本发明涉及药物的提取方法，尤其涉及一种海藻硫酸多糖的制备方法。
背景技术：
与经化学修饰或化学加工的同类品种生产工艺不同，海藻硫酸多糖制备方法采用天然生物活性技术。在提取分离纯化过程中，不添加氢氧化铅，氯化钙，季胺盐、乙醚、丙酮等沉淀剂和有机试剂，也不要酸碱加工或磺化化学修饰，只需要食用水和医用乙醇两种制备介质。本工艺既不破坏有效部位天然的化学组成，又避免了提取和纯化过程带来的污染和强酸、强碱对药物的不良影响。在提取海藻硫酸多糖有效组分同时，其它非有效成分，如碘、褐藻胶(褐藻酸及其盐类)、甘露醇等需要有效地去除。海带在我国北方海域产量较大，可以大面积种植。海带收录于中华人民共和国药典一部(195页，2010年版)昆布，为海带科植物海带(LaminariajaponicaAresch)的干燥叶状体。其性状为卷曲折叠成团状，或缠结成把，全体呈黑褐色或绿褐色，表面附有白霜。用水浸软则膨胀成扁平长带状，长50-150厘米，宽10-40厘米，中部较厚，边缘较薄而呈波状。功能与主治为软坚散结，消痰，利水。用于瘿瘤，瘰疬，睾丸肿痛，痰饮水肿。而海藻为马尾藻科植物海蒿子或羊栖菜的干燥藻体，又习称大小叶海藻，海藻性状皱缩卷曲，黑褐色，有的被白霜，长30-60厘米。现有技术中一般都采用海藻为原料提取海藻硫酸多糖，这种方法一是不能充分利用我国北方海域产量较大的海带，二是其提取方法不适用于海带。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种海藻硫酸多糖的制备方法，以期以海带为原料制备海藻硫酸多糖。本发明的海藻硫酸多糖的制备方法，包括以下步骤：S10、将海带置入于其自身质量38－42倍的水中浸泡35－45分钟后，用于其自身质量38－42倍量的水冲洗干净；S20、对海带进行预处理，剔除叶黄、叶碎和发霉的不合格海带，将合格海带切成面积7－10平方厘米的碎片；由于海带呈长带状，适合采用切碎工艺切成碎片有利于提高效率和产率。S30、将海带加入到于其自身质量9－11倍的水中煎煮三次，分别为1.9－2.1小时、1.4－1.6小时、1.4－1.6小时；采用煎煮的方式提取海带中的海藻硫酸多糖能够更充分的将海带中的海藻硫酸多糖提取出来。S40、将三次煎煮液合并后减压浓缩至相对密度1.05－1.15得浓缩液I；由于对煎煮液进行了减压浓缩，使得浓缩液中海藻硫酸多糖的浓度增大，能够更方便的提取海藻硫酸多糖，不但节约乙醇，而且提取的产率高。S50、向浓缩液I中加入乙醇至乙醇体积浓度29－31％，静置过夜后离心得上清液和沉渣；S60、对沉渣进行检测，若沉渣中SO42－的质量百分含量大于5％，向沉渣中加入乙醇至乙醇体积浓度29－31％，静置至分层后离心得上清液；若沉渣中SO42－的质量百分含量小于等于5％，弃沉渣；通过此步骤能够将沉渣中的海藻硫酸多糖提取，使丢弃的沉渣中海藻硫酸多糖的含量较低。S70、将步骤S50及步骤S60中的上清液合并，减压浓缩至相对密度1.1－1.2得浓缩液II；S80、向浓缩液II中加入乙醇至乙醇体积浓度83－86％，静置过夜后，弃上清液，沉淀用体积百分数74－76％的乙醇洗涤后离心；S90、将离心后的沉淀用7－9倍量的水溶解后进行喷雾干燥得海藻硫酸多糖。通过上述的两步水萃取，两步醇析和一步醇溶的安全、科学、简洁的萃取、分离和纯化的生产路线，能够将海带中的海藻硫酸多糖有效提取，并且通过各工艺参数的精心设计，能够提高海藻硫酸多糖的效率和产率。优选的，所述步骤S10中将海带置入于其自身质量40倍的水中浸泡40分钟后，用于其自身质量40倍量的水冲洗干净。优选的，所述步骤S20中，将合格海带切成面积9平方厘米的碎片。优选的，所述步骤S30中，将海带加入到于其自身质量10的水中煎煮三次，分别为2小时、1.5小时、1.5小时。