技术领域本发明涉及用于大量生产人凝血因子VII衍生物的方法和用于大量生产人凝血因子VII衍生物的细胞系，所述方法包括：a)构建表达载体，所述表达载体包含i)其GC富集区缺少至少一个CCGCCC重复序列的二氢叶酸还原酶(下文中的DHFR)启动子的核苷酸序列、和与其可操作地连接的编码DHFR的核苷酸序列，和ii)巨细胞病毒(CMV)早期基因启动子的核苷酸序列、和与其可操作地连接的编码人凝血因子VII衍生物的核苷酸序列；b)用步骤a)的表达载体转染动物细胞系；c)在DHFR抑制剂存在的情况下培养步骤b)的转染动物细胞系，以选择能够高效表达人凝血因子VII衍生物的细胞系；和d)通过添加选自丁酸钠、维生素K和培养基附加剂的至少一种，培养从步骤c)选择的动物细胞系。
背景技术：
在肝脏中产生并被分泌到血液中的人凝血因子VII(下文中的FVII)是丝氨酸蛋白酶的前体，丝氨酸蛋白酶通过激活凝血因子X或凝血因子IX引起血液凝结(clot)。FVII是具有50,000Da分子量的单链糖蛋白。FVII通过因子Xa、因子XIIa、因子IXa和凝血酶变为活性形式，即分解成双链形式的因子VIIa。已知FVII通过结合至带负电的磷脂A而加强酶活性(Nemerson等,Thromb.Res,1985,40:351～358)。在组织因子和钙离子存在的情况下，因子VIIa将因子X活化为因子Xa，其进而在因子5a、钙离子和磷脂存在的情况下使凝血酶原转化为凝血酶，由此进行体内凝血。总共由406个氨基酸组成的FVII通过精氨酸(第152位氨基酸)和异亮氨酸(第153位氨基酸)之间的单肽键之间的断裂被活化为因子VIIa。结果是，因子VIIa获得这样的结构：其中轻链(由152个氨基酸残基组成)和重链(由254个氨基酸残基组成)经二硫键结合在一起。轻链具有γ羧基谷氨酸结构域(Gla)和两个表皮生长因子(EGF)结构域，而重链具有丝氨酸蛋白酶活性位点。为了在N-末端形成10个羧基谷氨酸(涉及到因子VIIa的生物活性)，需要维生素K(Hagen等.,Natl.Acad.SC.U.S.A,1986,83:2412～2416)。已知这种Gla-结构域涉及结合FVII至包含组织因子的细胞表面(Sakai,等.,J.BiolChem,1990,265:1890～1894)。目前，有两种生产因子VIIa的方法。第一种方法涉及从血浆中分离并纯化FVII和活化FVII形成因子VIIa(Broze,等.,J.Biol.Chem,1980,225:1242～1247)。第二种方法涉及通过培养插入了FVII的DNA序列的动物细胞来获得因子VIIa(欧洲专利申请号：86302855.1)。血浆衍生产品具有低生产效率和供应不稳定性，并且具体地，其在安全性方面具有高风险。相对而言，基因重组产品能够利用基因工程技术克服血浆衍生产品的不足。但是，利用基因重组技术在动物细胞中生产FVII在大多数情况下由于其低表达而具有生产率低的问题。因此，关于使用FVII作为治疗剂，需要建立能够实现大规模生产的细胞系。进一步地，研制高效表达的表达载体对于建立细胞系是至关重要的。
技术实现要素：
技术问题发明人做出了大量工作以找到用于大量生产FVII及其衍生物的方法。结果是，已构建出用于能够利用带有缺少GC富集重复序列的DHFR启动子的载体高效表达FVII的动物细胞系的表达载体，并且已用该表达载体转染动物细胞系，以构建能够稳定地大规模生产FVII的单克隆转染子。当发明人添加了从低到高水平范围的浓度的丁酸钠和维生素K并培养转染子以增加单克隆的FVII衍生物生产水平时，证实在通过添加高浓度的丁酸钠和维生素K培养时，FVII衍生物的表达显著提高，从而完成了本发明。技术方案本发明的一个目标是提供大量生产FVII衍生物的方法，所述方法包括：a)构建表达载体，该表达载体包含i)其GC富集区缺少至少一个CCGCCC重复序列的DHFR启动子的核苷酸序列、和与其可操作地连接的编码DHFR的核苷酸序列，和ii)CMV早期基因启动子的核苷酸序列、和与其可操作地连接的编码FVII衍生物的核苷酸序列；b)用步骤a)的表达载体转染动物细胞系；c)在DHFR抑制剂存在的情况下培养步骤b)的转染动物细胞系，以选择能够高效表达FVII衍生物的细胞系；和d)通过添加选自丁酸钠、维生素K和培养基附加剂的至少一种，培养从步骤c)选择的动物细胞系。本发明另一个目标是提供HMF709细胞系(登录号KCTC12022BP)，其生产FVII衍生物。本发明又一个目标是提供用于大量生产FVII衍生物的方法，所述方法包括通过添加选自丁酸钠、维生素K和培养基附加剂的至少一种，培养能够生产FVII衍生物的HMF709细胞系(登录号KCTC12022BP)。有利效果本发明的方法能够利用包含缺少GC富集重复序列的DHFR启动子的载体实现FVII衍生物大规模高效表达，因此可有效用于制备血友病治疗剂。附图简述图1显示hFVII-SOD1(ATKAVC)表达载体的图谱。图2显示通过ELISA试验测量的、hFVII-SOD1(ATKAVC)在得自用hFVII-SOD1(ATKAVC)表达载体转化的细胞系的菌落中的表达水平。图3显示通过将得自用hFVII-SOD1(ATKAVC)表达载体转化的细胞系的菌落施加至无血清培养基而造成的倍增时间(Td)。图4显示通过ELISA试验测量的、基于丁酸钠的浓度和温度在CHO细胞系中表达的hFVII-SOD1(ATKAVC)。图5显示通过ELISA试验测量的、根据维生素K的浓度在CHO细胞系中表达的hFVII-SOD1(ATKAVC)。图6显示在生物反应器中培养的CHO细胞系的培养物概况。图7显示在生物反应器中使用大豆水解物附加剂培养的CHO细胞系的培养物概况。图8显示在生物反应器中使用酵母提取物附加剂培养的CHO细胞系的培养物概况。