的PH至5.0，加入2g大孔树脂AB-8(重量百分比为5% )，在50°C水浴下搅拌2h，过滤，脱蛋白除色素粗多糖B。
[0033]4)超滤
[0034]取步骤3)脱蛋白除色素粗多糖B80mg，加水制成浓度约为0.2mg/mL的溶液，进行超滤，进料流速为12mL/min，调节压力为0.1MPa，使得透过量与截留量的体积比为1:1，当溶液全部进入超滤柱时，记为超滤一次，将截留液中加200mL蒸馏水，继续超滤，循环25次后，收集截留液，60°C旋转蒸发仪浓缩至少量，于60°C真空干燥后，测多糖含量。
[0035]为了更高的说明本发明与现有技术相比的优点所在，下面给出本发明的研究方法:
[0036]I仪器与试剂
[0037]超声循环提 取机(TGCX2-2B，弘祥隆)，紫外-可见分光光度计(TU-U901，北京普析通用仪器有限责任公司)，恒温水浴锅(HWS-24，上海一恒科学仪器有限公司)，电子天平(XS10OTU，梅特勒-托利多)，真空干燥箱(DZF-6050，上海一恒科学仪器有限公司)，旋转蒸发仪(R-3，BUCHI)。
[0038]熟地黄、白术、党参、麦冬、五味子、附子、牛膝(广东省药材公司中药饮片厂)，大孔树脂(AB-8，天津瑞欧生物科技有限公司)，葡萄糖(sigama)，苯酚，浓硫酸，过氧化氢，活性炭等均为国产分析纯。牛血清白蛋白(纯度> 96%, sigama),考马斯亮蓝,氯仿,正丁醇等均为国产分析纯。
[0039]2.方法与结果
[0040]2.1多糖含量测定
[0041]采用苯酚-硫酸法。
[0042]2.1.1对照品贮备液的配制
[0043]精密称取葡萄糖对照品20.92mg至10mL量瓶中，加水溶解，摇匀，并定容至刻度，即得浓度为0.2092mg/mL的葡萄糖贮备液。
[0044]2.1.2标准曲线的绘制
[0045]分别精密量取对照品贮备液0.1,0.2,0.4,0.6,0.8、1.0mL于1mL具塞试管中，补加水至2.0mL,摇匀。加入5%苯酹溶液ImL,摇匀,迅速加入浓硫酸5mL,置沸水浴中保温15min，取出置冰浴中冷却至室温。另取蒸馏水2.0mL置具塞试管中，加入相应的试剂用上述方法处理，制备空白溶液，在490nm处测定吸光度，用吸光度对葡萄糖质量进行线性回归，得回归方程:Y = 7.404Χ+0.022 (r = 0.9997)
[0046]2.1.3样品的含量测定
[0047]取供试品约10mg，精密称定于50mL量瓶中，加水溶解，摇匀，并定容至刻度。精密量取0.4mL于1mL具塞试管中，补加水至2.0mL，按2.2.2项下方法处理，并测定。[0048]2.2蛋白含量的测定
[0049]采用考马斯亮蓝法。
[0050]2.2.1考马斯亮蓝G-250溶液的配制
[0051]称取考马斯亮蓝G-25025mg于250mL量瓶中，加12.5mL95%乙醇溶解，摇匀，加入25mL85% H3PO4,摇匀后，加入稀释至刻度，5000rpmX 1min离心取上清液备用。
[0052]2.2.2对照品贮备液的配制
[0053]精密称取牛血清白蛋白10.51mg至50mL量瓶中，加水溶解，摇匀，并定容至刻度，即得浓度为0.2102mg/mL的牛血清白蛋白贮备液。
[0054]2.2.3标准曲线的绘制
[0055]分别精密量取对照品贮备液0.0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8、1.0mL于25mL具塞试管中，补加水至2.0mL,摇匀。加入考马斯亮蓝G-250溶液10mL，摇匀，室温放置30min，以蒸馏水为空白，在595nm波长处测定吸光度，用吸光度对牛血清白蛋白的质量进行线性回归，得回归方程:Y = 2.298Χ+1.403 (r = 0.993)
[0056]2.2.4供试品的制备及含量的测定
[0057]取粗多糖约10mg，精密称定于50mL量瓶中，加水溶解，摇匀，并定容至刻度。精密量取2mL于1mL具塞试管中，按2.2.3项下方法处理，测定并计算蛋白含量。
[0058]2.3 提取
