一种深层液态发酵生产樟芝胞外多糖的方法
【专利摘要】本发明公开了一种深层液态发酵生产樟芝胞外多糖的方法，具体的说是一种工业化规模的樟芝胞外多糖的生产方法，该方法是将活化好的樟芝菌种通过接入到种子罐进行扩配，再将扩配好的液体种子接入到特制的产多糖的液态培养基中进行发酵，然后将发酵液进行分离，提取胞外多糖。为了提供胞外糖的产量，本发明优化发酵培养基的配方，针对碳源部分采用了复合组方，既保证了前期菌体的生物量，又保证后期代谢产物的产量，制得不同含量的高品质的多糖，多糖含量可在20‐50％。
【专利说明】一种深层液态发酵生产樟芝胞外多糖的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物【技术领域】，具体涉及一种深层液态发酵生产樟芝胞外多糖的方 法。
【背景技术】
[0002] 樟芝又名樟生薄孔菌，牛樟燕，牛樟芝，红樟芝，樟燕，樟菰，樟窟内菰，红樟，隶属 真菌门，担子菌亚门，层菌纲，多孔菌科，薄孔菌属多年生蕈类，是台湾特有一种珍稀、尚未 开发的名贵食、药用真菌。只生长在台湾山区海拔450?2000公尺间特有的牛樟树树干腐 朽之心材内壁，或枯死倒伏之牛樟木材阴暗潮湿之表面,发现着实不易。樟芝作为台湾特有 的菌种，自然环境中牛樟树是其唯一的寄主，一般真菌不能在其上生长。由于樟芝可造成牛 樟树中心空洞腐朽，加上人对牛樟树乱砍乱伐，致使牛樟树数量相当稀少，目前已被列为一 级保育树种。近百年来，牛樟树难得一见，而能够长出牛樟芝的牛樟树则更少，其结果导致 野生樟芝资源严重短缺。因此樟芝十分珍贵，在港澳台被称为"神芝"，台湾民间则称樟芝为 "森林中的红宝石"。
[0003] 近年来，研究得知樟芝能有效治疗肝病及其它方面如：抗肿瘤、抗病毒、抗过敏、降 血脂、降血糖的疾病。樟芝中含有多种生理活性成分，如多糖、三萜类化合物、超氧歧化酶 (S0D)、腺苷、蛋白质（含免疫蛋白）、多种维生素、微量元素（钙、磷）、核酸、凝集素、氨基 酸、胆固醇、木质素、血压稳定物质等。研究发现，樟芝多糖是樟芝中的主要活性物质，它在 樟芝发酵上清液中的含量高达3%，具有免疫生理活性、预防及控制肿瘤等生理活性，主要 含β - D-glucan(i3 -D-葡聚糖））其作用是透过激发巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞 以及自然杀手细胞等来增强免疫功能，进而达到抗肿瘤的效果。此外樟芝多糖还有强心、降 血压、降血糖、抗血栓等功效。
[0004] 目前国内外对樟芝的研究还不是很透彻，采取的主要培养法是固体发酵法。由于 此法发酵周期长，劳动强度大，占地面积广，受季节限制，而且容易污染，不宜进行纯种发酵 等缺点，导致樟芝发酵规模一直得不到扩大。为此，以生物技术方法进行天然樟芝液体深 层发酵培养可以缩短培养时间，获得大量且纯正的菌丝体和多糖，成本低，可实现发酵工业 的连续化、自动化，提升生产效益，成为十分值得开发的途径。国内外也有少量大专院校的 研究者对樟芝的深层发酵进行过研究，但往往其主要侧重点是如何获取更高的生物量，只 有少部分研究者关注樟芝的功效成分多糖的研究，但往往都仅局限于小试的摇瓶试验，属 于基础研究阶段，并且其生物量和活性产物胞外糖得率比较低，生产成本过于昂贵，其工艺 需进一步提升，若要达到规模化和产业化的生产樟芝多糖还需要进行大量的研究和实验工 作。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了解决工业化规模生产樟芝多糖的技术瓶颈，采用液态发酵生 产樟芝多糖克服了固态发酵周期长、投资大、受季节限制、难以产业化等弊端，采用此发明 能够连续、自动化、产业化的生产出高品质的樟芝多糖。
