源于细菌表面受体蛋白的免疫原性组合物和疫苗的制作方法与工艺

相关申请本专利合作条约申请根据35USC§119(e)要求2013年12月2日提交的美国临时专利申请号61/910,817和2014年6月3日提交的美国临时专利申请号62/007,068的权益，所述美国临时专利申请均以引用的方式全文并入本文。公开领域本公开涉及免疫原性组合物和疫苗以及其产生和评估方法。更具体说来，本公开涉及源于细菌表面受体蛋白的免疫原性组合物和针对革兰氏阴性细菌生物体的疫苗，所述细菌生物体包括但不限于属于细菌巴斯德菌科、奈瑟氏球菌科以及莫拉氏菌科的细菌生物体。公开背景以下段落意图向读者介绍以下更详细描述并且不意图定义或限制本公开所要求的主题。能够介导有效免疫反应的疫苗在旨在对抗由微生物病原体引起的疾病的健康策略中至关重要。用于在宿主中诱导有效免疫反应的两种基础策略涉及向受试者(宿主)施用能够在所述宿主中复制的‘活’试剂，或施用不能在所述宿主中复制的材料或物质。如果所述试剂或污染生物体复制并且不利地影响免疫的受试者，那么活疫苗的施用可代表针对免疫受损个体的安全性风险。这些风险与基于灭活全病原体、基于来自病原体的提取物或基于纯化的组分的疫苗无关，所述疫苗称作亚单位疫苗。亚单位疫苗避免了与活疫苗有关的安全性问题，但纯化的组分可能本身不在受试者中递送对抗传染性微生物体的所需保护效应并且需要适当组分(称为佐剂)来增强免疫反应。关于对抗革兰氏阴性细菌生物体的疫苗的设计的方法通常集中在天然与所述细菌的外部膜缔合并且暴露于细菌细胞的表面上的蛋白的使用。关于疫苗接种的尤其有吸引力的靶标为据推测对于宿主中的存活至关重要的蛋白，因为其不能丧失或急剧改变以便避免宿主免疫反应。在这方面，能够与宿主铁结合蛋白(转铁蛋白和乳铁传递蛋白)相互作用并且结合的细菌表面受体蛋白已经在一段时间内被视为用于疫苗的制备的合适组分(1-3)。这组表面受体蛋白(下文中称作“HIBP”(宿主铁结合蛋白)表面受体蛋白)存在于人类和动物中属于细菌巴斯德菌科、莫拉氏菌科以及奈瑟氏球菌科的病原体中(4)。因此，这些蛋白已经被承认为用于对抗人类和食品生产动物的多种不同病原体的疫苗的开发的潜在靶标(5)(6-10)。所述HIBP表面受体通常包含两种蛋白：表面脂蛋白，即转铁蛋白结合B(TbpB)或乳铁传递蛋白结合蛋白B(LbpB)，和TonB依赖性完整膜蛋白，即转铁蛋白结合蛋白A(TbpA)或乳铁传递蛋白结合蛋白A(LbpA)(11)。近来，来自胸膜肺炎放线杆菌、猪放线杆菌以及脑膜炎奈瑟氏球菌的TbpB的详细三维结构在高分辨率下确定(12-14)。TbpB或LbpB蛋白的固有特性与完整外膜蛋白TbpA和LbpA极其不同并且大致上影响用于疫苗开发的策略。例如，有可能由用于产生亚单位疫苗的大肠杆菌细胞质以相对高产率产生并且纯化TbpB或LbpB。然而，这些蛋白尤其在通过选择性清洁剂萃取制备的外膜囊泡(OMV)疫苗中由于在萃取过程期间的其去除而不存在或缺乏。相比之下，功能性TbpA或LbpA仅可在外膜中产生，提供对于产生欲用于亚单位疫苗中的纯化蛋白的高产率的限制。产生聚集成大的包涵体并且随后试图由富集的包涵体制剂重折叠蛋白的错误折叠蛋白的替代方法关于商业生成也存在问题。因此，关于基于TbpA或LbpA的疫苗的大多数策略通常将设计OMV的产生或减毒株的开发。已经成功地用于侵袭性细菌病原体的替代方法是使用细胞外荚膜多糖作为原始抗原，并且将其偶联于蛋白载体以诱导T细胞帮助。这些缀合物荚膜疫苗已经证实在由表达特异性荚膜多糖的株提供免于感染的保护方面非常有效，但不提供对于其它荚膜类型的交叉保护。尽管最初开发针对人类病原体流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏球菌以及肺炎链球菌的缀合物荚膜疫苗来预防侵袭性感染，但上市后的携带研究已经证明所述全身性施用的疫苗消除了表达特异性靶向的多糖的病原体的定殖(15-17)。这具有提供群体免疫的附加益处，从而由于群体内降低的携带频率而对非免疫个体提供保护。虽然并非这些早期疫苗的初始意图，但赋予群体免疫的可能已经成为用于评估新的和即将到来的细菌疫苗的重要准则。然而，确定或预测新的疫苗是否将能够影响或预防定殖(携带)为一个重要挑战(18)。评估蛋白抗原是否将最终能够提供针对疾病分离株的多样性集合的广泛保护的能力也是一个值得考虑的挑战(19)。关于测试这种能力的初始工作通常涉及使其它动物物种(小鼠、兔)免疫并且接着分析所得血清的交叉反应和交叉保护特性。关于那些可容易地以可溶性形式产生的表面抗原，如表面脂蛋白，第一步骤通常是产生并且纯化变体蛋白的集合并且将其用于标准ELISA(酶联免疫吸附分析)以评估抗血清识别所述变体蛋白的能力。这是相当劳动密集的，使得变体的广泛集合的分析成为昂贵的工作，并且依赖于以下假定：所述抗原与ELISA板的结合为随机的，使得所有蛋白表面均可探测。考虑到用于评估和预测针对抗原产生的抗血清的交叉保护和交叉反应特性的各种分析中的限制，新的并且改进的基于蛋白的疫苗的选择和设计应结合改进的分析的开发来进行，使得优化和改进所开发的疫苗可以合理基础开始着手。即使从其初始发现以来的数年内进行了大量工作(20,21)，仍不清楚HIBP表面受体蛋白是否并且如何可用于制备针对革兰氏阴性细菌病原体的有效疫苗，和具体说来是否并且如何可开发广泛保护性疫苗。因此，本领域中需要改进基于针对革兰氏阴性细菌生物体的HIBP表面受体蛋白的免疫原性组合物和疫苗。公开概述本公开提供新颖免疫原性组合物并且具体说来基于来自革兰氏阴性病原性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的免疫原性组合物。相应地，本公开在至少一个实施方案中提供一种包含源于来自革兰氏阴性病原性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的抗原的免疫原性组合物，其中所述源于HIBP表面受体蛋白的蛋白已经以使得其不能大致上结合宿主铁结合蛋白的方式被修饰。