发明领域本发明涉及一种使用MycobacteriumfortuitumATCC35855菌种将植物甾醇转化为9α-羟基雄烯二酮的方法，特别是的方法中使用了超声波震荡。
背景技术：
：雄甾4-烯-3，17-双酮(androst-4-ene-3，17-dione，简称：雄烯二酮或AD)是甾体激素类药物不可替代的中间体，对机体起着非常重要的调节作用。可以说几乎所有甾体激素药物都是以AD作为起始原料进行生产的。如用于生产性激素、孕激素、蛋白同化激素及皮质激素，又可用于合成氢化可的松，氧化泼尼松，黄体酮、雌烯醇、地塞米松等100余种药物，也是直接用于生产抗早孕药米非司酮和各类计划生育用药的必不可少的基本原料。如今AD不断被一些发达国家用于开发和生产新的医药主品，如福美司坦(Formestane或Lentaron)，等及类固醇类激素免疫抗原等，目前全世界范围内，AD的应用领域日益拓宽，用AD做原材料生产的医药品种不断增加。由于化学全合成雄烯二酮成本较高，国内外很多科学家一直研究如何通过生物发酵方法得到雄烯二酮。50年代，美国Upjohn公司首先利用侧链上有双链的大豆甾醇和麦角甾醇为原料生产出雄甾-4-烯-3，17二酮(AD)及雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)并以此作为合成甾体药物的原料。近年来，由于甾体药物应用量逐年增加，人们的目光又转到在动植物界中含量较多的胆甾醇，谷甾醇，菜油甾醇等，并被认为是具有巨大潜能的甾体激素类药物的起始原料。20世纪60年代中期，由Sih等首先发现有些微生物可以选择性降解切除甾醇的饱和侧链而得到AD和ADD，70年代初，日本的有马启利用微生物降解胆甾醇生产ADD获得成功，受到许多制药公司的高度重视。为了大量生产类固醇激素，研究者试图使用甾醇为唯一碳源分离微生物和改变甾醇结构用作发酵的底物，并用能防止甾醇核降解的化学添加剂来提高类固醇的收得率，这一努力己获得很大进展(Marsheck等，ApliedMicroobiology，23(1)：72～77，1972)。此外，埃及国家研究中心生物与天然产品化学系的和Sallam等研究发现，利用磷酸盐缓冲液调节底物培养基pH值5.5～7.38可提高生物降解AD、ADD的转化率。Upjohn公司在美国专利No.4，293，644中描述了一种通过分枝杆菌(ATCC29472)的突变株从多种类固醇中得到以高产量的雄-4-烯-3，17-二酮(AD)为主，并有少量雄-1，4-二烯-3，l7-二酮(ADD)的产物的方法。以后的研究发现节杆菌，诺卡氏菌和分枝杆菌等微生物均可用于直接切除甾醇的饱和侧链，在一定条件下得到AD和ADD，这使得微生物转化工业化生产成为可能。在生物发酵法制备AD和ADD的基础上，近年来研发发现如果采用发酵法以9α-OH-AD为原料可以更为便捷的制备皮质激素。根据皮质激素的构效关系，甾体激素的11位具有β羟基才能具有更为强大的药效，按照目前引入11β羟基的普遍技术，需要在9或11位引入α羟基，才便于通过化学方法引入11β羟基。所以雄烯二酮为原料制备皮质激素药物则需要再一次发酵得到9或11位为α羟基的产物。9α-羟基雄烯二酮(雄甾-9α-羟基-4-烯-3，17-二酮)在甾环的9位具有-OH取代基，与雄烯二酮相比便于通过化学方法引入11β羟基，11位具有β羟基才能具有更为强大的药效。这样从植物甾醇就要进行两步发酵，如果能以植物甾醇为原料通过发酵一步得到9α-羟基雄烯二酮，则能够节约大量的人力、物力，更够更有效的提高工作效率。目前，主要存在两条途径获得9α-OH-AD。其一，两步发酵法，即首先经由分枝杆菌对甾醇(谷甾醇、胆甾醇)发酵断侧链，生产AD；再使用其它的微生物(例如诺卡氏或红球菌属)对AD再进行9α-羟基化，例如魏长龙等人(NocardiacanicruriaBF313催化甾体9α-羟基化发酵工艺优化，食品工业科技，2014年18期，320页)报道以雄烯二酮为原料，以NocardiacanicruriaBF313作为实验菌株，研究了以雄烯二酮为原料生物法制备9α-羟基-雄烯二酮的发酵工艺，考察了转化培养基成分、投料方式、初始PH值等因素，灭菌前调PH为7.0，以4％的接种量接种，预培养16小时后以拟结晶方式投加底物，经过48小时的转化，在投料浓度为10g/L情况下，底物转化率可高达97.2％，在投料浓度20g/L情况下，底物转化率也可达87.2％。