图9显示在烧瓶中通过添加各种浓度的酵母提取物培养的CHO细胞系的培养物概况。图10显示在烧瓶中通过添加各种浓度酵母提取物培养的CHO细胞系的表达水平。发明的最佳实施方式为了实现上述目标，一方面，本发明提供用于大量生产FVII衍生物的方法和用于大量生产FVII衍生物的细胞系，所述方法包括：a)构建表达载体，该表达载体包含i)其GC富集区缺少至少一个CCGCCC重复序列的DHFR启动子的核苷酸序列、和与其可操作地连接的编码DHFR的核苷酸序列，和ii)CMV早期基因启动子的核苷酸序列、和与其可操作地连接的编码FVII衍生物的核苷酸序列；b)用步骤a)的表达载体转染动物细胞系；c)在DHFR抑制剂存在的情况下培养步骤b)的转染动物细胞系，以选择能够高效表达FVII衍生物的细胞系；和d)通过添加选自丁酸钠、维生素K和培养基附加剂的至少一种，培养从步骤c)选择的动物细胞系。具体地，步骤a)涉及i)其GC富集区缺少至少一个CCGCCC重复序列的DHFR启动子的核苷酸序列、和与其可操作地连接的编码DHFR的核苷酸序列，和ii)CMV早期基因启动子的核苷酸序列和与其可操作地连接的编码FVII衍生物的核苷酸序列。如本文所用，术语“GC富集区”意指启动子包含的作为DHFR的转录调节因子的CCGCCC重复序列。当所有或部分重复序列通过诸如删除或突变等的方法被人为丢失时，DHFR表达达到最低水平。当在维持表达在最低水平的条件下加入DHFR抑制剂时，细胞可以扩增更高数量的DHFR基因以存活，因此观察到含有DHFR基因的表达载体所包含的目标重组基因也同时被扩增和高度表达。因此，在本发明的示例性方面，GC富集区提供高表达诱导盒，所述高表达诱导盒包括包含缺少至少一个CCGCCC重复序列的启动子的DHFR基因核苷酸序列。优选地，高表达诱导盒包含包括六个或更少CCGCCC重复序列的DHFR启动子，更优选地，包含三个或更少CCGCCC重复序列的启动子，甚至更优选地，包含一个或更少CCGCCC重复序列的启动子，以及最优选地，不含CCGCCC重复序列的启动子。这些CCGCCC重复序列的去除可通过包括下列的方法实现：按照本领域公知的基因重组技术的核苷酸序列取代或删除。在本发明的示例性实施方式中，通过删除包含CCGCCC重复序列的核苷酸序列部分来去除启动子中的部分或全部GC富集区。如本文所用，术语“DHFR”是指利用NADPH作为电子供体将二氢叶酸还原为四氢叶酸的酶。人体中的DHFR由DHFR基因编码。如本文所用，术语“人凝血因子”是指涉及在擦伤导致出血后通过凝血进行身体保护的凝血相关蛋白。凝血是蛋白XII参与所引起的一系列反应。如本文所用，术语“人凝血因子VII”，也被称为前转变素，是指具有50,000Da分子量的热不稳定蛋白，其在肝脏中被合成并且血液浓度为20mg/mL到40mg/mL。FVII可被活化成因子VIIa，从而用作凝血剂来凝血。因子VII的核苷酸序列非限制地包括与能够显示FVII活性的已知序列具有70％、80％、90％和95％，优选97％的序列同源性的核苷酸。核苷酸序列可优选地是SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。如本文所用，术语“人凝血因子VII衍生物”是指能够产生构成FVII的氨基酸或化学残基的删除、添加和/或取代的物质。具体地，这些衍生物可具有可被增加或对其而言新添加作为治疗蛋白的有利特征，因为通过氨基酸或化学残基的删除、添加和/或取代，已包括有额外的功能，如体内稳定性增加、储藏能力提高、活性增加和其它成分结合位点的包含等。在本发明中，FVII衍生物可以是添加了具体氨基酸序列(一个或多个)的FVII，尤其在C端。添加的氨基酸序列可以是肽连接体。优选地，可包括部分超氧化物歧化酶1(下文中的SOD1)序列，并且具体地，可包括SOD1(ATKAVC,SEQIDNO:5)的SEQIDNOS:1到6。如本文所用，术语“SOD1(超氧化物歧化酶1)”是指催化体内将超氧化物，氧自由基，分解为氧和过氧化氢的歧化反应的酶。已知SOD1在几乎所有暴露于氧的细胞中执行主要的抗氧化防护机制。利用SOD1衍生序列(常在体内找到的一种蛋白质)可降低针对添加序列的免疫原性。如本文所用，术语“载体”是指用于将核苷酸序列克隆和/或转移至宿主细胞中的任何媒介。载体可以是复制子，另一DNA片段可与之缀合以实现缀合片段的复制。术语“复制子”是指在体内充当DNA复制的自主单元的任何遗传单元(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒等)，即，能够在其自身控制下复制的遗传单元。术语“载体”包括在体外、离体或体内用于将核苷酸序列引入宿主细胞的病毒和非病毒载体。术语“载体”也可包括微环DNA。例如，载体可以是没有细菌DNA序列的质粒。富含CpG区域的细菌DNA序列的去除已被实施以减少转基因表达沉默和带来质粒DNA载体的更持久表达(Ehrhardt,A.等(2003)HumGeneTher10:215-25；Yet,N.S.(2002)MoITher5:731-38；Chen,Z.Y.等(2004)GeneTher11:856-64)。术语“载体”也可包括转座子如睡美人(SleepingBeauty)(Izsvak等J.MoI.Biol.302:93-102(2000))或人工染色体。在本发明中，术语“表达载体”(其可通过表达凝血因子而高效表达目标蛋白质)可以是这样的载体：包含i)自其GC富集区缺少至少一个CCGCCC重复序列的DHFR启动子的核苷酸序列、和与其可操作地连接的编码DHFR的核苷酸序列。