优选的，所述步骤S40中，将三次煎煮液合并后减压浓缩至相对密度1.1得浓缩液I。优选的，所述步骤S50中，向浓缩液I中加入乙醇至乙醇体积浓度30％，静置过夜后离心得上清液和沉渣。优选的，所述步骤S60中，若沉渣中SO42－的质量百分含量大于5％，向沉渣中加入乙醇至乙醇体积浓度30％，静置至分层后离心得上清液。优选的，所述步骤S70中，将步骤S50及步骤S60中的上清液合并，减压浓缩至相对密度1.17得浓缩液II。优选的，所述步骤S80中，向浓缩液II中加入乙醇至乙醇体积浓度85％，静置过夜后，弃上清液，沉淀用体积百分数75％的乙醇洗涤后离心。优选的，所述步骤S90中，将离心后的沉淀用8倍量的水溶解后进行喷雾干燥得海藻硫酸多糖。本发明的海藻硫酸多糖的制备方法能够有效提取海带中的海藻硫酸多糖，具有安全、科学、简洁的优点。附图说明图1为实施例1所制得的海藻硫酸多糖单糖组成气相色谱图。具体实施方式本发明的海藻硫酸多糖的制备方法，包括以下步骤：S10、将海带置入于其自身质量38－42倍的水中浸泡35－45分钟后，用于其自身质量38－42倍量的水冲洗干净；S20、对海带进行预处理，剔除叶黄、叶碎和发霉的不合格海带，将合格海带切成面积7－10平方厘米的碎片；由于海带呈长带状，适合采用切碎工艺切成碎片有利于提高效率和产率。S30、将海带加入到于其自身质量9－11倍的水中煎煮三次，分别为1.9－2.1小时、1.4－1.6小时、1.4－1.6小时；采用煎煮的方式提取海带中的海藻硫酸多糖能够更充分的将海带中的海藻硫酸多糖提取出来。S40、将三次煎煮液合并后减压浓缩至相对密度1.05－1.15得浓缩液I；由于对煎煮液进行了减压浓缩，使得浓缩液中海藻硫酸多糖的浓度增大，能够更方便的提取海藻硫酸多糖，不仅节约乙醇，而且提取的产率高。S50、向浓缩液I中加入乙醇至乙醇体积浓度29－31％，静置过夜后离心得上清液和沉渣；S60、对沉渣进行检测，若沉渣中SO42－的质量百分含量大于5％，向沉渣中加入乙醇至乙醇体积浓度29－31％，静置至分层后离心得上清液；若沉渣中SO42－的质量百分含量小于等于5％，弃沉渣；通过此步骤能够将沉渣中的海藻硫酸多糖提取，使丢弃的沉渣中海藻硫酸多糖的含量较低。S70、将步骤S50及步骤S60中的上清液合并，减压浓缩至相对密度1.1－1.2得浓缩液II；S80、向浓缩液II中加入乙醇至乙醇体积浓度83－86％，静置过夜后，弃上清液，沉淀用体积百分数74－76％的乙醇洗涤后离心；S90、将离心后的沉淀用7－9倍量的水溶解后进行喷雾干燥得海藻硫酸多糖。下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步阐述。实施例11.海藻硫酸多糖生产工艺参数1.1海带选择和鉴定产地：中国北方海域。形式：晾干打捆。鉴定：由专业人员按海藻硫酸多糖质量标准逐一鉴定，剔除叶黄、叶碎、发霉等不合格海带。1.2浸泡工序投料：200千克海带。浸泡方式：分四批，每批50千克放入不锈钢水池中，使海带松开后上下全部浸入40倍量水中。浸泡时间：40分钟。1.3清洗和切碎工序清洗方式：用40倍量水冲洗海带至干净。清洗时间：每批10分钟。切碎尺寸：粒径3厘米大小碎片。1.4水萃取工序取海带碎片放入萃取罐，经过先后三次蒸煮萃取，每次加入10倍量的水，第一次煮沸2小时，第二、三次各煮沸1.5小时。1.5浓缩一三次萃取液集中于浓缩罐进行第一次浓缩。方式：减压浓缩。终浓度：相对密度1.10(50℃热测)。1.6醇沉一浓缩液加入乙醇至体积浓度30％，进行第一次沉淀，静置过夜。1.7离心一离心后收集上清液，并取沉渣样品，进行含量测定。【沉渣检测】按海藻硫酸多糖质量标准进行。