本公开在至少一个实施方案中提供一种包含多肽的免疫原性组合物，所述多肽包含可获自或获自革兰氏阴性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域，其中所述多肽不能大致上结合宿主铁结合蛋白。在优选实施方案中，本公开提供一种包含HIBP表面受体多肽的C端半段结构域的免疫原性组合物，其中所述多肽不能大致上结合宿主铁结合蛋白。在进一步优选实施方案中，本公开提供一种包含至少两种多肽的混合物的免疫原性组合物，各多肽包含C端半段结构域，其中所述C端半段结构域可获自或获自至少两种革兰氏阴性细菌物种或至少两种革兰氏阴性菌株。在进一步优选实施方案中，所述C端半段结构域获自HIBP表面受体蛋白，所述蛋白为抗原性趋异的。在其它实施方案中，本公开进一步提供一种包含多肽的免疫原性组合物，所述多肽包含可获自或获自革兰氏阴性病原性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的N端半段结构域和/或C端半段结构域，其中所述N端半段结构域或所述C端半段结构域包含由多个环结构域连接的多个β链，并且其中所述N端半段结构域或所述C端半段结构域的多个环结构域中的至少一个环结构域已经被修饰，并且其中所述多肽不能大致上结合宿主铁结合蛋白。在优选实施方案中，所述修饰包含环结构域内的至少一个氨基酸残基的修饰。在其它实施方案中，HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域和/或N端半段结构域内的多个环结构域中的至少两个环结构域已经被修饰。在其它实施方案中，本公开提供(i)第一多肽，所述多肽包含可获自或获自革兰氏阴性病原性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的N端半段结构域或C端半段结构域，其中所述N端半段结构域或所述C端半段结构域包含由多个环结构域连接的多个β链，并且其中所述N端半段结构域或所述C端半段结构域的多个环结构域中的至少一个环结构域已经被修饰，所述第一多肽连接于(ii)第二多肽，所述多肽包含可获自革兰氏阴性细菌物种的HIBP表面受体蛋白或其一部分，并且其中所述连接的多肽不能大致上结合宿主铁结合蛋白。在优选实施方案中，所述HIBP表面蛋白的所述部分为N端半段结构域或C端半段结构域。在进一步优选实施方案中，所述HIBP表面蛋白的所述部分为可获自或获自革兰氏阴性病原性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的N端半段结构域或C端半段结构域，其中所述N端半段结构域或所述C端半段结构域包含由多个环结构域连接的多个β链，并且其中所述N端半段结构域或所述C端半段结构域的多个环结构域中的至少一个环结构域已经被修饰。在其它实施方案中，所述C端半段结构域或所述N端半段结构域为可获自或获自属于细菌巴斯德菌科、莫拉氏菌科或奈瑟氏球菌科的细菌物种的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域，并且在进一步优选实施方案中，所述C端半段结构域或所述N端半段结构域为可获自或获自属于细菌放线杆菌属、奈瑟氏球菌属、嗜血杆菌属、曼氏杆菌属、嗜组织菌属、巴斯德菌属或莫拉氏菌属的细菌物种的HIBP表面受体多肽的C端半段结构域或N端半段结构域。在进一步优选实施方案中，所述HIBP表面受体蛋白以使得所述HIBP表面受体蛋白的N端锚定多肽或其一部分被去除的方式被修饰，并且其中所述多肽不能大致上结合宿主铁结合蛋白。在其它方面，本公开提供用于制备免疫原性组合物的方法。相应地，本公开提供一种用于制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括：(a)提供包含以下各物作为可操作性连接的组分的嵌合核酸序列：(i)编码多肽的核酸序列，所述多肽包含可获自或获自革兰氏阴性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域，其中所述多肽不能大致上结合宿主铁结合蛋白；和(ii)能够控制重组宿主细胞中的表达的核酸序列；(b)将所述嵌合核酸序列引入至宿主细胞中并且使所述宿主细胞生长以产生所述包含所述C端半段结构域或所述N端半段结构域的多肽；(c)从所述宿主细胞回收所述包含C端半段结构域或N端半段结构域的多肽；以及(d)制备免疫原性组合物。在其它实施方案中，所述C端半段结构域或所述N端半段结构域包含由多个环结构域连接的多个β链，其中所述多个环结构域中的至少一个环结构域已经被修饰。在其它方面，提供用于在脊椎动物受试者中引起免疫反应的方法。相应地，本公开进一步提供一种用于在脊椎动物受试者中引起免疫反应的方法，所述方法包括向所述受试者施用：(a)包含多肽的免疫原，所述多肽包含可获自或获自革兰氏阴性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域，其中所述多肽不能大致上结合宿主铁结合蛋白；或(b)包含编码包含多肽的免疫原的聚核苷酸的表达载体，所述多肽包含可获自革兰氏阴性细菌物种的HIBP表面受体多肽的C端半段结构域或N端半段结构域；并且其中所述免疫原以足以在所述脊椎动物受试者中引起免疫反应的量施用或表达。在优选实施方案中，所述C端半段结构域或所述N端半段结构域包含由多个环结构域连接的多个β链，其中所述多个环结构域中的至少一个环结构域已经被修饰。本公开进一步包括一种用作药物的包含HIBP表面受体多肽的C端半段结构域或N端半段结构域的免疫原，其中所述C端半段结构域或所述N端半段结构域包含由多个环结构域连接的多个β链，并且其中至少一个环结构域已经被修饰。本公开进一步包括一种包含HIBP表面受体的C端半段结构域或N端半段结构域的免疫原，所述免疫原用于预防由传染性革兰氏阴性细菌引起的感染(例如通过预防定殖)或疾病，所述细菌包括属于放线杆菌属、奈瑟氏球菌属、嗜血杆菌属、曼氏杆菌属、嗜组织菌属、巴斯德菌属或莫拉氏菌属的细菌。在优选实施方案中，所述C端半段结构域或所述N端半段结构域包含由多个环结构域连接的多个β链，其中所述多个环结构域中的至少一个环结构域已经被修饰。