例如，表达载体可包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体和病毒载体，如腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺伴随病毒载体等，优选质粒载体。表达载体可进一步包括编码FVII衍生物的核苷酸序列，并且可通过表达该表达载体来高效地表达目标FVII衍生物。优选地，进一步包括编码FVII衍生物的核苷酸序列的表达载体可以是图1中描述的pXOGC-FVII-ATKAVC载体。FVII衍生物可在DHFR基因启动子下表达，或其表达可通过另外的启动子来控制。优选地，可通过另外的启动子控制FVII衍生物表达。本领域所公知的这些启动子可选自巨细胞病毒(CMV)启动子、LTR启动子、EFα启动子、SV40启动子和TK启动子，并且被本领域普通技术人员使用，但不局限于此。用于在动物细胞系中诱导高表达的本发明表达载体优选地可进一步包括动物细胞抗性基因，用作动物细胞中永久表达的可选择标记。动物细胞抗性基因包括本领域常用的那些，如新霉素抗性基因、博来霉素(zeomycin)抗性基因、潮霉素抗性基因、芽生菌素(blastomycin)抗性基因等，但不局限于此。此外，本发明的表达载体可进一步包括载体的一般构成元件，如复制起点和多腺苷酸化信号、其它转录控制元件等，但不局限于此。优选地，本发明的步骤(b)涉及用步骤a)的表达载体转染动物细胞系。如本文所用，术语“转化(transformation)”或“转染(transfection)”是指由在宿主细胞中引入外源基因以使引入基因自我复制或插入宿主基因组所引起的任何人工遗传改造。在细胞内转化本发明载体的方法可包括将核苷酸序列引入细胞的任何方法，并且可通过选择本领域已知的适当标准技术来实施。该技术可包括电穿孔、磷酸钙共沉淀、逆转录病毒感染、显微注射、DEAE-葡聚糖、阳离子脂质体钙等，但不局限于此。具体地，在本发明中，借助于脂转染胺(lipofectamine)，表达重组蛋白的载体被转化到CHO细胞中。进一步地，在本发明中，动物细胞系的培养可在本领域已知的适当培养基培养条件下完成。培养过程可容易被本领域普通技术人员依据选择的动物细胞系调整和使用。培养过程可根据细胞生长类型被分为悬浮培养和附着培养(贴壁培养，attachmentculture)，以及根据培养方法被分为分批式方法、补料分批式方法和连续式方法。用于培养的培养基必须充分满足具体细胞系的要求。对于培养动物细胞，培养基可包含各种成分如碳源、氮源和微量元素。可用碳源的实例可包括碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；脂肪，如大豆油、向日葵油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇，如甘油和乙醇；和有机酸，如乙酸。这些碳源可被单独或组合使用。可用氮源的实例可包括有机氮源，如蛋白胨、酵母提取物、肉汤、麦芽提取物、玉米浆(CSL)和大豆；和无机氮源，如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可被单独或组合使用。此外，可进一步包括氨基酸、维生素、适合的前体等。此外，培养基中可加入DHFR抑制剂，如甲氨蝶呤。如上所述，这是由于根据本发明示例性实施方式的蛋白质重组方法旨在于短期内有效地建立系统，通过该系统载体中的DHFR可以通过如下被扩增和选择：用根据本发明的表达载体转染DHFR缺陷型动物细胞和添加DHFR抑制剂，从而扩增重组基因。目标重组蛋白需要其在动物细胞系中表达。为了这个目的，本发明中使用的优选动物细胞的实例可包括中国仓鼠卵巢(CHO)癌细胞系、猴肾细胞系(COS7)、NSO细胞系、SP2/0细胞系、W138细胞系、幼仓鼠肾(BHK)细胞系、MDCK细胞、骨髓瘤细胞系、HuT78细胞系、293细胞系等，但不局限于此。本领域普通技术人员利用本发明的DHFR可容易选择适用于扩增技术的动物细胞系。优选地，在本发明中，细胞系可以是DHFR基因缺陷型的。如本文所用，术语“用重组载体转化的宿主细胞”——指用包含编码至少一种目标蛋白的基因的载体转染的细胞——可以是重组哺乳动物细胞、啮齿类动物细胞，优选动物细胞或动物源细胞，并且最优选CHO细胞。由于目的是在宿主细胞是CHO细胞时稳定地表达基因和在细胞中扩增基因的拷贝数，具有与CHO细胞互补的DHFR基因的载体(例如，pCHOI等)可被引入核苷酸合成途径缺陷型CHO细胞中，并用甲氨蝶呤(下文中的MTX)扩增。在本发明的示例性实施方式中，使用了DHFR缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系(CHO/dhfr-)。即，根据本发明，用包含FVII编码基因的表达载体转染DHFR缺陷型CHO细胞。在转化的CHO细胞中，扩增了足量的基因并且提供了生产力得到验证的动物细胞系——甚至在MTX浓度为100nM或更少，并且更优选50nM或更少时。优选地，本发明的步骤c)涉及在DHFR抑制剂存在的情况下培养步骤b)的转染动物细胞系，以选择能够高效表达FVII衍生物的细胞系。优选地，从步骤c)选择的细胞系可以是HMF709(KCTC12022BP)。在本发明的示例性实施方式中，选择的细胞系被命名为HMF709，并且HMF709细胞系于2011年9月23日被保藏于布达佩斯条约下的国际保藏机构——韩国生命工学研究院(KoreanResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology，111Gwahak-ro，Yuseong-gu，Daejeon，韩国)的KCTC韩国生物资源中心(KoreanCollectionforTypeCulture)，登录号为KCTC12022BP。