[0006] 本发明的目的通过以下技术方案实现：
[0007] -种制备樟芝发酵液的方法，该方法包括下述步骤：
[0008] 将樟芝种子培养液接入灭菌后的液体发酵培养基进行深层液态发酵得到樟芝 发酵培养液；所述的深层液态发酵接种量为10?20% (g/100g，下同），通风比为1 : 0· 3 - 1. Ovvm，罐压0· 02?0· 05Mpa，在22?30。。下培养4?7天；所述的液体发酵 培养基为：葡萄糖1-3 %、淀粉1-3 %、蛋白胨0. 1-0. 5 %、麸皮0. 1-0. 5 %、磷酸二氢钾 0. 1-0. 5%、七水硫酸镁0. 1-0. 5%、消泡剂0. 01-0. 05%、20000u/ml的耐高温α -淀粉酶 0. 001-0. 007% (ν/ν)，调节pH值4. 8。上述培养基组成中除高温α-淀粉酶外其余的" ％" 均表示g/l〇〇ml。
[0009] 所述的消泡剂可以为植物油（豆油、菜籽油）类、有机醚类等物质。
[0010] 其中所述的樟芝种子培养液优选通过二级培养获得，具体方法如下：
[0011] 1) 一级种子培养：将经活化摇瓶菌种接入灭菌后的液体种子培养基，接种量为 0· 1?2%，通风比为1 :0.3-L0vvm，罐压0.02?0.05Mpa，在22?30°C下培养6?8天， 得到樟芝一级种子培养液，备用；
[0012] 2)二级种子培养：将步骤1)所得的一级种子培养液接入灭菌后的液体种子培养 基，接种量为10?20%，通风比为1 :0· 3 - 1. Ovvm，罐压0· 02?0· 05Mpa，在22?30°C下 培养4?7天，得到所述的樟芝种子培养液。
[0013] 所述的液体种子培养基优选为：葡萄糖2-4%、蛋白胨0. 1-0. 5%、酵母粉1-3%、 磷酸二氢钾〇. 1-0. 5%、七水硫酸镁0. 1-0. 5%、消泡剂0. 01-0. 05%，调节pH值4. 8。一级 种子罐的容积为100-500L，二级种子罐的容积为1000-5000L，装填量为70-90%。上述培 养基组成中的" ％ "均表示g/l〇〇ml。
[0014] 发酵液培养终点判断标准：发酵液香气浓郁、菌球变碎、滤液浑浊；pH值、还原糖 降至最低并略有波动，pH值3. 0-4.0,还原糖1.0% (g/100g)以下；镜检菌丝细碎，大量孢 子，无杂菌污染。
[0015] 一种樟芝胞外多糖提取的方法，包括下述步骤：
[0016] 1)分离：将按照上述方法获得的樟芝发酵液分离，得到樟芝滤液；
[0017] 2)浓缩：将步骤1)所得的滤液进行采用二级低温浓缩，得到浓缩比重为1. 25? 1.40(50°C热测）的浓缩浆。
[0018] 3)醇沉、烘干：加入浓缩浆重量3-5倍量的95%酒精，用酒精计检测混合液酒 精度约65-80% (v/v)，静置8-16h，将沉淀物进行真空烘干，温度50-75°C，真空度不低于 0· 085MPa ;烘干至干燥物水分含量为3?8% (g/100g)，即得胞外糖。
[0019] 所述的分离优选采用卧螺离心机进行，转速控制在2500 - 3500r/min。
[0020] 步骤2)所采用的二级浓缩为：一级采用1 -3t双效蒸发器浓缩，将发酵液 浓缩到比重为1. 15 - 1. 20(50°C热测），二级采用1 - 3t单效浓缩器浓缩，即将比重为 1. 1 - 1. 20 (50°C热测）的浓缩液继续浓缩到比重为1. 25?1. 40 (50°C热测）的浓缩浆；浓 缩过程均要求控制温度不高于75°C，真空度不低于0. 085MPa。
[0021] 本发明中醇沉是采用1 _3t醇沉罐，醇沉次数越多，胞外糖的含量越高。真空烘干 采用的真空干燥箱，本发明提取的胞外糖含量在20 - 50%。