本公开进一步包括一种包含HIBP表面受体多肽的C端半段结构域和/或N端半段结构域的免疫原，所述免疫原用于制造用于预防由传染性革兰氏阴性细菌引起的感染或疾病，所述细菌包括属于放线杆菌属、奈瑟氏球菌属、嗜血杆菌属、曼氏杆菌属、嗜组织菌属、巴斯德菌属或莫拉氏菌属的细菌。在优选实施方案中，所述C端半段结构域或所述N端半段结构域包含由多个环结构域连接的多个β链，其中所述多个环结构域中的至少一个环结构域已经被修饰。本公开的免疫原性组合物可用于制备疫苗。相应地，本公开进一步提供一种包含源于来自革兰氏阴性病原性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的抗原的疫苗组合物，其中所述源于HIBP表面受体蛋白的蛋白已经以使得其不能大致上结合宿主铁结合蛋白的方式被修饰。在其它实施方案中，本公开还进一步包括一种包含多肽的疫苗组合物，所述多肽包含可获自革兰氏阴性病原性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域，其中所述多肽不能大致上结合宿主铁结合蛋白。在其它实施方案中，所述疫苗组合物包含多肽，所述多肽包含HIBP表面受体多肽的C端半段结构域或N端半段结构域，其中所述C端半段结构域或所述N端半段结构域包含由多个环结构域连接的多个β链，并且其中至少一个环结构域已经被修饰并且其中所述多肽不能大致上结合宿主铁结合蛋白。本公开进一步提供用于向脊椎动物受试者施用疫苗的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含多肽的疫苗，所述多肽包含可获自革兰氏阴性病原性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域，其中所述疫苗以足以预防或治疗由革兰氏阴性细菌物种引起的疾病的量施用。本公开进一步包括一种包含HIBP表面受体的C端半段结构域或N端半段结构域的疫苗，所述疫苗用于预防由传染性革兰氏阴性细菌引起的感染或疾病，所述细菌包括属于放线杆菌属、奈瑟氏球菌属、嗜血杆菌属、曼氏杆菌属、嗜组织菌属、巴斯德菌属或莫拉氏菌属的细菌。在优选实施方案中，所述C端半段结构域或所述N端半段结构域包含由多个环结构域连接的多个β链，并且所述多个环结构域中的至少一个环结构域已经被修饰。本公开的其它特征和优点将根据以下详细描述变得显而易知。然而，应了解所述详细描述虽然指示本公开的优选实施方案，但仅以说明的方式给出，因为在本公开的精神和范围内的各种改变和修改根据所述详细描述对于本领域的技术人员将变得显而易知。附图简述本公开在下文提供的段落中关于其图式进行描述。本文提供的图式为了说明目的而提供并且不意图限制本公开。附图简述图1描绘来自猪TbpB病原体的数种TbpB的多肽序列的比对和所述蛋白的结构模型(分别为pdb3HOL、3PQS以及3PQU)，所述多肽序列尤其为ApH49TbpB(SEQ.IDNO:2)、胸膜肺炎放线杆菌ApH87TbpB(SEQ.IDNO:10)以及AsH57TbpB(SEQ.IDNO:28)。这三种蛋白提供来自猪病原体的TbpB中序列多样性的良好表现(图4，大的黑色箭头)。上部图说明多肽序列比对，而下部图说明结构模型。在序列比对中，结构域结构通过背景底纹进行区分并且相应地进行标记。对二级结构单元进行说明并且针对β链(“β1”-“β31”)和环(L1-L32)的命名法和编号在比对的序列的正上方加以说明。这个图中针对环8的子区域(8a；8b；以及8c)由于环8的大的尺寸、TbpB变体与在一些环变体中的二级结构单元之间的差异而被提及。进一步指示分别标记为“C端半段帽区”和“N端半段帽区”的C端半段和N端半段帽区以及分别标记为“C端半段手柄”和“N端半段手柄”区的C端半段手柄和N端半段手柄区。针对上部图中进行比对的三种TbpB的结构模型描绘于底部图中并且所述结构域针对第三种结构模型(AsH57TbpB)加以标记，所述第三种结构模型以与另两种模型一致的定向加以描绘。图2描绘具有关于这类蛋白所推荐的命名法的TbpB多肽的氨基酸序列的某些二级结构特征的示意图。所述多肽的N端和C端分别加以指示并且标记“N”和“C”。β链由箭头指示并且从N端“β1”至“β31”依序标记。环结构域加以指示并且标记“L1”至“L32”。来自胸膜肺炎放线杆菌株的TbpB多肽H49TbpB(SEQ.IDNO:2)的环序列包括在本专利申请中(SEQ.IDNO:41至SEQ.IDNO:106)。进一步指示分别标记为C端半段帽区和N端半段帽区的C端半段和N端半段帽区以及标记为“C端半段手柄”和“N端半段手柄”区的C端半段手柄和N端半段手柄区。图3A描绘在不同宿主物种(小鼠、兔或猪)中使用33％EmulsigenD作为佐剂对针对来自人类病原体脑膜炎奈瑟氏球菌(株B16B6-SEQ.IDNO:117)的完整TbpB蛋白或来自猪病原体胸膜肺炎放线杆菌(株H49-SEQ.IDNO:2)的完整TbpB的抗体反应的量值的比较。在小鼠和兔中针对来自胸膜肺炎放线杆菌的TbpB的抗体效价(灰色条)略高于针对来自脑膜炎奈瑟氏球菌的TbpB(黑色条)，但大致上低于猪中。这些结果意味着宿主转铁蛋白的结合可影响抗体反应的发展。图3B描绘对猪中针对来自牛病原体溶血性曼氏杆菌(株H196–SEQ.IDNO:206)的完整TbpB或来自猪病原体胸膜肺炎放线杆菌(株H49)的完整TbpB(SEQ.IDNO:2)、TbpBN端半段(SEQ.IDNO:8)或TbpBC端半段(SEQ.IDNO:6)的抗体反应的量值的比较。条束表示从在第0天(在第一次免疫之前)、第21天(在第一次免疫之后)、第42天(在第二次免疫之后)以及第56天(在第三次免疫之后)免疫的个别猪取得的血清样品。来自用来自溶血性曼氏杆菌的完整TbpB(Mh完整；株H196–SEQ.IDNO:206)免疫的猪的血清用结合于ELISA板的完整溶血性曼氏杆菌TbpB测试。来自用胸膜肺炎放线杆菌TbpB(Ap完整)、TbpBN端半段(ApN端半段)或TbpBC端半段(ApC端半段)免疫的猪的血清用结合于ELISA板的完整胸膜肺炎放线杆菌TbpB分析。