另一方面，从步骤c)选择的细胞系可被用于使用无血清培养基(EX-CELLCHO培养基，Sigma，美国，目录编号14360C)的悬浮培养。在本发明的示例性实施方式中，HMF709(KCTC12022BP)被用于使用无血清培养基(EX-CELLCHO培养基，Sigma，美国，目录编号14360C)的悬浮培养。进一步地，在本发明中，步骤d)涉及通过添加选自丁酸钠、维生素K和培养基附加剂的至少一种，培养从步骤c)选择的动物细胞系。如本文所用，术语“丁酸钠”，已知是通过抑制组蛋白脱乙酰基酶引起组蛋白高度乙酰化的物质，已知其诱导细胞分化和基因表达。在本发明中，丁酸钠被用作培养基附加剂，以大量生产FVII衍生物。其用量可容易由本领域普通技术人员基于培养条件选择，并且可优选地以0.1mM到4.0mM的浓度添加，更优选在步骤d)的培养温度为32.5℃到35.0℃时以1.1mM到3.5mM的浓度添加，以及在培养温度为31℃到32.5℃时以1.2mM到2.0mM的浓度添加。具体地，当步骤d)的培养温度为33.0℃时，丁酸钠可以1.5mM的浓度添加。FVII衍生物可在DHFR基因启动子下表达，或其表达可通过另外的启动子来控制。优选地，通过另外的启动子控制FVII衍生物的表达。本领域公知的这些启动子可选自CMV启动子、LTR启动子、EFα启动子、SV40启动子和TK启动子，并被本领域普通技术人员使用，但不局限于此。如本文所用，术语“维生素K”——总体上涉及所有维生素K1(叶绿醌)、K2(甲基萘醌)和前体K3(甲萘醌)——是一类促进凝血的脂溶性维生素。维生素K中的“K”源自于德国词语“koagulation”，其意为凝结。具体地，已知维生素K通过参与凝血蛋白如凝血酶原的形成来协助正常的凝血。进一步地，已知维生素K在主要存在于骨骼中的骨钙素蛋白的羧化中发挥作用。在本发明中，维生素K可以是维生素K1或K3，具体地K1，但不局限于此。如本文所用，术语“培养基附加剂”包括所有可加入能够培养细胞和对象的培养基的成分，并且具体地，可促进动物细胞系的细胞存活和细胞增殖或蛋白质合成，但其不局限于此。在本发明中，培养基附加剂可具体地是大豆水解物或酵母提取物。0.1g/L到3g/L浓度的大豆水解物或酵母提取物可被加入培养基。在本发明的示例性实施方式中，分别制备了两种诱导型高表达盒，其中一种只包含一个来自DHFR启动子的CCGCCC重复序列，而另外一种完全不包含来自DHFR启动子的CCGCCC重复序列。使用了利用包含这些盒的表达载体转化的大肠杆菌(E.coli)细胞系。在发明人的在先发明中，该细胞系于2006年10月2日被保藏在位于Yuseong-gu，Daejeon，韩国的韩国生命工学研究院的基因文库中，登录号分别为KCTC10991BP和KCTC10992BP。为了诱导目标重组蛋白的高表达，可利用该细胞系来构建进一步包括编码FVII衍生蛋白的基因的表达载体——通过利用克隆方法如基因重组技术分离包含来自该细胞系的高表达诱导盒的表达载体。图1所示的pXOGC-FVII-SOD1(ATKAVC)载体被制备作为本发明中使用的表达载体。用该表达载体转化的CHO细胞系在补充有丁酸钠、维生素K或培养基附加剂(大豆水解物或酵母提取物)的培养基中被培养，以大规模生产FVII衍生物。首先，如图4证实，丁酸钠的添加增加了hFVII-SOD1(ATKAVC)的生产水平，具体地在33℃下、丁酸钠浓度为1.5mM。进一步地，如图5证实，以预定量维生素K3设置为对照，维生素K1添加量的增加使FVII衍生物的表达以浓度依赖性方式增加，而无任何细胞毒性——即使在高量加入后。也就是说，hFVII-SOD1(ATKAVC)产量显示随着被加入其中的维生素K1浓度的增加而增加。最后，在表1和图6到8中可见，当丁酸钠或培养基附加剂(大豆水解物或酵母提取物)用作对照时，在分别添加1g/L的大豆水解物和1g/L的酵母提取物时，hFVII-SOD1(ATKAVC)的产量增加。具体地，当添加大豆水解物时，观察到更高的产量增加。进一步地，当在上述细胞系中生产FVII衍生物时，除了添加丁酸钠，本发明还可进一步包括大规模纯化生产的FVII衍生物。进一步地，本发明可进一步包括活化生产的FVII衍生物。在本发明的示例性实施方式中，DHFR启动子的GC富集序列被人工删除以最小化DHFR表达，并且DHFR抑制剂被添加以扩增引入的基因。通过细胞系中单个细胞的有限稀释和基因扩增，获得了单克隆细胞系。通过添加丁酸钠、维生素K或培养基附加剂，由此获得的单克隆细胞系在无血清培养基中被大规模培养，以生产FVII衍生物。此外，生产了纯化和活化的FVII衍生物。此外，本发明提供用于大量生产FVII衍生物的方法，包括通过添加选自丁酸钠、维生素K和培养基附加剂的至少一种，培养能够生产FVII衍生物的HMF709细胞系(登录号KCTC12022BP)。另一方面，本发明提供用于生产FVII衍生物的细胞系。本发明的细胞系可优选是HMF709细胞系(KCTC12022BP)。在本发明的示例性实施方式中，选择了用hFVII-SOD1(ATKAVC)表达载体转化并且在DHFR抑制剂存在的情况下培养以高效表达FVII衍生物的细胞系。然后，具有最高FVII衍生物表达能力的细胞系被选择，并且于2011年9月23日保藏于韩国生命工学研究院(KoreanResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology，111Gwahak-ro，Yuseong-gu，Daejeon，韩国)的KCTC韩国生物资源中心(KoreanCollectionforTypeCulture)，登录号为KCTC12022BP。