[0022] 本发明具有以下几个突出的优点：
[0023] 本发明正是针对由小试放大到工业化生产中遇到的技术难题进行研究的，在小试 和中试继续优化发酵培养基（尤其是碳源）、提升生物量和胞外多糖的基础上，解决了放大 过程中遇到的发酵过程参数控制、提取设备选型、优化等难题，最终成功嫁接到10 - 20t发 酵罐进行产业化生产，并顺利生产出高品质的樟芝多糖，真正实现了连续、自动化、产业化 的生产。
[0024] 为了提高目的产物胞外多糖的产量，本发明在发酵培养基的碳源进行了优化和组 合：采用短效葡萄糖和长效淀粉的复合组方。发酵前期以生长菌丝体，提高生物含量为主， 因此培养基中添加了菌体优先选用的葡萄糖碳源，迅速增殖；发酵后期要提高目的产物的 含量，因此碳源提供菌体相对利用较慢的淀粉，并在培养基中添加适量淀粉酶，控制菌体数 量在合适规模，并不断产生代谢物胞外糖。
[0025] 为了提供胞外糖的产量，本发明优化发酵培养基的配方，针对碳源部分采用了复 合组方，既保证了前期菌体的生物量，又保证后期代谢产物的产量。
[0026] 采用本发明可根据市场需求和产品标准，制得不同含量的高品质的多糖，多糖含 量可在20 - 50%。
【具体实施方式】
[0027] 以下通过具体实施例进一步说明本发明。但实施例的具体细节仅用于解释本发 明，不应理解为对本发明总的技术方案的限定。
[0028] 以下实施例使用的樟芝菌株购买于中科院微生物研究所普通微生物中心，菌种编 码CGMCC N0. 0543,以此株菌为例，详细说明本发明的具体方案。但是本发明方法通用于所 有的乌灵参菌，并不仅限于该菌株。
[0029] 实施例1
[0030] 本发明产业化深层液态发酵生产樟芝胞外多糖的方法按下述步骤进行：
[0031] 1、樟芝发酵液的制备：将活化好的樟芝摇瓶菌株按接种量1 %接种于种子培养基 (300L)，其中种子培养基组成为葡萄糖3%、蛋白胨0. 2%、酵母粉1 %、磷酸二氢钾0. 3%、 七水硫酸镁0. 15 %、消泡剂0.02 %，用稀硫酸调节pH值4. 8,通风比为1 :0.3vvm，罐压 0. 03Mpa，26?28°C振荡培养7天即得樟芝一级种子液；将一级种子液按接种量15%接入 二级种子培养基（3000L)，其中二级种子培养基组成为葡萄糖3%、蛋白胨0. 2%、酵母粉 1 %、磷酸二氢钾0. 3%、七水硫酸镁0. 15 %、消泡剂0. 02%，用稀硫酸调节pH值4. 8,通风 比为1 :0. 3vvm，罐压0. 03Mpa，26?28°C培养5天即得樟芝二级种子液；将二级种子液按 接种量18 %接入发酵培养基（7500L)，其中发酵培养基组成为葡萄糖2 %、淀粉2 %、蛋白胨 〇. 3%、麸皮0. 3%、磷酸二氢钾0. 2%、七水硫酸镁0. 2%、豆油0.03%，耐高温α -淀粉酶 (枣庄杰诺酶生物有限公司，20000u/ml) 0. 002% (ν/ν)，用稀硫酸调节pH值4. 8 ;通风比为 1 :0. 5vvm，罐压0. 03Mpa，26?28°C培养7天，发酵至发酵液香气浓郁（牛奶香味）、菌球变 碎、滤液浑浊；pH值降至最低3. 2并略有波动，还原糖降至最低0. 6并略有波动；镜检菌丝 细碎，大量孢子，无杂菌污染，即得樟芝发酵液8850Kg。
[0032] 2、樟芝发酵液分离：将上述樟芝发酵液8850Kg通过卧螺离心机进行分离，得到樟 芝滤液8400Kg和350Kg的湿菌丝体（含水量为75 % )，湿菌丝体可直接低温干燥粉碎制得 发酵樟芝菌粉。具体工艺条件是：转速控制在3000r/min，分离时间在2h。