[0059]按全真一气汤配方比例称取药材饮片，共6剂，除熟地外，其余药材60°C干燥，粉碎为粗颗粒。熟地切成小段。采用超声提取法提取药材2次，每次8倍水提取30min (超声条件:超2s停2s，功率800w，室温)。合并提取液，用尼龙网(200目)粗滤，静置过夜后离心处理(5000rpmX10min)，得上清液，60°C旋转蒸发至药液的相对密度为1.15-1.2，用乙醇调至药液乙醇含量为80%，静置24h，5000rpm离心10min，沉淀用80%的乙醇洗涤一次后于60°C真空干燥得粗多糖A。分别按2.1，2.2项下方法测多糖、蛋白含量。结果见表1
[0060]2.4脱蛋白
[0061 ] 取粗多糖A2.0g于三角瓶中，加水10mL溶解，摇匀，冰醋酸调节pH至5.5，加入木瓜蛋白酶3g,5(TC,酶解5h,沸水浴灭活5min, 5000rpmX 1min离心除去沉淀。得粗多糖酶解液。采用Sevag法，在上述酶解液中加入其体积1/5的氯仿-正丁醇溶液，震荡30min，静置过夜，收集上层水相溶液，重复三次，分别照2.1，2.2项下方法测多糖及蛋白含量。结果见表1。
[0062]由表1可知，对全真一气汤粗多糖进行脱蛋白处理后，蛋白含量由9.83±0.23%下降到4.61 ±0.09%，但同时多糖的含量由44.18±1.02%下降到37.00±0.74%，结果表明，脱蛋白过程，多糖会有损失。
[0063]表1脱蛋白对粗多糖的多糖含量及蛋白含量的影响(η = 3)
[0064]
【权利要求】
1.一种全真一气汤多糖的工业化提取纯化的方法，其特征在于，依次包括下述步骤: 1)按全真一气汤配方比例称取熟地黄、白术、人参、麦冬、五味子、附子、牛膝，除熟地外，其余药材干燥，粉碎； 2)将熟地切段，与步骤I)粉碎后的药材混合，用超声提取法提取药材1-3次，每次7-9倍水提取25-35min后粗滤,静置过夜后离心分离,取上清液； 3)将步骤2)中的上清液浓缩至相对密度为1.15-1.2，用乙醇调至药液乙醇含量为75-85%，静置离心分离，取下层沉淀用乙醇洗涤后于55-65°C真空干燥得粗多糖A ; 4)取步骤3)粗多糖A加水溶解，摇匀，酸调节pH至5-6，加入木瓜蛋白酶，在45-55°C，酶解4-6h，灭活，离心除去沉淀，取下层液得粗多糖酶解液B ； 5)向步骤4)粗多糖酶解液B中加入其体积1/4-1/6的氯仿-正丁醇溶液，震荡，静置过夜，收集上层水相溶液，得到多糖溶液B ； 6)取步骤5)多糖溶液A，加水配制成浓度为3-5mg/ml的溶液，调节多糖溶液的pH至4.5-5.5，加入大孔树脂在45-55°C水浴下搅拌l_3h，过滤的粗多糖B ； 7)取步骤6)粗多糖B加水制成浓度为0.15-0.25mg/mL的溶液，进行超滤，收集截留液，浓缩后在55-65°C真空干燥，得到精多糖。
2.据权利要求 1所述的全真一气汤多糖的工业化提取纯化的方法，其特征在于，步骤I)所述的干燥温度均为60°C。
3.根据权利要求1所述的全真一气汤多糖的工业化提取纯化的方法，其特征在于，步骤2)所述的超声条件为在室温下超2s停2s，功率800w。
4.根据权利要求1所述的全真一气汤多糖的工业化提取纯化的方法，其特征在于，步骤2)、步骤3)和步骤4)所述的离心条件均为5000rpmX 1min0
5.根据权利要求1所述的全真一气汤多糖的工业化提取纯化的方法，其特征在于，步骤3)所述的上清液浓缩是在60°C旋转蒸发至药液相对密度为1.15-1.2。
6.根据权利要求1所述的全真一气汤多糖的工业化提取纯化的方法，其特征在于，步骤4)所述的酸为冰醋酸。
7.根据权利要求1所述的全真一气汤多糖的工业化提取纯化的方法，其特征在于，取步骤2)粗多糖A:水:木瓜蛋白酶的质量比是1:50:1.5。
8.根据权利要求1所述的全真一气汤多糖的工业化提取纯化的方法，其特征在于，步骤4)所述的灭活是在沸水浴灭活5min。
9.根据权利要求1所述的全真一气汤多糖的工业化提取纯化的方法，其特征在于，步骤7)所述的超滤进料流速为10-14mL/min，压力为0.08_012MPa，使得透过量与截留量的体积比为1:1，当溶液全部进入超滤柱时，记为超滤一次，将截留液中加200mL蒸馏水，继续超滤，循环25次后，收集截留液。
【文档编号】C08B37/00GK104031155SQ201410188735
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年5月6日 优先权日:2014年5月6日
【发明者】张大鹏, 张志敏, 武志娟, 赵雅, 任培华, 梁金羽, 朱敬杰, 韩福国, 刘清飞 申请人:广州医科大学附属第一医院