发明实施方式在下文中，将参考以下实施例详细地描述本发明。但是这些实施例仅以示例为目的，本发明的范围不局限于这些实施例。实施例1：构建用于重组FVII表达的表达载体(pX0GC-hFVII)1-1.获得人FVII基因首先，通过聚合酶链式反应(PCR)获得包含信号序列的人FVII基因。关于FVII基因的扩增，利用人胎肝(humanfetalliver)cDNA文库(TAKARABIOInc.，美国)作为模板以及下文所示SEQIDNO：1和2的正向和反向引物进行PCR。在使包含聚合酶、引物、cDNA文库和dNTP的反应混合物在95℃下变性1分钟后，进行30个循环的反应(在95℃下30秒，在60℃下30秒，和在68℃下90秒)，然后在68℃下反应5分钟。具体地，为了便于克隆，将BamHI识别位点插入SEQIDNO：1所示的引物，并且将XhoI识别位点插入SEQIDNO：2所示的引物。引物示于表1。【表1】用于扩增人FVII基因的引物从PCR获得的大小为约1.3kb的PCR产物的核苷酸序列通过DNA测序得到验证，并且显示具有SEQIDNO：3所示的核苷酸序列。1-2.构建重组FVII表达载体(pX0GC-FVII)关于在CMV启动子控制下的表达，将实施例1-1中获得的FVII的PCR产物被克隆到动物细胞表达载体pX0GC载体中。pX0GC载体——即包含缺少至少一个CCGCCC重复序列的DHFR启动子的核苷酸序列和与其可操作地连接的编码DHFR的核苷酸序列的表达载体——是准备用于诱导重组蛋白(韩国专利号880509)的高表达的载体。具体地，将由PCR获得的1.3kb长的FVII基因消化——通过与限制性内切酶BamHI和XhoI一起在37℃下培育2小时，并将其施加于PCR纯化试剂盒(Qiagen，美国)，获得消化的DNA片段。进一步地，将动物细胞表达载体pX0GC载体也用相同的限制性内切酶(即BamHI和XhoI)在上述相同条件下消化，并且通过电泳分离和纯化。将消化的DNA片段和pX0GC载体混合，并利用T4DNA连接酶克隆，从而制备包含FVII基因的表达载体(pX0GC-FVII)。实施例2：构建重组FVII衍生物的表达载体利用包含FVII基因的表达载体(pX0GC-FVII)获得了编码FVII衍生物的多核苷酸，其中部分SOD1与FVII的C端缀合，并且构建了能够表达该衍生物的表达载体。2-1.获得人FVII衍生物基因构建用于表达重组FVII衍生物的表达载体(pX0GC-FVII-ATKAVC)，其包含编码SOD1SEQIDNO：1到6(ATKAVC，SEQIDNO:5)的多核苷酸——在实施例1中制备的表达载体pX0GC-FVII中添加的FVII基因的3’端。具体地，利用表达载体pX0GC-FVII作为模板以及下文显示的SEQIDNO：6和7所示的正向和反向引物，进行PCR反应(在95℃下变性1分钟；30个循环的反应(在95℃下60秒，在60℃下60秒，和在68℃下90秒)，然后在68℃下反应5分钟)。具体地，为便于克隆，将EcoRI识别位点插入SEQIDNO：6的引物，并且将XhoI限制性识别位点插入SEQIDNO：7的引物。然后，鉴定从上文PCR反应获得的约1.4kb长的PCR产物的核苷酸序列(SEQIDNO：8)。【表2】用于扩增人FVII基因的引物2-2.构建重组VII衍生物-表达载体(pX0GC-FVII)关于在CMV启动子控制下的表达，将上文获得的FVII衍生物的PCR产物克隆到动物细胞表达载体——pX0GC载体——中。具体地，将PCR产物通过与限制性内切酶EcoRI和XhoI在37℃下培育2小时来进行消化，并且利用PCR纯化试剂盒(Qiagen，USA)获得消化的DNA片段。进一步地，将动物细胞表达载体pX0GC载体也用相同限制性内切酶，即EcoRI和XhoI，在上述相同条件下消化，并且通过电泳分离和纯化。将消化的DNA片段和pX0GC载体混合，并且利用T4DNA连接酶克隆，从而制备包含FVII基因的表达载体(pX0GC-FVII-ATKAVC)。实施例3：构建表达人FVII衍生物(hFVII-SOD1(ATKAVC))的细胞系使用实施例2中构建的表达载体表达hFVII衍生物。3-1.使用CHO细胞系转化FVII衍生物(pX0GC-FVII-ATKAVC)将实施例2-2中制备的重组表达载体pX0GC-FVII-ATKAVC引入其中核酸生物合成过程由于DHFR基因损坏而不完整的DG44/CHO细胞系(CHO/dhfr-)(Urlaub等,Somat.Cell.Mol.Genet.,12,555-566,1986)中，以获得转化体，并且在该转染子中表达FVII-ATKAVC衍生物。具体地，培养DG44/CHO细胞系至足以覆盖培养容器底部的80％到90％，然后，将细胞用Opti-MEM(Gibco，目录编号51985034)洗涤三次。同时，将3mLOpti-MEM和5μg表达载体(pX0GC-FVII-ATKAVC)的混合物以及3mLOpti-MEM和20μL脂转染胺(lipofectamin)(Gibco，目录编号18324-012)的混合物分别置于室温30分钟。然后，将每种混合物混合，加入培养的DG44/CHO细胞系，并且在37℃、5％CO2的条件下培养约18小时，从而将表达载体pX0GC-FVII-ATKAVC引入DG44/CHO细胞系。随后，将培养的细胞用包含10％FBS的DMEM-F12培养基(Gibco，目录编号11330)洗涤三次，添加培养基，并且再培养48小时。将培养的细胞单独地分离——通过向其添加胰蛋白酶，并接种于包含10％FBS和1mg/mLG418(Cellgro，目录编号61-234-RG)但不含次黄嘌呤-胸苷(HT)附加剂的MEM-α培养基(Welgene，目录编号LM008-02)。