图3C描绘对针对来自猪病原体胸膜肺炎放线杆菌(株H49)的TbpB的C端半段多肽结构域(SEQ.IDNO:6)、TbpB的N端半段多肽结构域(SEQ.IDNO:8)以及完整TbpB(SEQ.IDNO:2)的抗血清的交叉反应性的比较。条束表示针对来自三种不同猪病原体的完整TbpB的血清的反应性；选择胸膜肺炎放线杆菌株H49(SEQ.IDNO:2，黑色条)、副猪嗜血杆菌株HP5(SEQ.IDNO:115，深灰色条)以及胸膜肺炎放线杆菌株H87(SEQ.IDNO:12，浅灰色条)来表示抗原性多样的TbpB(图4)。结果说明用完整TbpB(来自左侧标记“完整”的第一束)、TbpBN端半段(来自左侧标记“N端半段”的第二束)、TbpBC端半段(来自左侧标记“C端半段”的第三束)或N端半段和C端半段的混合物(来自左侧编辑“N+C端半段”的第四束)免疫的血清的反应性。显示平均值的标准误差(SEM)误差条。经由ANOVA进行统计，其中进行TukeyHSD(真实显著性差异)测试作为事后测试。图式中所示的星号表示与针对H49测试的C端半段或N+C端半段显著不同的特异性免疫/蛋白对。图4描绘来自从北美洲、欧洲以及亚洲的猪分离的猪病原体胸膜肺炎放线杆菌株、猪放线杆菌以及副猪嗜血杆菌株的TbpB的序列多样性。最大可能性系统发生树说明了基于来自我们的临床分离株集合或获自公共数据库的序列的56种TbpB之间的关系。所述TbpB序列簇集成3个具有由箭头指示的代表性分离株的主要的组(SEQ.IDNO:2；SEQ.IDNO:12；SEQ.IDNO:28和SEQ.IDNO:107至SEQ.IDNO:115)。表达用于图3中所说明的ELISA分析的TbpB变体的株由大的黑色星号指示；胸膜肺炎放线杆菌株H87(SEQ.IDNO:12)、胸膜肺炎放线杆菌株H49(SEQ.IDNO:2)以及副猪嗜血杆菌株HP5(SEQ.IDNO:115)。大的黑色箭头描绘用于图1中所说明的比对的三种TbpB；胸膜肺炎放线杆菌株H87(SEQ.IDNO:12)、胸膜肺炎放线杆菌株H49(SEQ.IDNO:2)以及猪放线杆菌株H57(SEQ.IDNO:28)。图5描绘来自胸膜肺炎放线杆菌H49的TbpBN端半段(SEQ.IDNO:8)与ELISA板的非随机结合，由当使用纯化的TbpB蛋白来涂布ELISA板而非融合蛋白(即，融合于TbpBN端半段的麦芽糖结合蛋白(Mbp))前体时标记的转铁蛋白的结合的大致降低来说明(图A和图B的左侧部分)。所述图式还说明了N端生物素标记的肽的使用如何克服随机结合(图A和图B的右侧部分)。图A的左侧部分说明了使用标记的转铁蛋白(Tf)来测量结合于规则ELISA板的纯化的Mbp-TbpBN端半段或TbpBN端半段的分析的结果。右侧部分说明了当重组蛋白含有用于连接于抗生蛋白链菌素涂布的ELISA板的生物素标记的N端肽标签时的结果。图B为卡通画，说明了被认为存在于不同ELISA孔中者，相应结果显示于正上方图A中。图6描绘包含来自三种不同猪病原体的TbpBC端半段的多聚体的设计和产生。图A显示了针对来自胸膜肺炎放线杆菌株H49(SEQ.IDNO:6)、猪放线杆菌株H57(SEQ.IDNO:35)以及胸膜肺炎放线杆菌株H87(SEQ.IDNO:22)的C端半段的三聚体(SEQ.IDNO:39；SEQ.IDNO:40)的DNA和蛋白序列(依所述顺序)。下划线指示连接个别C端半段或在第一个C端半段前面的肽序列。图B说明了与来自脑膜炎奈瑟氏球菌株M982的N端半段和C端半段的制剂相比，所述C段半段三聚体的制剂的SDS-PAGE分析。1μl样品应用于泳道1、4和7，5μl应用于泳道2、5和8并且10μl应用于泳道3、6和9。在这些凝胶上观察到的蛋白分子量标准(MWS)为93、70、63、41、30以及22。图7描绘针对来自胸膜肺炎放线杆菌的TbpBC端半段(H49C端半段，SEQ.IDNO:6)的免疫反应，与针对包含来自胸膜肺炎放线杆菌H49、猪放线杆菌H57以及胸膜肺炎放线杆菌H87的TbpBC端半段的C端半段的三聚体(C端半段三聚体，SEQ.IDNO:40)的免疫反应相比。在所述图式的左侧上的条束表示针对H49C端半段的免疫反应，而在所述图式的左侧上的条束表示针对C端半段三聚体的免疫反应。黑色条表示针对来自胸膜肺炎放线杆菌株H49(SEQ.IDNO:2)的TbpB的免疫反应，深灰色条表示针对来自副猪嗜血杆菌株HP5(SEQ.IDNO:115)的TbpB的免疫反应并且浅灰色条表示针对来自胸膜肺炎放线杆菌株H87(SEQ.IDNO:22)的TbpB的免疫反应。图8描绘针对环减少所靶向的胸膜肺炎放线杆菌株H49TbpBN端半段的环区(标记“环1”；“环5”；“环8a”；“环8c”；以及“环12”)(分别SEQ.IDNO:41；SEQ.IDNO:49；SEQ.IDNO:55；以及SEQ.IDNO:63)以及初始和修饰的环的序列。环8a和环8c是指存在于来自株H49的TbpB中的环8部分。图A为从侧面检视的胸膜肺炎放线杆菌TbpBN端半段的结构模型(相对于在细胞表面处的预测主要定向)，其中靶向的区域经过标记。图B为从顶部检视的相同结构模型以说明环1和5与手柄结构域的缔合和与筒结构域缔合的环8a、8c以及12。图C为天然TbpB和具有靶向的环区的减少的TbpB的比对。编码所述环的序列区域以灰色突出显示并且用环编号标记。图9说明来自胸膜肺炎放线杆菌株H49(SEQ.IDNO:10)、猪放线杆菌株H57(SEQ.IDNO:38)以及胸膜肺炎放线杆菌株H87(SEQ.IDNO:26)的TbpBN端半段的工程改造的环减少不会不利地影响其产生或稳定性，但消除猪Tf的结合。上部图说明完整H49TbpB(SEQ.IDNO:2)、天然h49TbpBN端半段(SEQ.IDNO:8)以及来自胸膜肺炎放线杆菌株H49(SEQ.IDNO:10)、猪放线杆菌株H57(SEQ.IDNO:38)或胸膜肺炎放线杆菌株H87(SEQ.IDNO:26)的工程改造的TbpBN端半段的产生。其表达为与具有聚组氨酸标签的N端麦芽糖结合蛋白的融合蛋白并且捕获于Ni-NTA树脂上。