1.8沉渣重溶若沉渣SO42->5％时，用30％乙醇再溶沉渣，静置过夜。1.9再离心至沉渣中SO42-<5％时，离心去沉渣，收集上清液。1.10浓缩二离心上清液集中于浓缩罐。方式：减压浓缩。终浓度：相对密度1.17(50℃热测)。1.11醇沉二浓缩液加入乙醇至终浓度85％，静置过夜。1.12洗沉淀倾去上清液，加乙醇至体积浓度75％，洗沉淀，静置过夜。1.13离心二离心后取沉淀样品进行含量测定。1.14喷雾干燥离心后，加8倍量水溶解，喷雾干燥，即得海藻硫酸多糖。制成总量：200千克海带获得5～6千克提取物。喷雾干燥工序后获得3～5千克干粉。得率1.5～2.5％。所得的海藻硫酸多糖单糖组成气相色谱图见图1。1.15海藻硫酸多糖的包装为避光、防潮，喷雾干燥后的海藻硫酸多糖应铝塑密封包装。2.质量检测由上述工艺流程确定，在生产过程中必须通过鉴定、沉渣检测、初检、终检四道质检关卡，按海藻硫酸多糖质量标准进行鉴定和含量测定，本工艺可以确保产品质量的稳定、可控和一致性。海带在淡水浸泡过程中首先溶出的是非有效部位碘和甘露醇，1小时内基本上溶出；有效部位在中性热水中亦可较快地溶出，同时也能溶出少量的非有效部位褐藻胶。为此，我们设计了两步水萃取，两步醇析和一步醇溶的安全、科学、简洁的萃取、分离和纯化的制取工艺路线。重点陈述如下：水浸萃取碘和甘露醇参数的确定首先通过浸泡和洗涤海带的过程，将非有效部位碘和甘露醇溶出。选用同一批烟台海域产全株海带500克，5份，每份3个样品，用40倍的食用自来水洗涤并浸泡，浸泡不同的时间，20分钟换水一次(10分钟和20分钟者不换水)，浸后切碎(3厘米)，提取海藻硫酸多糖的条件完全相同，以SO42-的含量作为监测海藻硫酸多糖质量的指标，见表1。表1海带浸泡洗涤时间对海藻硫酸多糖质量的影响(n＝3)此后，经过多次试验，对上述参数进一步调整，最终确定：对于山东烟台产全株海带用30～40倍的食用清水浸泡40～50分钟，中间换水一次。沸水提取实验室试验工艺选择常压水煮6小时，分四次萃取，每次均加10倍量的水，第一次煎煮2小时；第二次1.5小时；第三次1.5小时；第四次1小时。在中试中，分3次煎煮共5小时与分4次煎煮共6小时的产品质量和产率并无明显区别。最终我们确定了5小时3次提取的提取工艺。中药提取的传统工艺和文献记载的沸水提取多糖的工艺(包括海藻硫酸多糖)，温度条件80℃，90℃，100℃煎煮时间为4h，6h，8h。[参见杜斌，中国药学杂志2002，37卷(9)p657]。减压浓缩参数减压浓缩通过三效浓缩(50～60℃，60～70℃，70～80℃)，至相对密度1.10时开始醇沉。第一次醇沉参数日本西出英一用20％的乙醇除去褐藻胶杂质，而Anno(1966)、王作芸等则用30％的乙醇，我们发现用两种浓度的乙醇所得的沉淀均不含有有效成分，而30％的乙醇所析出的沉淀量要多一倍，再增加乙醇的浓度至35％，沉淀的量稍有增加，且开始出现海藻硫酸多糖的共沉淀的现象。最终确定了第一次醇沉的乙醇浓度为30％。第二次浓缩参数条件与第一次相同，为节省乙醇用量，此次浓缩至相对密度为1.17。第二次醇沉参数萃取液在65％乙醇浓度时开始出现海藻硫酸多糖沉淀。为使海藻硫酸多糖沉淀完全，试验确定采用85％的乙醇浓度，以获得最大量的海藻硫酸多糖的粗产品，又可节省乙醇用量。纯化参数用较低浓度的乙醇洗涤粗产品海藻硫酸多糖。试验后确定，用75％乙醇洗涤效果最佳，见表2。表2乙醇纯化海藻硫酸多糖试验转移率对中试生产的海带及相应成品海藻硫酸多糖的总糖、总蛋白以及硫酸基含量进行检测，结果列于表3。表3海带及海藻硫酸多糖含测(％)结果及转移率(n＝3)最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。