在只有转化细胞存活形成菌落前持续培养，同时每2到3天更换选择性培养基，以从分离的细胞中选择转化细胞。具体地，为了提高选择的转化细胞中的FVII-ATKAVC衍生物的表达水平，通过向选择性培养基中添加10nMMTX(Sigma，目录编号M8407)来逐渐增加浓度，并且在2到3周后使MTX含量增加到30nM。此外，为了减少转化细胞的异种性，通过有限稀释法获得单克隆。具体地，将以0.7细胞/孔比例稀释的转化细胞分别等分至96孔板，并且培养2到3周，以确认单克隆出现。在检测到单克隆后，将其转移至24孔板，并通过ELISA试验分析每个克隆的细胞生长速率和FVII衍生物表达水平，以选择具有最高FVII衍生物表达水平的克隆。该克隆被命名为“HMF709”，并且相应细胞系于2011年9月23日被保藏于布达佩斯条约规定的国际保藏机构——韩国的韩国生命工学研究院的KCTC韩国生物资源中心(位于111Gwahak-ro，Yuseong-gu，Daejeon)，登录号为KCTC12022BP。3-2.通过ELISA试验确认hFVII-SOD1(ATKAVC)表达将实施例3-1中转染的细胞的部分以2×104个细胞/孔的浓度转移至24孔板，并且培养至足以覆盖培养容器的几乎整个底部。然后，以每孔200μL的量布置包含0.3mM丁酸钠(Sigma，目录编号B5887)的无血清培养基CHO-A-SFM(Gibco，目录编号05-5072EF)，并且在33℃的5％CO2培养箱中培养48小时。将细胞的培养基转移至1.5mL-管并离心。随后，合并上清液，并测量hFVII-SOD1(ATKAVC)的表达水平。根据制造商的方案，使用ELISA试剂盒(MolecularInnovation，目录编号HFVIIKT-TOT)进行表达水平的测量。具体地，首先，将培养肉汤和试剂盒中包含的标准物用Tris缓冲液(0.1MTris，0.15MNaCl，pH7.4)以预定比例稀释，以100μL/孔的量添加至试剂盒的孔中，并且于室温在300rpm下在板式振荡器中反应30分钟。然后，将孔用制造商的洗涤液洗涤四次，并向孔添加100μL/孔的量的抗-hFVII抗体，于室温在300rpm下在板式振荡器中经过30分钟。将孔用制造商的洗涤液再洗涤四次，并且将辣根过氧化物酶(HRP)缀合型抗-hFVII抗体的抗体以100μL的量添加至每个孔，使孔在300rpm下以上述相同方式反应30分钟。在反应后，将孔洗涤四次，并在向每个孔添加100μL底物时使其于室温下反应。约五分钟后，添加50μL终止液以终止反应，并且测量450nm的吸光度。由标准溶液的浓度和试剂盒制造商提供的吸光度值获得标准曲线和函数。然后，利用标准曲线和函数定量hFVII-SOD1(ATKAVC)的表达水平。结果是，确认选择和转化的细胞表达了一定量的hFVII-SOD1(ATKAVC)。3-3.选择hFVII-SOD1(ATKAVC)表达细胞系在实施例3-2中利用有限稀释法验证了hFVII衍生物表达的混合群中进行单克隆选择。也就是说，利用显示异种hFVII衍生物表达水平的克隆，按照有限稀释法，来进行分离具有hFVII衍生物同种表达和高生产率的单克隆的实验。具体地，将6孔板细胞中显示最高表达水平的孔中的细胞稀释，以每孔1个或更少细胞的密度接种。然后，选择只接种了单个细胞的板，并培养2到3周。随后，将形成菌落的细胞从孔板分离并传代培养，并且通过ELISA试验测量hFVII衍生物的表达水平(图2)。在通过有限稀释法分离的细胞系中，最终选择显示hFVII衍生物高生产率的重组CHO细胞系，并命名为“HMF709”。选择的细胞系“HMF709”于2011年9月23日被保藏于韩国生命工学研究院的KCTC韩国生物资源中心(位于111Gwahak-ro，Yuseong-gu，Daejeon，韩国)，登录号为KCTC12022BP。将选择的细胞系用于使用无血清培养基(EX-CELLCHO培养基，Sigma，目录编号14360C，美国)的悬浮培养(图3)。实施例4：测量根据丁酸钠添加的细胞系生长和hFVII-SOD1(ATKAVC)生产水平4-1.种子和主要培养取一瓶(1×107个细胞/mL)hFVII表达细胞系(在实施例3-3中被选择，经历了悬浮培养，并储存在液氮罐中)，并在37℃恒温水浴中尽快解冻。然后，将细胞系用种子培养基(添加有0.3g/L谷氨酰胺的EX-CELLCHO培养基(Sigma，目录编号63225C))洗涤一次，在90×g下离心5分钟，然后接种于包含50mL种子培养基的Erlenmeyer烧瓶中(Corning，目录编号431144，美国)。在CO2培养箱(37℃，5％CO2)中培养1到2天达到10×105个细胞/mL的细胞浓度后，将细胞以上述相同方式再次离心，并在包含100mL新制种子培养基的新Erlenmeyer烧瓶中传代培养。传代培养以相同方式进行，同时以双倍传代培养连续增加培养体积，直到获得足够数目的细胞。4-2.测量根据生产培养基中丁酸钠添加的细胞系生长和hFVII-SOD1(ATKAVC)生产水平为了考察生产培养基中丁酸钠的添加对hFVIIs-SOD1(ATKAVC)生产水平的影响，将约5.0×106个细胞/mL的培养的重组CHO细胞系以50mL培养体积接种于三个Erlenmeyer烧瓶。具体地，将1.0mM、1.2mM、1.5mM和2.0mM丁酸钠(SIGMA，目录编号B5887，美国)分别加入培养基，并且开始培养，以包含1.0mM丁酸钠的烧瓶作为对照。关于hFVII-SOD1(ATKAVC)的生产，将细胞系在32.0℃或33.0℃下培养3天。在培养的第3天，收集培养肉汤，并且考察该细胞系的细胞浓度和细胞活性水平。结果是，确认在添加丁酸钠时细胞浓度和细胞活性水平无变化。