一种微波-酶法耦合降解壳聚糖的方法
【专利摘要】本发明属于壳聚糖制备【技术领域】，涉及一种微波-酶法耦合降解壳聚糖的方法：首先，将高分子量的壳聚糖溶解在pH值为4-6的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，充分搅拌制成壳聚糖溶液；其次，向制得的壳聚糖溶液中加入质量为壳聚糖质量的0.5-3％的酶，搅拌均匀后将壳聚糖溶液倒入反应瓶中，再将反应瓶放入微波反应器中，并在反应瓶中通入氮气，控制温度在65℃以下、微波功率100-1000W条件下进行降解反应10-180min；降解反应结束后将微波升温至100℃使酶灭活，灭活反应时间为10-15min；最后，用碱性溶液将反应后的溶液pH值调节至7-8，再经过滤除去沉淀，将所得滤液用透析法除去盐离子后冷冻干燥，制得低分子量壳聚糖；其方法操作简单，易于控制，条件温和，环境友好。
【专利说明】一种微波-酶法耦合降解壳聚糖的方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于壳聚糖制备【技术领域】，具体涉及一种微波-酶法耦合降解壳聚糖的方 法，选用pH值为4-6的缓冲溶液为溶剂，通过微波-酶法耦合降解壳聚糖以制备低分子量 壳聚糖。
【背景技术】：
[0002] 壳聚糖又名壳糖胺、脱乙酰基甲壳质、几丁质糖，是由自然界广泛存在的甲壳素经 脱乙酰作用得到的，也是迄今为止发现的唯一的天然碱性多糖。壳聚糖相对分子量大，可以 溶于酸性溶液，但不溶于水和一般有机溶剂，这在很大程度上限制了它的应用；而经过降解 获得的低分子量壳聚糖，不仅能够溶于水，而且具有降胆固醇、降血脂、抗菌、抗肿瘤等生理 活性，能够广泛应用在医药、保健品、农业、化妆品、复合材料等领域。
[0003] 目前降解壳聚糖的方法主要有物理降解法、化学降解法和生物降解法三大类，物 理降解法主要是用微波、超声波、Y射线等方法降解壳聚糖，该方法具有速度快、无副产物、 无环境污染等优点，但是存在容易发生交联反应和产物质量差等缺点；化学降解法主要包 括酸降解法和氧化降解法，例如中国专利2012102227792公开的酸性离子液体水溶液中 H202氧化降解壳聚糖和中国专利2010102227788公开的酸性离子液体水溶液降解法制备低 分子量壳聚糖，以及中国专利201210197107公开的一种微波条件下双氧水氧化降解壳聚 糖的方法，该类方法具有成本低廉、操作简便和便于工业化等优点，但是所用到的酸性溶剂 会对环境造成较大污染且反应过程较难控制；生物降解法主要是指利用酶降解壳聚糖，该 法具有反应条件温和、环境友好和专一性强等优点，但是酶降解法生产周较长且价格昂贵。
[0004] 微波辐射作为一种新型加热方式，具有加热速度快、内外同步加热并传递能量的 特点，微波辐射与酶解耦合作用，其一，不仅加热速度快，而且微波能够使化学键振动或转 动，使得壳聚糖分子内氢键减弱或打开，提高其反应活性，促进反应的进行，使其易被酶催 化降解；其二，微波能够改变酶分子的构象，使其空间结构更易与壳聚糖糖苷键结合，促进 酶解反应进行；其三，微波产生的微声流对底物和酶分子产生冲击，使二者发生接触的几率 增加，更利于降解反应；其四，调整微波功率和提高温度，能够直接使酶灭活，且效率高、工 艺简便，容易控制。近年来，由于生物降解和微波技术符合"绿色、环保"的要求而发展迅速， 在一些生物催化反应体系中，微波具有加快反应速度、提高反应产率以及增加产物的属性 选择性等特点，继而产生微波-酶耦合催化的耦合效应；对很多具体酶促反应而言，适当 的微波辐射与常规加热相比已表现出明显的优越性，因此本发明设计一种微波-酶法耦合 降解壳聚糖的方法，结合了酶解和微波技术的优点，大大提高了降解效率，为壳寡糖及低聚 糖的高效可控制备提供了新的方法。