结合的蛋白释放于SDS-PAGE缓冲液中并且在10％SDS-PAGE凝胶上进行分析。中间图表示用由偶联于琼脂糖的猪转铁蛋白(pTf-琼脂糖)组成的亲和树脂捕获并且在SDS-PAGE缓冲液中洗脱的相同制剂。底部图说明斑点分析，其中来自上部图的材料从Ni-NTA树脂洗脱并且在硝基纤维素树脂上点上斑点，阻断并且暴露于阻断溶液中的辣根过氧化物酶缀合的猪转铁蛋白(HRP-pTf)，并且结合的HRP在HRP底物中孵育下进行检测。图10描绘来自人类病原体脑膜炎奈瑟氏球菌的TbpB的序列多样性。从与可在BIGSDB公共数据库(http://pubmlst.org/software/database/bigsdb/-BacterialIsolateGenomeSequenceDatabase)中获得的序列的大集合组合的超过100种株的集合测序的tbpB基因的子集表示于这一图中。所述序列的集合表示在将近50年的较长的一段时间内分离株的全球集合，并且因此这是总体TbpB多样性的相当全面的表示。图10A说明完整TbpB的序列多样性。附上关于来自由箭头、双箭头或线指示的株的TbpB的序列(SEQ.IDNO:117；SEQ.IDNO:124；SEQ.IDNO:132至SEQ.IDNO:147；SEQ.IDNO:177；以及SEQ.IDNO:178)以提供关于所鉴定的组的代表性序列。由组1和由组2-4表示的两个主要的进化枝在这个对应于同型I和同型IITbpB谱系的树状图内加以鉴定(22)。描绘针对主要分枝的支持值，并且“*”鉴定具有100％支持的分枝。源于来自株B16B6的TbpB(SEQ.IDNO:117，黑色箭头)的抗原用于产生图11中所分析的抗血清并且使用我们的定制ELISA分析(图5)关于针对来自由灰色箭头说明的株的TbpB(SEQ.IDNO:123；和SEQ.IDNO:132至SEQ.IDNO:139)的反应性进行筛选。图10B描绘源于所述TbpB序列的TbpBC端半段的序列多样性。附上针对来自由箭头或线指示的株的TbpBC端半段的序列(SEQ.IDNO:119；SEQ.IDNO:125；以及SEQ.IDNO:179至SEQ.IDNO:195)以提供代表性序列。由双头箭头指示的两种株包括在内以提供对于C端半段多样性的更全面表示，但无法用于图11中所说明的抗血清的分析。图11描绘针对源于B16B6(脑膜炎奈瑟氏球菌的代表性同型I株)的截短的完整TbpB(SEQ.IDNO:148,aa43-575)和TbpBC端半段(SEQ.IDNO:119aa342-575)的抗血清的反应性。所述抗血清在我们的定制ELISA分析(图5)中针对一组TbpB进行测试，所述TbpB表示脑膜炎奈瑟氏球菌中TbpB的总体序列多样性(箭头，图10)。所述组的TbpB来自脑膜炎奈瑟氏球菌株B16B6(SEQ.IDNO:117)、H44/76(SEQ.IDNO:133)、S3131(SEQ.IDNO:132)、M990(SEQ.IDNO:134)、M978(SEQ.IDNO:135)、M992(SEQ.IDNO:138)、P3006(SEQ.IDNO:139)、120M(SEQ.IDNO:137)、MC58(SEQ.IDNO:136)以及M982(SEQ.IDNO:123)。结果证明C端半段抗血清具有高于针对除了来自B16B6和H44/76的TbpB外的所有TbpB的TbpB抗血清的效价。图12描绘包含来自人类病原体脑膜炎奈瑟氏球菌的两种不同株的TbpBC端半段的二聚体(SEQ.IDNO:118)的设计和产生。图A显示针对来自脑膜炎奈瑟氏球菌株B16B6(SEQ.IDNO:118；和SEQ.IDNO:119)和M982(SEQ.IDNOS:124；和SEQ.IDNO:125)的C端半段的二聚体的DNA和蛋白序列(依所述顺序)。下划线指示连接个别C端半段的肽区的DNA序列。图B说明与来自脑膜炎奈瑟氏球菌株M982和B16B6的个别C端半段的制剂相比，所述C段半段二聚体的制剂的SDS-PAGE分析。图13描绘针对包含来自人类病原体脑膜炎奈瑟氏球菌的两种不同株的TbpBC端半段的二聚体(SEQ.IDNO:150)的免疫反应的分析。成对的条表示获自用单独佐剂(天然)、用B16B6C端半段(SEQ.IDNO:119)、用M982C端半段(SEQ.IDNO:125)或图12中所说明的B16B6和M982C端半段的二聚体(SEQ.IDNO:150)免疫的兔的血清。白色条表示使用固定的完整M982TbpB(SEQ.IDNO:123)的新颖定制ELISA分析的结果并且黑色条表示使用固定的完整B16B6蛋白(SEQ.IDNO:117)的结果。图14描绘脑膜炎奈瑟氏球菌M982的TbpB多肽的C端半段的环结构域的减少。在图A中，显示天然C端半段(SEQ.IDNO:125)和修饰的C端半段(SEQ.IDNO:129)的结构模型以说明四个环的减少(L18、L21、L23以及L27)。在左手侧的模型(SEQ.IDNO:125)中，针对减少所靶向的环用黑色虚线指示。中间模型(SEQ.IDNO:129)说明修饰的环结构域。在右手侧的模型中，使所述两种先前结构重叠以显示如何已经去除大的可变环而不影响总体蛋白结构。图B为多肽序列比对，比较天然C端半段、其中已经修饰单一环的工程改造的C端半段以及其中所有四个环(L18、L21、L23以及L27)均已经被修饰的C端半段(标记“无环”的序列)的序列。涵盖所靶向的环的序列区域以灰色突出显示并且环编号以灰色字体指示。图15描绘图14中所述的脑膜炎奈瑟氏球菌M982的修饰的C端半段的微生物产生。野生型(WT)C端半段(SEQ.IDNO:125)对应于在图14的图A中的左手侧的模型。其它样品表示具有环L18、L21、L23以及L27的截短的蛋白和其中所有四个环均去除(所有环)的蛋白。针对这种蛋白的结构模型(SEQ.IDNO:129)说明于图14中的图A的中间。在这种凝胶上观察到的蛋白分子量标准(MWS)为93、70以及41kDa。图16描绘相对于来自株M982和B16B6的天然C端半段，脑膜炎奈瑟氏球菌株M982的修饰的C端半段的免疫原性。