另一方面，在培养的第3天，如实施例3-2中公开，通过离心收集上清液，并通过ELISA试验测量各上清液中表达的hFVII-SOD1(ATKAVC)。测量值表示为相对于对照的生产水平百分比(图4)。如图4中所示，具体地，确认在33.0℃下添加1.5mM丁酸钠时生产水平最高。实施例5：测量根据维生素K浓度的hFVII-SOD1(ATKAVC)生产水平5-1.种子和主要培养取一瓶(1×107个细胞/mL)hFVII-SOD1(ATKAVC)表达细胞系(在实施例3-3中被选择，经历了悬浮培养，并储存在液氮罐中)，并在37℃恒温水浴中尽快解冻。然后，将细胞系用种子培养基(添加有0.3g/L谷氨酰胺的EX-CELLCHO培养基(Sigma，目录编号63225C))洗涤一次，在90×g下离心5分钟，然后接种于包含50mL种子培养基的Erlenmeyer烧瓶(Corning，目录编号431144，美国)。在CO2培养箱(37℃，5％CO2)中生长1到2天达到10×105细胞/mL的细胞浓度时，将细胞以上述相同方式再次离心，并在包含100mL新制种子培养基的新Erlenmeyer烧瓶中传代培养。传代培养以相同方式进行，同时以双倍传代培养连续增加培养体积，直到获得足够数目的细胞。5-2.测量根据生产培养基中维生素K添加的细胞系生长和hFVII-SOD1(ATKAVC)生产水平为了考察生产培养基中维生素K的添加对hFVII-SOD1(ATKAVC)生产水平的影响，将约5.0×106个细胞/mL的培养的重组CHO细胞系以50mL培养体积接种于三个Erlenmeyer烧瓶。具体地，将0μg/L、10μg/L、25μg/L、50μg/L、250μg/L和1000μg/L维生素K(MerckMillipore，目录编号501890，美国)加入培养基，并且开始培养，以包含60μg/L维生素K3(SIGMA，目录编号M2518，美国)的烧瓶作为对照。关于hFVII-SOD1(ATKAVC)生产，将细胞系在33.0℃的温度下培养3天。在培养的第3天，收集培养液，并观察细胞系的细胞浓度和细胞活性水平。结果是，确认细胞浓度和细胞活性水平不根据维生素K而变化。另一方面，在培养的第3天，如实施例3-2中公开，通过离心收集上清液，然后，通过ELISA试验测量各上清液中表达的hFVII-SOD1(ATKAVC)。测量值表示为相对于对照的生产水平(倍数)(图5)。如图5所示，观察到hFVII-SOD1(ATKAVC)生产水平随着维生素K添加浓度增加而增加。实施例6：测量根据培养基添加剂使用的细胞系生长及hFVII-SOD1(ATKAVC)生产水平和活性6-1.种子和主要培养取一瓶(1×107个细胞/mL)hFVII-SOD1(ATKAVC)表达细胞系(在实施例3-3中被选择，经历了悬浮培养，并储存在液氮罐中)，并在37℃恒温水浴中尽快解冻。然后，将细胞系用种子培养基(补充有0.3g/L谷氨酰胺的EX-CELLCHO培养基(Sigma，目录编号63225C))洗涤一次，在90×g下离心5分钟，然后接种于包含50mL种子培养基的Erlenmeyer烧瓶(Corning，目录编号431144，美国)。在CO2培养箱(37℃，5％CO2)中生长1到2天达到10×105个细胞/mL的细胞浓度时，将细胞系以上述相同方式再次离心，并在包含100mL新制种子培养基的新Erlenmeyer烧瓶中传代培养。传代培养以相同方式进行，同时以双倍传代培养连续增加培养体积，直到获得足够数目的细胞。6-2：测量在生产培养基中使用添加剂导致的细胞系生长和hFVII-SOD1(ATKAVC)生产水平为了考察生产培养基中的附加剂使用对hFVII-SOD1(ATKAVC)生产水平的影响，将约4.0×106个细胞/mL的培养的重组CHO细胞系以4L培养体积接种于5L生物反应器。当达到15×106个细胞/mL的预期细胞浓度时，将1.0mM丁酸钠(SIGMA，目录编号B5887，美国)、1g/L钠水解物(SIGMA，目录编号58903C，美国)或1g/L酵母提取物(SIGMA，目录编号Y4375，美国)加入培养基，并且开始培养，以仅包含1.0mM丁酸钠的生物反应器作为对照。关于hFVII-SOD1(ATKAVC)生产，将细胞系在33.0℃下培养至少10天。每天收集上清液，并且观察细胞系的细胞浓度和细胞活性水平。另一方面，如实施例3-2中公开，通过离心收集上清液，然后通过ELISA试验测量各上清液中表达的hFVII-SOD1(ATKAVC)。计算并示出生物反应器的培养物概况和测量值(图6、7和8)。【表3】基于添加剂使用的hFVII-SOD1(ATKAVC)生产水平(％)如以上表3中所示，可以发现，观察到在添加1g/L大豆水解物和1g/L酵母提取物时，hFVII-SOD1(ATKAVC)生产水平增加。具体地，确认在添加大豆水解物时生产水平增加最高。6-3：基于生产培养基中添加剂使用的hFVII-SOD1(ATKAVC)效价分析为了考察生产培养基中的附加添加剂使用对hFVII-SOD1(ATKAVC)效价的影响，将约4.0×106个细胞/mL的培养的重组CHO细胞系以4L培养体积接种于5L生物反应器。当达到15×106个细胞/mL的预期细胞浓度时，将1.0mM丁酸钠(SIGMA，目录编号B5887，美国)、1g/L钠水解物(SIGMA，目录编号58903C，美国)或1g/L酵母提取物(SIGMA，目录编号Y4375，美国)加入培养基，并且开始培养，以只包含1.0mM丁酸钠的生物反应器作为对照。关于hFVII-SOD1(ATKAVC)生产，将细胞系在33.0℃下培养至少10天。每天收集上清液，并且观察细胞系的细胞浓度和细胞活性水平。