其二，利用微生物一步法直接发酵甾醇，生产目标产物9α-OH-AD。例如分枝杆菌属亲株的球形原生质体经诱变处理后，选择出一株突变株M.roseum，该突变株在系统分类学上区别于已知的甾醇降解分枝杆菌，能高活力地由甾醇产生9-OH-AD。通常菌株在缺失3-酮甾体-1(2)-脱氢酶的背景下，才可能作为主要代谢产物积累9-OH-AD。分枝杆菌B-8119和其后的M.vccae均证实了分枝杆菌在甾醇转化中存在两种截然不同的酶与3,17-二酮甾体1(2)-脱氢作用有关，它们二者的差别在于对AD和9-OH-AD的专一性。俄罗斯Donova等报道由谷甾醇产生9-OH-AD分枝杆菌突变菌株的研究。在这一工作中，作者应用豆甾醇的选择压力，结合传统诱变作用的合理组合，以获得能够转化豆甾醇成为9-OH-AD的菌株。使用的亲本菌株分枝杆菌sp.Ac-1815D诱变选育过程如下：在琼脂培养基上6/2菌株生长培养期间生长成不同类型的菌落。在谷甾醇培养基上6/2菌株继代生长培养10次后，分离到S-型菌落。获取的最好菌落产生9-OH-AD(标示为6/2S)。此外生物发酵方法研究较多的是菌种，但发酵效果除了与菌种本身密切相关外，菌种在发酵过程中所使用的方法也十分重要。杨英在文章中指出(微生物降解甾醇侧链转化雄甾-4-烯-3，17-二酮的研究进展，微生物学通报，2006年33(6)，142-145)甾醇底物在水溶液培养基中溶解度差和存在严重的产物(底物)抑制的问题一直困扰了整个甾类工业，甾醇是一种疏水性化合物,在水中溶解度极低,这就导致底物与微生物细胞不能很好的接触,使转化率偏低及转化时间延长。采用超声破碎、表面活性剂及有机溶剂来溶解底物虽然取得了一定成果,但表面活性剂和有机溶剂对细胞的活性有一定的抑制从而制约了它的应用。同时以植物甾醇为原料利用Mycobacteriumfortuitum(分支杆菌)菌株发酵得到9α-羟基雄烯二酮，时间较长，往往长达72小时，而长时间发酵的问题在于首先是容易造成微生物过分发酵，将得到的产物转化为9α-羟基睾酮甚至将甾环降解，其次是反应时间过长会使杂菌增加，而培养菌的转化专一性下降，从而增加杂质，第三长时间反应还会造成生产周期、制造成本、人工成本等上升，不利于工业化。所以如何缩短发酵时间就成为另一个需要解决的问题。
技术实现要素：
：本发明提供了一种由植物甾醇组合物为底物制备9α-羟基-雄甾-4烯-3，17二酮(9α-羟基雄烯二酮，9α-OH-AD)的的方法，在具有分支杆菌属微生物的反应器加入植物甾醇组合物，调节PH值大于7，在20-37℃之间进行发酵，使植物甾醇组合物转变为9α-OH-AD，在发酵过程中通过超声波震荡可以促进植物甾醇转化，转化时间缩短1/3以上，并且还可以提高雄甾-4烯-3，17二酮的转化率。一种由植物甾醇组合物为底物通过MycobacteriumfortuitumATCC35855制备9α-羟基-雄甾-4烯-3，17二酮的方法，其特征在于在20-37℃之间进行发酵，并使用超声波震荡。上述的制备方法，其特征在于植物甾醇组合物在发酵液中的浓度为10-100g/L。上述的制备方法，其特征在于植物甾醇组合物在发酵液中的浓度为20-70g/L。上述的制备方法，其特征在于植物甾醇组合物在发酵液中的浓度为60-100g/L。上述的制备方法，其特征在于超声波震荡频率为25-100KHz。上述的制备方法，其特征在于超声波震荡频率为40KHz-100KHz。上述的制备方法，其特征在于超声波震荡频率为50KHz-70KHz。上述的制备方法，其特征在于发酵培养阶段结束前进行超声波震荡。上述的制备方法，其特征在于发酵培养阶段进行到一半前进行超声波震荡。上述的制备方法，其特征在于在种子培养阶段完成后发酵培养阶段开始前进行超声波震荡。上述的制备方法，其特征在于在种子培养阶段完成后发酵培养阶段开始前进行超声波震荡和发酵培养阶段开始后至发酵培养阶段进行到一半前进行超声波震荡。