[0033] 4、低温浓缩：将步骤2所得的樟芝滤液8400Kg真空转移至3t双效蒸发器，在真空 度为0. 085MPa，浓缩温度为65°C条件下浓缩至比重为1. 20 (50°C热测）浓缩液，再将浓缩液 真空转移至1. 5t单效球型浓缩器，在真空度为0. 09MPa，浓缩温度为60°C条件下继续浓缩 至比重为1. 30 (50°C热测）的浓缩浆300kg。
[0034] 5、醇沉、烘干：向盛有300kg浓缩浆的醇沉罐中加入重量1000kg的95%酒精，用 酒精计检测混合液酒精度72 % (v/v)，静置12h，将底部沉淀物分离用真空干燥箱进行烘 干，温度60°C，真空度0.09MPa ;烘干15h得胞外糖75kg。检测水分含量为5%，多糖含量为 32%。
[0035] 实施例2
[0036] 1、樟芝发酵液的制备：将活化好的樟芝摇瓶菌株按接种量1. 5 %接种于种子培 养基（300L)，其中种子培养基组成为葡萄糖3%、蛋白胨0.2%、酵母粉1 %、磷酸二氢钾 0. 3 %、七水硫酸镁0. 15 %、消泡剂0. 02 %，用稀硫酸调节pH值4. 8,通风比为1 :0. 3vvm，罐 压0. 03Mpa，26?28°C振荡培养8天即得樟芝一级种子液；将一级种子液按接种量15%接 入二级种子培养基（3000L)，其中二级种子培养基组成为葡萄糖3%、蛋白胨0.2%、酵母粉 1 %、磷酸二氢钾0. 3 %、七水硫酸镁0. 15%、消泡剂0. 02 %，用稀硫酸调节pH值4. 8,通风 比为1 :0. 3vvm，罐压0. 03Mpa，26?28°C培养6天即得樟芝二级种子液；将二级种子液按 接种量18%接入发酵培养基（15000L)，其中发酵培养基组成为葡萄糖2%、淀粉2%、蛋白 胨0.3%、麸皮0.3%、磷酸二氢钾0.2%、七水硫酸镁0.2%、菜籽油0.03%，耐高温α -淀 粉酶（枣庄杰诺酶生物有限公司，20000u/ml)0. 002% (ν/ν)，用稀硫酸调节pH值4. 8 ;通风 比为1 :0. 5vvm，罐压0. 04Mpa，26?28°C培养7天，发酵至发酵液香气浓郁（有明显的牛奶 香味）、菌球变碎、滤液浑浊；pH值降至最低3. 0并略有波动，还原糖降至最低0. 4并略有波 动；镜检菌丝细碎，大量孢子，无杂菌污染，既得樟芝发酵液17700Kg。
[0037] 2、樟芝发酵液的分离：将上述樟芝发酵液17700Kg通过卧螺离心机进行分离，得 到樟芝滤液16750Kg和800Kg的湿菌丝体（含水量为78% )，湿菌丝体可直接低温干燥粉 碎制得发酵樟芝菌粉。具体工艺条件是：转速控制在3200r/min，分离时间在4. 5h。
[0038] 4、低温浓缩：将步骤2所得的樟芝滤液16750Kg真空转移至3t双效蒸发器，在真 空度为0. 09MPa，浓缩温度为63°C条件下浓缩至比重为1. 18(50°C热测）浓缩液，再将浓缩 液真空转移至1. 5t单效球型浓缩器，在真空度为0. 09MPa，浓缩温度为65°C条件下浓缩至 比重为1. 35 (50°C热测）的浓缩浆550kg。
[0039] 5、醇沉、烘干：向盛有550kg浓缩浆的醇沉罐中加入重量2200kg的95%酒精，用 酒精计检测混合液酒精度70 % (v/v)，静置10h，将底部沉淀物分离用真空干燥箱进行烘 干，温度65°C，真空度-0. 09MPa ;烘干18h得胞外糖132kg。检测水分含量为4%，多糖含量 为 35%。
[0040] 实施例3
[0041] 为更好验证本发明中短效葡萄糖和长效淀粉的复合组方在产业化生产樟芝多糖 的优越性，又做了几个对比试验。试验中只调整了液体发酵培养基中碳源葡萄糖或（和） 淀粉的用量，对比例1中不含有淀粉，葡萄糖浓度为2. 0% ;对比例2中不含有葡萄糖，淀粉 浓度为2. 5%，对比例3中葡萄糖含量为2. 5%，淀粉含量为0. 5% ;其余条件均同本发明实