小鼠抗血清的终点效价用我们的定制ELISA分析确定。小鼠用来自株M982的C端半段(SEQ.IDNO:125，第一条)、来自株B16B6的C端半段TbpB(SEQ.IDNO:119，第二条)或‘无环’M982C端半段(SEQ.IDNO:129，最后两条)免疫。血清针对来自株M982(SEQ.IDNO:123)(第一和第三条)或株B16B6(SEQ.IDNO:117)(第二和第四条)的固定的完整TbpB进行测试。结果显示修饰的C端半段更具免疫原性，因为其产生高于亲本C端半段蛋白的针对来自株M982的完整TbpB的效价(比较条3和1)。意外地，修饰的C端半段甚至产生类似于来自所述株的C端半段的对异源B16B6TbpB的反应性程度(比较条4和2)。图17描绘在TbpBC端半段骨架上呈现TbpA区的杂合蛋白的设计。图A为TbpA的结构模型(SEQ.IDNO:152)，突出显示选择用于‘移植’至TbpBC端半段上的区域。TbpA环3螺旋、环10、环11以及插塞环作为空间填充区域加以显示。图B显示天然C端半段(C端半段)(SEQ.IDNO:125)、无环C端半段骨架(无环C)(SEQ.IDNO:129)以及其中呈现所有TbpA区的杂合蛋白(SEQ.IDNO:131)的比对。在所述杂合蛋白中，TbpA环3螺旋置换了TbpBC端半段的环18，TbpA环10置换了TbpBC端半段的环21，TbpA环11置换了TbpBC端半段的环23，并且TbpA插塞环置换了TbpBC端半段的环27。图18描绘了使用图17中所述的策略产生的杂合TbpA-TbpBC端半段的微生物产生。图A说明具有N端麦芽糖结合蛋白(Mbp)融合伴侣的重组融合蛋白的产生并且图B说明在用TEV蛋白酶裂解之后的蛋白。野生型(WT)蛋白为天然M982C端半段(SEQ.IDNO:125)并且负环为其中去除所有四个环的C端半段(SEQ.IDNO:129)，其有效地充当用于呈现TbpA区的骨架。环10是指具有插入至TbpBC端半段环21中的TbpA细胞外环区的蛋白(SEQ.IDNO:154)。环11是指具有插入至TbpBC端半段环23中的TbpA细胞外环区的蛋白(SEQ.IDNO:156)。螺旋3是指插入至TbpBC端半段环27中的TbpA细胞外环3区段(SEQ.IDNO:158)。插塞环是指插入至TbpBC端半段环18中的来自TbpA插塞结构域的区域(SEQ.IDNO:160)。在这些凝胶上观察到的蛋白分子量标准(MWS)为93、70、53、41以及22。图19描绘与具有来自剪接至修饰的环位点中的TbpA的外来环区的修饰的C端半段相比，脑膜炎奈瑟氏球菌株M982的修饰的C端半段的免疫原性。小鼠抗血清的终点效价用我们的定制ELISA分析确定。小鼠用以下各物免疫：(i)其中去除所有四个环的‘无环’C端半段(SEQ.IDNO:129)，(ii)具有插入至TbpBC端半段环21中的TbpA环10的‘无环’C端半段(SEQ.IDNO:154)，(iii)具有插入至TbpBC端半段环23中的TbpA环11的‘无环’C端半段(SEQ.IDNO:156)，(iv)具有插入至TbpBC端半段环27中的TbpA环3螺旋的‘无环’C端半段(SEQ.IDNO:158)，或(v)具有插入至TbpBC端半段环18中的TbpA插塞环的‘无环’C端半段(SEQ.IDNO:160)。血清针对其中‘无环’C端半段已经插入所有四个TbpA环的杂合TbpA-TbpB抗原(SEQ.IDNO:131)进行测试。结果显示所有杂合抗原均具免疫原性，至少与‘无环’C端半段一样具有免疫原性。图20描绘在TbpBC端半段骨架上呈现LbpA区(SEQ.IDNO:162)的杂合蛋白的设计和产生。图A为LbpA的结构模型，突出显示选择用于‘移植’至TbpBC端半段上的区域。LbpA环3螺旋被涂上更深的灰色并且环2被涂上黑色。图B显示天然C端半段(C端半段，SEQ.IDNO:125)、无环C端半段骨架(无环C，SEQ.IDNO:129)以及其中呈现LbpA区的杂合蛋白的比对。在所述杂合蛋白中，LbpA环2置换了TbpBC端半段的环21(SEQ.IDNO:164)，LbpA环3螺旋置换了TbpBC端半段的环18(SEQ.IDNO:166)并且。在这些凝胶上观察到的蛋白分子量标准(MWS)为100、75、63以及48。图21描绘来自人类病原体流感嗜血杆菌的TbpBC端半段中的‘缀合环’的设计。图A显示针对编码杂合基因的基因的DNA和蛋白序列，所述杂合基因具有编码以较大字体显示的缀合环的DNA区(SEQ.IDNO:167)。氨基酸以单字母代码显示，其中赖氨酸由字母K指示，其中与完整C端半段中的24个相比，在缀合环中存在42个(SEQ.IDNO:168)。图B说明流感嗜血杆菌TbpBC端半段的结构模型，指示缀合环的插入位置。如所说明，所述缀合环插入至C端半段的手柄结构域中，置换C端半段的环L23(使用本公开中所用的环命名法)(图2)。应注意，为了说明性目的，所述模型用11个氨基酸的缀合环而非实际蛋白中的91个来产生。图22描绘源于来自胸膜肺炎放线杆菌、猪放线杆菌以及副猪嗜血杆菌的重组截短的TbpB蛋白的定点突变型TbpB蛋白的转铁蛋白结合特性。所述重组截短的TbpB蛋白表达为融合蛋白并且针对结合活性进行测试。重组融合蛋白最初通过固相结合分析和亲和捕获分析针对转铁蛋白结合进行筛选。接着通过等温量热法、表面等离子体共振或生物膜层干涉测量法针对与pTf的结合评估纯化的突变型蛋白(23-25)。数种突变引起亲和常数(Kd)的≥100倍增加，如来自胸膜肺炎放线杆菌株H49的TbpB中的F171A突变、来自胸膜肺炎放线杆菌株H49的TbpB中的Y174A突变或来自猪放线杆菌株HP5的TbpB中的Y167A或W176A突变。有趣的是注意到这些突变体均映射到环8。图23描绘定点突变型蛋白在天然宿主中诱导保护性免疫反应的增强的能力。在这个图中，将来自副猪嗜血杆菌株HP5的定点Y167ATbpB(SEQ.IDNO:174)的能力与野生型TbpB(SEQ.IDNO:115)和包括商业疫苗(PorcillisGlasser)和单独佐剂的对照组相比。