上述的制备方法，其特征在于发酵温度为20-30℃。上述的制备方法，其特征在于发酵反应时间为10-60小时。上述的制备方法，其特征在于发酵过程中PH在7.0-9之间。上述的制备方法，其特征在于培养基含有琼脂、碳源、氮源、PH调节剂、酶诱导剂、酶促进剂、水中的一种或几种。上述的制备方法，其特征在于反应器加入植物甾醇组合物前加入乳化剂。上述的制备方法，其特征在于反应器加入植物甾醇组合物前加入乳化剂，乳化剂为合成乳化剂、植物油类乳化剂中的一种或几种。上述的制备方法，其特征在于合成乳化剂为聚二醇的脂肪酸酯、乙烯氧基加成化合物或商品名为Tegin，Tween和Span的乳化剂中的一种或几种。上述的制备方法，其特征在于植物油类乳化剂为葵花籽油、玉米油、花生油、大豆油、棉籽油中一种或几种。所述植物甾醇组合物来自加工植物油的副产物，所述植物油选自大豆油、菜籽油、玉米油、棉籽油、葵花籽油、橄榄油、亚麻籽油、米糠油中的一种或多种。所述植物甾醇组合物是植物油和植物甾醇组合物的混合物，所述植物油来自大豆油、菜籽油、玉米油、棉籽油、葵花籽油、橄榄油、亚麻籽油、米糠油中的一种或多种。优选大豆油。通过研究我们发现，加入培养菌通过超声波震荡后，微生物将植物甾醇组合物转化为9-OH-AD的速度有了明显的提高，更令人惊奇地是转化率有了明显的提高，从而使9-OH-AD产品的纯度、收率都有了明显的提高。上述实验结果出现可能是由于以下：首先是在发酵过程中进行超声波震荡，可以增加培养菌、植物甾醇、发酵液的碰撞几率，但是将培养菌的细胞壁进行了分解，降低了植物甾醇进入菌体内的难度，可以提高发酵的速度。但令人惊奇地是在在种子培养阶段完成后发酵培养阶段开始前进行超声波震荡，能够将使9-OH-AD的纯度、收率都有了明显的提高，而过往资料往往是在发酵培养进行超声波震荡，仅能产生加快发酵的速度的效果。以下的详细说明帮助本领域技术人员实施本发明。然而，此详细说明并不解释为对本发明范围的过度限制。本领域普通技术人员可以对在此讨论的实施例进行修饰和变化而不背离本发明范围的精神。细菌发酵培养按其用途可分为孢子培养、种子培养、发酵培养三个过程，但这三个过程可以再同一个反应器中完成，也可以在不同的反应器中完成，甚至三个过程可以合并。孢子培养是供菌种繁殖孢子的过程，是能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，并要求不易引起菌种发生变异。所以对孢子培养基的基本配制要求是：第一，营养不要太丰富(特别是有机氮源)，否则不易产孢子。如灰色链霉在葡萄糖－硝酸盐－其它盐类的培养基上都能很好地生长和产孢子，但若加入0.5％酵母膏或酪蛋白后，就只长菌丝而不长孢子。第二，所用无机盐的浓度要适量，不然也会影响孢子量和孢子颜色。第三，要注意孢子培养基的pH和湿度。生产上常用的孢子培养基有：麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米碎屑培养基和用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制成的琼脂斜面培养基。大米和小米常用作霉菌孢子培养基，因为它们含氮量少，疏松、表面积大，所以是较好孢子培养基。大米培养基的水分需控制在21％－50％，而曲房空气湿度需控制在90％－100％。一般该类培养基主要是在实验室内进行菌种传代使用，不参与工业化发酵过程。种子培养是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌体长得粗壮，成为活力强的“种子”为目的。所以种子培养基的营养成分要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也要高些，但总浓度以略稀薄为好，这样可达到较高的溶解氧，供大量菌体生长繁殖。种子培养基的成分要考虑在微生物代谢过程中能维持稳定的pH，其组成还要根据不同菌种的生理特征而定。一般种子培养基都用营养丰富而完全的天然有机氮源，因为有些氨基酸能刺激孢子发芽。但无机氮源容易利用，有利于菌体迅速生长，所以在种子培养基中常包括有机及无机氮源。