聚合酶组合物、制得和使用其的方法与流程

文档序号:14722045发布日期:2018-06-17 18:12阅读:来源:国知局
技术特征:

1.一种组合物,其包含分离的多肽,所述多肽与含有选自由以下组成的群组的氨基酸序列的家族ADNA聚合酶具有至少90%一致性:SEQIDNO:2、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36以及SEQIDNO:37。

2.根据权利要求1所述的组合物,其中所述分离的多肽保留聚合酶活性。

3.根据权利要求2所述的组合物,其中所述聚合酶活性测量为原始阅读准确度、系统误差、链偏差、平均阅读长度或总测序通量。

4.根据权利要求1所述的组合物,其中所述分离的多肽包含与SEQIDNO:25的至少90%的一致性并且包括在对应于选自由以下组成的群组的位置的一个或多个位置处的氨基酸取代:N780、E788、A558、D559、H823、H568、D718、D775、H576、E515以及N529,其中编号相对于SEQIDNO:25。

5.根据权利要求1所述的组合物,其中所述分离的多肽包含与SEQIDNO:2的至少90%的一致性并且包括在对应于选自由以下组成的群组的位置的一个或多个位置处的氨基酸取代:N487、N485、E493、A263、D264、H528、H273、D423、D480、H281、E220以及N234,其中编号相对于SEQIDNO:2。

6.根据权利要求1所述的组合物,其中所述分离的多肽包含与SEQIDNO:28的至少90%的一致性并且包括在对应于选自由以下组成的群组的位置的一个或多个位置处的氨基酸取代:N780、E788、A558、D559、H823、H568、D775以及D718,其中编号相对于SEQIDNO:28。

7.根据权利要求1所述的组合物,其中,所述分离的多肽包含与SEQIDNO:37的至少90%的一致性并且包括在对应于选自由以下组成的群组的位置的一个或多个位置处的氨基酸取代:N485、E493、A263、D264、H528、H273、D423以及D480,其中编号相对于SEQIDNO:37。

8.一种组合物,其包含重组聚合酶,所述重组聚合酶含有与SEQIDNO:25或其生物活性片段至少80%一致的氨基酸序列,其中所述重组聚合酶包括在对应于选自由以下组成的群组的位置的位置处的一个或多个氨基酸取代:N780、E788、A558、D559、H823、H568、D718、D775以及H576,其中编号相对于SEQIDNO:25。

9.根据权利要求8所述的组合物,其中所述重组聚合酶包括在对应于选自由以下组成的群组的位置的位置处的一个或多个氨基酸取代:N780K、E788R、A558K、D559A、D559R、H823S、H823F、H568N、D718K、D775R以及H576M,其中编号相对于SEQIDNO:25。

10.根据权利要求8所述的组合物,其中所述重组聚合酶或其生物活性片段保留聚合酶活性。

11.根据权利要求8所述的组合物,其中相比于不具有在对应于选自由以下组成的群组的位置的位置处的一个或多个氨基酸取代的参考聚合酶:N780、E788、A558、D559、H823、H568、D718、D775以及H576,其中编号相对于SEQIDNO:25,所述重组聚合酶展现提高的原始阅读准确度、减少的系统误差、减少的链偏差、增加的平均阅读长度或增加的总测序通量。

12.一种组合物,其包含重组聚合酶,所述重组聚合酶含有与SEQIDNO:2或其生物活性片段至少80%一致的氨基酸序列,其中所述重组聚合酶包括在对应于选自由以下组成的群组的位置的位置处的一个或多个氨基酸取代:N487、N485、E493、A263、D264、H528、H273、D423、D480以及H281,其中编号相对于SEQIDNO:2。

13.根据权利要求12所述的组合物,其中所述重组聚合酶包括在对应于选自由以下组成的群组的位置的位置处的一个或多个氨基酸取代:N487R、N485K、E493R、A263K、D264A、D264R、H528S、H528F、H273N、D423K、D480R以及H281M,其中编号相对于SEQIDNO:2。

14.一种用于进行聚合的方法,其包含:

(a)提供包括与引物杂交并且结合到经修饰的聚合酶的核酸的反应混合物;以及

(b)使所述核酸与至少一种类型的核苷酸接触,其中所述接触包括将至少一种核苷酸掺入到所述引物上,从而产生延伸的引物产物。

15.根据权利要求14所述的方法,其中所述经修饰的聚合酶包含分离的多肽,所述多肽与含有选自由以下组成的群组的氨基酸序列的家族ADNA聚合酶具有至少90%一致性:SEQIDNO:2、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36以及SEQIDNO:37。

16.根据权利要求14所述的方法,其中所述经修饰的聚合酶包含具有对应于在对应于选自由以下组成的群组的位置的位置处的一个或多个氨基酸取代的氨基酸序列的重\t组聚合酶:N487、N485、E493、A263、D264、H528、H273、D423、D480以及H281,其中编号相对于SEQIDNO:2。

17.根据权利要求14所述的方法,其中所述方法进一步包括检测所述反应混合物中所述延伸的引物产物的存在,从而判定是否已发生核苷酸掺入。

18.根据权利要求17所述的方法,其中所述接触和所述检测重复超过一次,从而检测多种核苷酸掺入。

19.根据权利要求18所述的方法,其中所述方法进一步包括鉴别多种核苷酸掺入中的至少一种。

20.根据权利要求14所述的方法,其中所述聚合方法包括PCR、qPCR、桥式PCR、RT-PCR、连接介导的PCR、等温扩增或乳液PCR。

21.一种用于从核酸模板获得序列信息的方法,其包含:

(a)提供包括与测序引物杂交并且结合到经修饰的聚合酶的模板核酸的反应混合物;

(b)使所述模板核酸与至少一种类型的核苷酸接触,其中所述接触包括使来自所述至少一种类型的核苷酸的一种或多种核苷酸掺入到所述测序引物的3'端上,并且产生延伸的引物产物;

(c)检测所述反应混合物中所述延伸的引物产物的存在,从而判定是否已发生核苷酸掺入;以及

(d)从所述至少一种类型的核苷酸鉴别所掺入的一种或多种核苷酸中的至少一种。

22.根据权利要求21所述的方法,其中所述经修饰的聚合酶包含分离的多肽,所述多肽与含有选自由以下组成的群组的氨基酸序列的家族ADNA聚合酶具有至少90%一致性:SEQIDNO:2、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36以及SEQIDNO:37。

23.根据权利要求21所述的方法,其中所述接触、检测以及鉴别步骤重复超过一次,从而鉴别多种连续核苷酸掺入。

24.一种组合物,其包含分离的多肽,所述多肽含有与SEQIDNO:37或其生物活性片段具有至少80%同源性的氨基酸序列,其中所述分离的多肽包括在对应于选自由以下组成的群组的位置的位置处的一个或多个氨基酸取代:D423、D264、H273以及E493,其中编号相对于SEQIDNO:37,并且其中所述分离的多肽相对于SEQIDNO:2\t展现降低的解离速率常数。

25.一种组合物,其包含重组聚合酶,所述重组聚合酶含有与SEQIDNO:2或其生物活性片段具有至少80%同源性的氨基酸序列,其中所述重组聚合酶包含具有在对应于选自由以下组成的群组的位置的位置处的一个或多个氨基酸取代的家族ADNA聚合酶:N487、N485、E493、A263、D264、H528、H273、D423、D480以及H281,其中编号相对于SEQIDNO:2,并且其中重组聚合酶相比于SEQIDNO:2展现降低的解离速率常数。

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