【发明内容】
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[0005] 本发明的目的在于克服现有技术中壳聚糖降解时酶法降解反应周期长、成本高， 物理降解时产物均一性差的缺点，提供一种物理法和酶解法联用的降解壳聚糖的方法，以 提1?降解效率。
[0006] 为了实现上述目的，本发明涉及的微波-酶法耦合降解壳聚糖方法为：
[0007] (1)将高分子量的壳聚糖溶解在pH值为4-6的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，充分搅 拌制成壳聚糖溶液；
[0008] (2)向步骤（1)制得的壳聚糖溶液中加入质量为壳聚糖质量的0. 5-3%的酶，搅拌 均匀后将壳聚糖溶液倒入反应瓶中，再将反应瓶放入微波反应器中，并在反应瓶中通入氮 气，控制温度在65°C以下、微波功率100-1000W条件下进行降解反应10-180min ;降解反应 结束后将微波升温至l〇〇°C使酶灭活，灭活反应时间为10-15min ;
[0009] (3)用lmol/L的氢氧化钠溶液将经步骤（2)反应后的溶液pH值调节至7-8,再经 过滤除去沉淀，将所得滤液用透析法除去盐离子后冷冻干燥，即制得低分子量壳聚糖。
[0010] 本发明中所述高分子量的壳聚糖是指用高效液相测定的数均分子量为 5.0X105Da-5.0X106Da的壳聚糖；步骤（1)中制成的壳聚糖溶液中壳聚糖的重量百 分比为1-5% ;步骤（2)中加入的酶包括纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶中的一 种或两种以上；步骤（3)中制得的低分子量壳聚糖经高效液相测定，其数均分子量为 5. 6X102Da-l. 7X104Da。
[0011] 本发明与现有技术相比，采用物理法和酶解法相结合，利用微波与酶的耦合作用 使降解反应迅速，大大降低了酶解的反应时间；选用单酶或复合酶降解壳聚糖，比采用专一 性酶成本低；而且在微波耦合作用下所需加酶量较少，酶解完成后直接微波升温灭酶即可； 所得壳聚糖的降解产物分子量更低，分布更窄；其方法操作简单，易于控制，条件温和，环境 友好，成本低廉，产品分子量低，适于广泛推广。
【专利附图】
【附图说明】：
[0012] 图1为壳聚糖与降解产物低分子量壳聚糖的红外光谱比较示意图，其中曲线A代 表壳聚糖，曲线B代表降解产物，横坐标表示波数（cm-1)，纵坐标表示透光率（％ )。
[0013] 图2为壳寡糖标准品高效液相色谱检测聚合度示意图，其中A表示单糖，B表示二 糖，C表示三糖，D表示四糖，E表示五糖，F表示六糖，G表示七糖，Η表示八糖，I表示九糖。
[0014] 图3为降解产物低分子量壳聚糖高效液相色谱检测聚合度示意图，Α表示单糖，Β 表示三糖，C表示四糖，D表示五糖，E表示六糖，F表示七糖。
【具体实施方式】：
[0015] 下面通过实施例对本发明作进一步详细描述，但是本发明并不限于下述实施方 式。
[0016] 实施例1 :
[0017] 用乙酸和乙酸钠配制pH = 5的缓冲溶液100ml，向缓冲溶液中加入lg高分子 壳聚糖（相对分子质量（以下简写为Mw)1.8X106Da)，经高效液相测定其数均分子量为 5. OX lOOTa-5. OX 106Da)，充分搅拌制成壳聚糖溶液；然后向壳聚糖溶液中加入0. 03g纤 维素酶，搅拌均匀后将壳聚糖溶液倒入反应瓶中，再将反应瓶放入微波反应器中，并在反 应瓶中通入氮气，控制温度在55°C、微波功率600W进行降解反应，lOmin后微波升温至 100°C使酶灭活，灭活反应时间为10_15min ;用lmol/L氢氧化钠溶液将反应后的溶液pH值 调节至7-8,再经过滤除去沉淀，将所得滤液用透析法除去盐离子后冷冻干燥得到低分子 量壳聚糖，产率为89% ;经高效液相色谱法测量，制得的低分子量壳聚糖的平均分子量为 2. 6X104Da。