种子培养基的成分最好能较接近发酵培养基，这样可使种子进入发酵培养基后能迅速适应，快速生长。发酵培养是供菌种生长、繁殖和合成产物的过程。它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成需产物。因此，发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。但若因生长和生物合成产物需要的总的碳源、氮源、磷源等的浓度太高，或生长和合成两阶段各需的最佳条件要求不同时，则可考虑培养基用分批补料来加以满足。发酵培养基也可以叫做生物转化培养基或发酵转化培养基。如果需要，可以加入磷酸盐，镁和/或亚铁离子作为促生长因子；还可加入缓冲液以确保生长在基本中性的pH。开始时，消泡剂可能是有益的。当用于诱导发酵的是分离的细胞或酶而不是完整和生长的微生物时，不需要营养物质的存在；但是无论是何种情形，培养基通常主要为含水的。在此使用的术语“植物甾醇”包括所有的甾醇并且没有限制，例如：谷甾醇，莱油甾醇，豆甾醇，菜籽甾醇(包括二氢菜籽甾醇),链甾醇，chalinosterol，多孔甾醇，穿贝海绵甾醇，麦角甾醇，粪甾醇，科迪甾醇(codisterol)，异岩藻甾醇(isorucosterol)，岩藻甾醇，桐甾醇，神经甾醇(nervisterol),7-烯胆甾烷醇，星鱼甾醇，菠菜甾醇，chondrillasterol，peposterol，燕麦甾醇，异燕麦甾醇，fecosterol，Pollinastasterol，胆甾醇以及它们的所有天然或合成形式和衍生物，包括异构体.并且包括它们所有的氢化对应物(“植物甾烷醇(Phytostanols)”)。植物甾烷醇包括所有饱和或氢化的植物甾醇以及它们的所有天然或合成形式和衍生物，包括异构体。当在说明书全文中存在疑问时，需要了解的是术语“植物甾醇”可包含植物甾醇和植物甾烷醇两者。用于本发明生物转化的甾醇和甾烷醇(stanols)可以通过许多种天然来源获得。例如，它们可以从植物油(包括水生植物)的加工中获得，所述植物油如玉米油和其它植物油，麦胚芽油，大豆提取物，大米提取物，米糠，菜籽油，葵花籽油，芝麻油。它们也可以衍生自真菌，例如麦角甾醇。因此，本发明并不限于甾醇的任何一个来源.美国专利4,420,427中公开了使用溶剂如甲醇从植物油渣中制备甾醇。或者，植物甾醇和植物甾烷醇可以来自林业加工副产品妥尔油树脂(talloilpitch)或制浆皂(pulpingsoap)，如美国专利5,770,749中所述，在此引入作为参考。在本发明中的发酵过程，可以将溶解于适宜溶剂中的或乳化形式的底物(植物甾醇组合物)和微生物培养物一起加入生物反应器中。进行发酵直到达到最大底物转化，即植物甾醇转化为9-OH-AD。只要能促进植物甾醇底物在溶剂中混合，从而最优化微生物培养物对底物的利用率，可以使用任何乳化剂。例如包括但并不局限于聚二醇的脂肪酸酯或乙烯氧基加成化合物和商品名为Tegin，Tween和Span的乳化剂。或者，可以使用增溶剂溶解植物甾醇组合物以形成澄清溶液，从而提供与在生物转化中所用微生物良好的接触。所选的适宜的增溶剂包括二醇(glycol)类和硅氧烷类增溶剂，它们能使高浓度的植物甾醇被溶解于营养培养基中。这将使其与微生物良好接触，减少发酵时间，并得到最终产物的相对高收率。优选先前已知的增溶剂例如葵花籽油、大豆油。发酵培养基优选含有葡萄糖的种子培养基。上述所有培养基可以加入磷酸盐、镁和/或亚铁离子、缓冲液，其中的一种或多种。上述所有培养基，其每升培养基含有玉米浆5-50ml。上述培养基，其每升培养基含有无机盐4-10g。上述所有培养基，其每升发酵培养基含有葡萄糖5-15g。上述所有培养基，其每升培养基含有玉米浆5-50ml，无机盐4-10g，葡萄糖5-15g。上述培养基如是种子培养基，则含有葡萄糖；上述培养基如是发酵培养基，则可以不含葡萄糖。在发酵方法中，优选温度维持在大约20-37℃的范围内，更优选25-35℃。发酵或转化过程一旦完成，即用本领域已知和常规的方法回收9-OH-AD。具体实施方式以下的实施例代表实验室试验.然而，每个都能使用已知的工业技术扩展用于工业规模的应用以实施本发明。