所述猪通过用108个集落形成单位(cfu)的Hp5(Nagasaki)株进行气管内接种来激发并且在所述实验的持续时间内监测临床病征和症状。在实验结束之前处死具有严重症状的动物。所述图显示以12h增量从24至108h的存活曲线，并且接着连接至14天时的最终时间点。图24描绘由天然和突变型TbpB抗原诱导的细胞免疫反应。图A和图B分别说明在激发之日(在两次IM免疫之后)和激发之后4天(96h)的B细胞反应。图C和图D说明在激发之日和激发之后4天的T辅助细胞反应。菱形、三角形和正方形分别表示用天然TbpB、Y167A突变型TbpB和Porcilis(PG)疫苗免疫的猪。在激发之后第4天关于天然TbpB和PG疫苗处理的猪的样品的数目减少。所述分析通过使用外周血单核细胞的FACS分析来执行。各组之间的显著差异：*p<0.05，***p<0.001。图25描绘用来自脑膜炎奈瑟氏球菌的重组截短的TbpB、重组截短的TbpBN端半段或重组TbpBC端半段免疫会在人源化转基因小鼠模型中提供免于定殖的保护。在图A中所说明的实验中，表达人类CEACAM1受体的转基因C57黑色小鼠在第1天和第21天用来自脑膜炎奈瑟氏球菌株M982的重组截短的TbpB或用单独佐剂免疫。小鼠在第35天用大约1×107CFU的脑膜炎奈瑟氏球菌株M982进行鼻内接种。正方形和圆形表示在激发之后3天从个别小鼠回收的CFU(第38天)。图B说明追踪实验，其中小鼠在第1天和第21天用重组截短的TbpB、重组截短的TbpBN端半段、重组TbpBC端半段、重组因子H结合蛋白或单独佐剂免疫。如在图A中，在各别小鼠中激发之后3天回收的脑膜炎奈瑟氏球菌株M982的CFU的数目绘于本图中。图26描绘来自人类病原体淋病奈瑟氏球菌的TbpB和TbpBC端半段的序列多样性。图A(图26A)说明完整TbpB的序列多样性并且图A(图26B)表示TbpBC端半段的序列多样性。针对代表性脑膜炎奈瑟氏球菌TbpB和TbpBC端半段的序列(图10，箭头和双箭头)包括于这一分析中以确定针对来自淋病奈瑟氏球菌的TbpB和TbpBC端半段的序列在何种程度上为存在于脑膜炎奈瑟氏球菌中的所述序列的序列多样性的子集。至于图10，由箭头指示的代表性淋病奈瑟氏球菌TbpB序列(SEQIDNO:207至SEQIDNO:212)和TbpBC端半段序列(SEQIDNO:213至SEQIDNO:218)包括于附录中以提供总体序列多样性的表示。如图A中所说明，存在淋病奈瑟氏球菌TbpB的两个簇集，其为脑膜炎球菌同型2TbpB的子分枝。存在一个最密切地与来自脑膜炎球菌株H44/76的TbpB相关的较大簇集和一个最密切地与来自株P3306的TbpB相关的较小簇集。图B中的C端半段树状图披露淋病奈瑟氏球菌TbpBC端半段形成与最密切地与脑膜炎球菌同型2TbpB相关的脑膜炎球菌TbpBC端半段不同的簇集。图27描绘来自人类病原体流感嗜血杆菌的TbpB和TbpBC端半段的序列多样性。图A(图27A)说明完整TbpB的序列多样性并且图B(图26B)表示TbpBC端半段的序列多样性。由箭头指示的代表性流感嗜血杆菌TbpB序列(SEQIDNO:196-204)包括于附录中以提供总体序列多样性的表示。如图A中所说明，存在流感嗜血杆菌TbpB的三个主要簇集(组)，其包括混合的b型和不可分型流感嗜血杆菌株，指示TbpB多样性不与任何其它属性(如荚膜的存在)相关。还存在C端半段多样性的三个主要组。图28描绘在反刍动物病原体溶血性曼氏杆菌、葡萄糖苷酶曼氏杆菌以及海藻糖巴斯德菌(本领域中分别还称为溶血性巴斯德菌和海藻糖巴斯德菌(P.trehalosi))中TbpB的序列多样性。箭头指示包括于SEQ.IDNO:清单中的代表性序列。图29描绘来自卡他莫拉氏菌的TbpB的序列多样性。箭头指示来自包括于SEQ.IDNO:清单中的三个主要簇集的TbpB的代表性序列。图30描绘说明性系统发生树。表1-3表示分别选自HIBP多肽的环结构域L1-L32的1个、2个或3个环结构域的组合，其可根据本公开进行修饰。表示可根据本公开的某些实施方案进行修饰的环结构域或环结构域的组合。表示根据本公开的某些实施方案的环结构域的非允许组合。□表示允许的环结构域的组合，然而呈现在同一表格中的别处，根据本公开的某些实施方案。公开详述以下将描述各种组合物和方法以提供每一个所要求的主题的实施方案的实例。以下所述的实施方案均不限制任何所要求的主题并且任何所要求的主题均可涵盖不同于下文所述的那些的方法、工艺、组合物或系统。所要求的主题不限于具有以下所述的任一组合物、方法、系统或工艺的所有特征的组合物或方法，或多种或全部以下所述的组合物、系统或方法所共有的特征。有可能以下所述的组合物、系统、方法或工艺不为任何所要求的主题的实施方案。以下所述的组合物、系统、方法或工艺中所公开的未在这一文献中要求的任何主题均可为另一保护性文件(例如继续专利申请)的主题，并且本申请人、发明人或所有者不意图在这一文献中通过任何所述主题的公开来放弃、弃权或向公众捐献所述主题。应注意，如本文所用的如“大致上”、“基本上”、“约”以及“大约”的程度术语意味着合理量的所修饰的术语的偏差，使得最终结果未显著改变。这些程度术语应解释为包括所修饰的术语的偏差，只要这一偏差不会否认其修饰的术语的含义。如本文所用，措词“和/或”意图表示包括-或。也就是说，“X和/或Y”意图意味例如X或Y或两者。作为另一实例，“X、Y和/或Z”意图意味X或Y或Z或其任何组合。所有公布、专利和专利申请均以引用的方式全文并入本文中，其并入程度就如同每个个别公布。如上文所提及，本公开提供新颖免疫原性组合物并且具体说来基于来自革兰氏阴性病原性细菌物种(如脑膜炎奈瑟氏球菌)的HIBP表面受体蛋白的免疫原性组合物。本公开的免疫原性组合物为适用的，因为其可用于制备新颖疫苗制剂以保护人类和动物对抗传染性病原性革兰氏阴性细菌物种。根据本公开，本公开的HIBP表面受体蛋白以使得其不能大致上结合宿主铁结合蛋白的方式被修饰。所述修饰的HIBP表面受体蛋白展现意外强烈的免疫原性特性。此外，本公开的免疫原性组合物大致上为稳定多肽并且因此可容易制造。