[0018] 实施例2:
[0019] 用乙酸和乙酸钠配制pH = 5的缓冲溶液100ml，向缓冲溶液中加入lg高分子壳聚 糖（Mw = 1. 8 X 106Da，数均分子量5. 0 X l〇roa-5. 0 X 106Da)，充分搅拌制成壳聚糖溶液；然 后向壳聚糖溶液中加入〇. 〇3g纤维素酶，搅拌均匀后将溶液倒入反应瓶中，再将反应瓶放 入微波反应器中，并在反应瓶中通入氮气，控制温度在55°C、微波功率600W进行降解反应， 60min后微波升温至100°C使酶灭活，灭活反应时间为10_15min ;用lmol/L氢氧化钠溶液 将反应后的溶液pH值调节为7-8,再经过滤除去沉淀，将所得滤液用透析法除去盐离子后 冷冻干燥得到低分子量壳聚糖，产率为82% ;经高效液相色谱法测量，所制得的壳聚糖的平 均分子量为9. 6X 103Da ;通过红外谱图分析，降解后壳聚糖的主链结构保持不变，如附图1 所示。
[0020] 实施例3 :
[0021] 本实施例中降解壳聚糖的方法步骤与实施例1和实施例2相同，高分子量壳聚糖 的数均分子量为5. 0 X 105Da-5. 0 X 106Da，其他相关实验数据如表1所示：
[0022]
【权利要求】
1. 一种微波-酶法耦合降解壳聚糖的方法，其特征在于具体步骤为： (1) 将高分子量的壳聚糖溶解在pH值为4-6的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，充分搅拌制 成壳聚糖溶液； (2) 在步骤（1)制得的壳聚糖溶液中加入质量为壳聚糖质量的0. 5-3%的酶，搅拌均匀 后将壳聚糖溶液倒入反应瓶中，再将反应瓶放入微波反应器中，并在反应瓶中通入氮气，控 制温度小于65°C、微波功率100-1000W条件下进行降解反应10-180min ;降解反应结束后将 微波升温至l〇〇°C使酶灭活，灭活反应时间为10-15min ; (3) 用浓度为lmol/L的氢氧化钠溶液将经步骤⑵反应后的溶液pH值调节至7-8,再 经过滤除去沉淀，将所得滤液用透析法除去盐离子后冷冻干燥，制得低分子量壳聚糖。
2. 根据权利要求1所述的微波-酶法耦合降解壳聚糖的方法，其特征在于所述高分子 量的壳聚糖是用高效液相测定的数均分子量为5. OX 105Da-5. OX 106Da的壳聚糖。
3. 根据权利要求1所述的微波-酶法耦合降解壳聚糖的方法，其特征在于步骤（1)中 制成的壳聚糖溶液中壳聚糖的重量百分比为1-5%。
4. 根据权利要求1所述的微波-酶法耦合降解壳聚糖的方法，其特征在于步骤（2)中 加入的酶包括纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶中的一种或两种以上。
5. 根据权利要求1所述的微波-酶法耦合降解壳聚糖的方法，其特征在于制得的低分 子量壳聚糖是数均分子量为5. 6X 102Da-l. 7X 104Da。
【文档编号】C08B37/08GK104098715SQ201410337271
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月16日 优先权日:2014年7月16日
【发明者】刘松, 周苗苗, 李克成, 李鹏程, 邢荣娥, 于华华, 秦玉坤 申请人:中国科学院海洋研究所