【权利要求】
1. 一种制备樟芝发酵液的方法，其特征在于该方法包括下述步骤： 将樟芝种子培养液接入灭菌后的液体发酵培养基进行深层液态发酵得到樟芝发酵 培养液；所述的深层液态发酵接种量为10?20 % (g/100g)，通风比为1 :0.3-1. Ovvm， 罐压0. 02?0. 05Mpa，在22?30°C下培养4?7天；所述的液体发酵培养基为：葡萄糖 1-3%、淀粉1-3%、蛋白胨0. 1-0. 5%、麸皮0. 1-0. 5%、磷酸二氢钾0. 1-0. 5%、七水硫酸镁 0.1-0.5%、消泡剂0.01-0.05%、2000011/1111 的耐高温〇-淀粉酶0.001-0.007%卜八），调 节pH值4 8。
2. 根据权利要求1所述的制备樟芝发酵液的方法，其特征在于所述的樟芝种子培养液 通过二级培养获得，具体方法如下： 1) 一级种子培养：将经活化摇瓶菌种接入灭菌后的液体种子培养基，接种量为〇. 1? 2%，通风比为1 :0· 3 - 1. Ovvm，罐压0· 02?0· 05Mpa，在22?30°C下培养6?8天，得到 樟芝一级种子培养液，备用； 2) 二级种子培养：将步骤1)所得的一级种子培养液接入灭菌后的液体种子培养基，接 种量为10?20%，通风比为1 :0· 3 - 1. Ovvm，罐压0· 02?0· 05Mpa，在22?30°C下培养 4?7天，得到所述的樟芝种子培养液。
3. 根据权利要求2所述的一种制备樟芝发酵液方法，其特征是所述的液体种子培养 基为：葡萄糖2-4%、蛋白胨0. 1-0. 5%、酵母粉1-3%、磷酸二氢钾0. 1-0. 5%、七水硫酸镁 0· 1-0. 5%、消泡剂 0· 01-0. 05%，调节 pH 值 4. 8。
4. 根据权利要求1所述的一种制备樟芝发酵液方法，其特征是深层液态发酵的培养 终点：发酵液香气浓郁、菌球变碎、滤液浑浊；pH值、还原糖降至最低并略有波动，pH值 3. 0-4.0,还原糖1.0% (g/100g)以下；镜检菌丝细碎，大量孢子，无杂菌污染。
5. -种樟芝胞外多糖提取的方法，其特征在于该方法包括下述步骤： 1) 分离：将权利要求1所得的樟芝发酵液进行分离，得到樟芝上清液； 2) 浓缩：将步骤1)所得的滤液进行采用二级低温浓缩，得到浓缩比重为1. 25?1. 40 的浓缩浆； 3) 醇沉、烘干：加入浓缩浆重量3-5倍量的95%酒精，用酒精计检测混合液酒精度约 65-80%，静置8-16h，将沉淀物进行真空烘干，温度50-75°C，真空度不低于0. 085MPa ;烘干 至干燥物水分含量为3?8% (g/100g)，即得胞外糖。
6. 根据权利要求5所述的樟芝胞外多糖提取的方法，其特征在于所述步骤1)中所述的 分离米用卧螺离心机进行，转速控制在2500 - 3500r/min。
7. 根据权利要求5所述的樟芝胞外多糖提取的方法，其特征在于所述步骤2)中所采用 的二级浓缩为：一级采用双效蒸发器浓缩，将发酵液浓缩到比重为1. 15 -1. 20,二级采用单 效浓缩器浓缩，即将比重为1. 1 -1. 20的浓缩液继续浓缩到比重为1. 25?1. 40的浓缩浆； 浓缩过程均要求控制温度不高于75°C，真空度不低于0. 085MPa。
【文档编号】C08B37/00GK104087631SQ201410337166
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月15日 优先权日:2014年7月15日
【发明者】王文风, 徐国华, 徐玲, 王英燕, 张芙蓉, 杨亚威, 高岩 申请人:江苏阜丰生物科技有限公司