以下的实施例中菌种中提到的ATCC是美国标准菌株保藏中心的缩写，该中心是国际菌种保藏机构之一。下述实施例中的植物甾醇是从市场上购买的含量大于95％的产品。实施例1-3菌种：MycobacteriumfortuitumATCC35855。取10个不同批号的玉米浆按照本实施例中的数量和工艺分别进行发酵。除玉米浆外其他的物料均为同一批物料。种子培养阶段：种子培养基(每升)：培养基量：200ml/烧瓶接种物量：每200m1新培养基接种来自琼脂斜面的3ml细胞悬液容器：1000ml锥形瓶搅拌：振荡器(1”throw)200rpm温度：30℃生长时间：72小时培养注解：如果在底部有黄色细胞沉淀形成则表示为良好的培养物生物方法：在培养基中制备用于生物转化的接种物。从琼脂料面(在玻璃试管中培养)接种锥形瓶，在无菌条件下进行接种，移取无菌水(5mL)到琼脂抖面上.用移液管末端轻轻刮下细菌培养物.然后移取该混悬培养物并放入锥形瓶中.在旋转振荡器上进行细菌增殖(200rpm,lhrow,30度)。在培养72小时后，此种子培养物即可转移至生物反应器中。在接种前对种子培养物长期储存是不可取的。在操作中，还可以针对种子进行二级乃至三级培养，将种子培养好，当进入发酵培养基后发酵的时间可以适当延长，以获得更好的生物转化率。甾体发酵培养基(每升)：40ml玉米浆5.2gNaNO3，0.8gNH4H2PO4其余为无菌水底物：30.0g植物甾醇(3.0％)乳化剂：葵花籽油，用量见下表在使用前一天，必需量的玉米浆与水(100ml)混合并在锥形瓶中灭菌(121℃持续20分钟)。在烧瓶或烧杯中混合水(500ml)和培养基组分(除植物甾醇和葵花籽油以外)。用1MNaOH溶液(40g/LNaOH)调培养基的pH值至8.0，将培养基转移至生物反应器中，随后加热至60-70℃。在烧杯中称重植物甾醇(30g)，加入葵花籽油，加热边搅拌混合物，将上述葵花籽油倒入生物反应器中已加热的液体培养基中(60-70℃)，补无菌水至1L，无需搅拌。将发酵罐灭菌(121℃持续30分钟)，然后冷却至30℃。使用上述培养基3L。在发酵罐中使用分枝杆菌进行的生物转化：在带有有效底部搅拌的不锈钢发酵罐中进行生物转化实验。所用发酵罐的主要参数为：发酵罐总体积10升，工作体积3升，接种物量以0.4L，通气量0.3L/L/min，搅拌300rpm。将发酵罐中培养基的温度调至30℃，在无菌条件下加入接种物。整个过程在30±2℃进行。从此阶段开始到最后都监测该过程的pH值和无菌度。10小时以后开始监测底物(植物甾醇)和产物9-OH-AD。此过程中生物转化混合物的pH值通常在1pH单位内变化并未校正。通过分析(HPLC)2小时内当泡沫层中的产物9-OH-AD含量达到不变时，被认为已经完成生物转化，具体发酵时间见下表。发酵过程中施加超声波震荡，具体进行超声波震荡的时间和频率见下表。HPLC测定9-OH-AD与植物甾醇的比例。发酵液用1，2-二氯乙烷抽提，减压浓缩后稀释适当倍数，10000r/min离心除去可能的不溶物，然后高压液相层析色谱柱：Alltima(4.6mm(内径)×250mm)5μm。流动相：石油醚：乙酸乙酯＝6：4，流速：1.0mL/min，温度：室温，检测波长：240nm。结果见下表：孢子培养、种子培养、发酵培养实施例4方法与实施例1-3类似，但投底物浓度变为4％(植物甾醇40g)，发酵培养阶段参数变化如下：在带有有效底部搅拌的不锈钢发酵罐中进行生物转化实验。所用发酵罐的主要参数为：发酵罐总体积10升，工作体积3升，接种物量以0.4L，通气量0.5L/L/min，搅拌400rpm。实验结果见下表实施例5方法同实施例4，但投底物浓度变为7％(植物甾醇70g)，通过上述实施例证明，由植物甾醇组合物为底物通过MycobacteriumfortuitumATCC35855制备9α-羟基-雄甾-4烯-3，17二酮，在超声波震荡的情况下，取得了较好的效果，其转化率明显提高，由此通过常规的技术方法，可以使产品的收率和质量明显提高。尤其是在高浓度投料的情况下，例如7％，通过2次超声波震荡，其转化率明显好于不使用超声波震荡的方法。