另一方面，每天通过离心培养液收集上清液，然后利用COASET显色试验试剂盒(Chromogenix，意大利)测量有效浓度50(EC50)。将经过最后纯化过程的hFVII-SOD1(ATKAVC)用试剂盒中包含的工作缓冲液通过2倍连续稀释从60ng/mL稀释到0.03ng/mL，并分别以50μL的量等分至96孔板的每个孔中。然后，将包含FacX、CaCl2和凝血致活酶的组合试剂以50μL的量等分至每个孔中，并且在37℃下反应7分钟。随后，将底物以50μL的量等分至每个孔中。最后，测量405nm的吸光度，并比较和分析各FacVII-SOD1(ATKAVC)的EC50(表4)。【表4】基于添加剂使用的hFVII-SOD1(ATKAVC)效价分析的结果如表4中所示，确认当添加1g/L大豆水解物时hFVII-SOD1(ATKAVC)活性减少，并且当添加1g/L酵母提取物时hFVII-SOD1(ATKAVC)活性100％保持，并且生产水平被促进。也就是说，确认酵母提取物的添加不仅增加目标蛋白hFVII-SOD1(ATKAVC)的生产水平，而且100％保持其活性。因此，进行实验测量根据酵母提取物添加量的细胞系生长和hFVII-SOD1(ATKAVC)生产水平，酵母提取物被证实是生产hFVII-SOD1(ATKAVC)的培养基的优良添加剂。6-4：测量根据生产培养基中酵母提取物浓度的细胞系生长和hFVII-SOD1(ATKAVC)生产水平为了考察生产培养基中酵母提取物浓度对hFVII-SOD1(ATKAVC)生产水平的影响，将约10×105个细胞/mL的培养的重组CHO细胞系以50mL培养体积接种于250mL烧瓶。当达到15×106个细胞/mL的预期细胞浓度时，将1.0mM丁酸钠(SIGMA，目录编号B5887，美国)以及1g/L、3g/L和5g/L酵母提取物(SIGMA，目录编号Y4375，美国)加入培养基，并开始培养，以只包含1.0mM丁酸钠的生物反应器作为对照。关于hFVII-SOD1(ATKAVC)生产，将细胞系在33.0℃下培养至少3天。每天收集上清液，并且观察细胞系的细胞浓度(图9)。另一方面，如实施例3-2中公开，每天通过离心收集上清液，然后通过ELISA试验测量各上清液中表达的hFVII-SOD1(ATKAVC)。计算并示出生物反应器的培养物概况和测量值(图10)。实施例7：纯化培养基中因子VII衍生物的方法将超滤膜(SARTOCONSliceCassette，PESU，Sartorius，MWCO30K)用1L的1NNaOH洗涤至少1小时，并且用5L无菌水洗涤。然后，将超滤膜用初级纯化柱平衡缓冲液平衡，并且将FVII衍生物生产培养肉汤注入到膜中并浓缩10倍。将浓缩的培养肉汤用相同体积的初级纯化柱平衡缓冲液稀释两倍，然后再次浓缩至其原始浓缩体积。此稀释-浓缩程序重复至少七次，从而用初级纯化柱平衡缓冲液渗滤培养肉汤。在此，FVII衍生物几乎没有损失，并且浓缩FVII衍生物的最终浓度保持在0.3mg/mL的量。超滤和渗滤在4℃下进行。最后将渗滤的FVII衍生物培养液通过0.22μm过滤器(NALGENE，PES)过滤，并且负载至阴离子交换色谱。在本发明中，用Q琼脂糖树脂(HighPerformance，GEHealthcare)填充的柱被用于阴离子交换色谱。负载缓冲液来洗脱蛋白质——使用平衡缓冲液A(20mMTrispH8.0+2mM苄脒)、洗涤缓冲液B(20mMTrispH8.0+2mM苄脒+0.2MNaCl)、洗涤缓冲液C(20mMTrispH8.0+2mM苄脒+0.1MNaCl)和洗脱缓冲液D(20mMTrispH8.0+2mM苄脒+25mMNaCl+35mMCaCl2)，通过从洗涤缓冲液C到洗脱缓冲液D的范围的线性浓度梯度，经2.5个柱。洗脱后立即将通过阴离子交换色谱洗脱的包含FVII衍生物的蛋白质洗脱物利用20mMTrispH8.0+2mM苄脒缓冲液通过尺寸排阻色谱进行缓冲液交换。过滤、阴离子交换色谱和尺寸排阻色谱在4℃下进行。将通过尺寸排阻色谱进行了缓冲液交换的样品负载于阴离子交换色谱柱。在本发明中，使用Q琼脂糖树脂(HighPerformance，GEHealthcare)填充的柱。负载缓冲液来洗脱蛋白质——使用平衡缓冲液A(20mMTrispH8.0+2mM苄脒)和洗脱缓冲液B(20mMTrispH8.0+2mM苄脒+1MNaCl)，通过具有20％到35％的洗脱缓冲液B浓度范围的线性浓度梯度，经15个柱体积。将洗脱的FVII衍生物蛋白与20mM磷酸钾缓冲液(pH5.5)通过尺寸排阻色谱进行配制，并且所有程序在4℃下进行。如上所述，FVII衍生物可在纯化为无活性形式后被储存。如需，可将FVII衍生物转化为活性FVIIa衍生物，如实施例8中所述。实施例8：纯化的FVII衍生物的活化为了活化FVII衍生物蛋白，将纯化后的FVII衍生物样品负载于预先用平衡缓冲液A(20mMTrispH8.0+2mM苄脒)平衡了的阴离子交换色谱柱。关于阴离子交换色谱，使用Source15Q树脂(GEHealthcare)填充的柱。使负载的缓冲液进行40分钟柱上活化过程——使用5％浓度的平衡缓冲液A和洗脱缓冲液B(20mMTrispH8.0+2mM苄脒+25mMNaCl+35mMCaCl2)，然后使用洗脱缓冲液B进行同溶剂洗脱法，以洗脱蛋白质。纯化的FVII衍生物的活化在室温下进行。根据前文，本发明所属领域技术人员将能够理解，在不改变本发明的技术思路或本发明的基本特征的情况下，本发明可以其它具体形式实施。对此，本文公开的示例性实施方式只以示例为目的，而不应解释为限制本发明的范围。相反，本发明意图不仅包括示例性实施方式，而且包括通过所附权利要求限定的本发明的精神和范围内可包括的各种替代形式、改动、等同形式和其它实施方式。PCT/RO/134表