此外并且重要的是，本公开的免疫原性组合物意外有效，例如通过诱导交叉反应性免疫反应，因此允许通过施用单一有效疫苗接种化合物来进行保护以对抗多种病原性微生物体。根据本公开制备的疫苗不含活生物体或粗萃取物，由此表示极其有限的健康风险。相应地，本公开在至少一个实施方案中提供一种包含来自革兰氏阴性病原性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的免疫原性组合物，其中所述HIBP表面受体蛋白已经以使得其不能大致上结合宿主铁结合蛋白的方式被修饰。本公开进一步提供一种包含多肽的免疫原性组合物，所述多肽包含可获自革兰氏阴性病原性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域，其中所述多肽不能大致上结合宿主铁结合蛋白。在某些实施方案中，所述HIBP表面受体蛋白的N端半段结构域或C端半段结构域包含由多个环结构域连接的多个β链，并且所述多个环结构域中的一个或多个环结构域已经被修饰。术语和定义除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本公开所属领域的技术人员通常所理解相同的含义。在允许的情况下，本文(无论上文或下文)所引用的所有专利和专利申请以及其它公布(包括来自GenBank、SwissPro以及其它数据库的核酸和多肽序列)均由此以引用的方式全文并入。应进一步注意，如本说明书中和随附权利要求书中所用，除非上下文另外清楚指示，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括多个提及物。因此，举例来说，对“免疫原”的提及包括两种或更多种所述试剂的混合物，对“多肽”的提及包括对两种或更多种多肽的混合物的提及，对“细胞”的提及包括两种或更多种所述细胞等。如本文中可互换使用的术语“免疫原”和“免疫原性组合物”以其最广泛含义使用来指含有一个或多个表位的分子，所述表位将刺激宿主生物体中的免疫反应以产生细胞免疫原特异性免疫反应和/或体液抗体反应。免疫原包括核酸、蛋白、多肽、肽以及免疫原性蛋白片段。如本文可互换使用的术语“疫苗”和“疫苗组合物”是指任何含有免疫原的药物组合物，所述组合物可用于预防或治疗受试者中的疾病或病况。所述术语因此涵盖亚单位疫苗，即含有免疫原的疫苗组合物，其从实际上与所述免疫原缔合的完整生物体分离并且隔开。术语“脊椎动物受试者”是指脊索动物亚门的任何成员，尤其哺乳动物，包括不限于人类和其它灵长类动物。所述术语不表示特定年龄。因此，意图涵盖新生、婴儿、儿童以及成年个体。本文中可互换使用的术语“HIBP表面受体蛋白”、“HIBP表面受体多肽”、“宿主铁结合蛋白表面受体蛋白”或“宿主铁结合蛋白表面多肽”是指可获自革兰氏阴性细菌物种的任何膜锚定蛋白或多肽，其能够与宿主铁结合蛋白相互作用。所述术语包括任何TbpB和LbpB蛋白。HIBP表面受体蛋白在以其天然三维结构折叠时包含双半段结构，所述结构包含N端半段结构域和C端半段结构域，所述N端半段结构域和所述C端半段结构域各自包含以β筒组装的多个β链，和以与所述β筒相邻的β折叠结构组装的多个β链(称为手柄结构域)，其中所述β链由多个环结构域连接(如图1中进一步说明)。所述术语进一步指任何及所有HIBP表面受体多肽序列，包括所有细菌HIBP表面受体多肽，包括不限于SEQ.IDNO:2；SEQ.IDNO:12；SEQ.IDNO:28；SEQ.IDNO:107至SEQ.IDNO:115；SEQIDNO:117；SEQ.IDNO:123；SEQ.IDNO:131至SEQ.IDNO:147；SEQ.IDNO:177；SEQ.IDNO:178；SEQ.IDNO:196至SEQ.IDNO:204；SEQ.IDNO:206至SEQ.IDNO:212；以及SEQ.IDNO:219至SEQ.IDNO:228中示出的那些，和包含以下氨基酸残基的序列的那些，所述氨基酸残基(i)大致上与构成本文所示出的任何HIBP表面受体蛋白的氨基酸序列同一；(ii)由能够在至少适度严格条件下与任何编码本文所示出的任何HIBP表面受体蛋白的核酸序列杂交或除了使用同义密码子之外能够在至少适度严格条件下与任何编码本文所示出的任何HIBP表面受体蛋白的核酸序列杂交的核酸序列编码。所述术语进一步包括任何HIBP表面受体蛋白前体多肽；或(iii)当提交至结构建模服务器时将使用转铁蛋白结合蛋白、乳铁传递蛋白结合蛋白或其子结构域作为模板，所述服务器如Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)或Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org/)，后者选择自动化模式。所述术语进一步包括成熟TbpB多肽以及任何HIBP表面受体多肽前体，包括任何前HIBP表面受体多肽前体或包含N端或其它信号序列的HIBP表面受体多肽前体。本文中可互换使用的术语“完整外膜蛋白”和“IOM蛋白”是指来自革兰氏阴性细菌物种的任何完整外膜蛋白，包括属于蛋白的TonB依赖性子类的任何蛋白，所述蛋白在以其天然3维结构折叠时包含22链C端β筒结构域和能够填充所述C端β筒结构域中的通道的N端插塞或软木塞结构域。所述术语包括不限于TbpA和LbpA蛋白。所述术语进一步指任何及所有IOM多肽序列，包括以下所有，包括SEQ.IDNO:152和SEQ.IDNO:162中示出的那些和包含以下氨基酸残基的序列的那些，所述氨基酸残基(i)大致上与构成本文所示出的任何IOM蛋白的氨基酸序列同一；(ii)由能够在至少适度严格条件下与任何编码本文所示出的任何IOM蛋白的核酸序列杂交或除了使用同义密码子之外能够在至少适度严格条件下与任何编码本文所示出的任何IOM蛋白的核酸序列杂交的核酸序列编码。所述术语进一步包括任何IOM蛋白前体多肽；或(iii)当提交至结构建模服务器时将使用3V8X或其子结构域作为模板，所述服务器如Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)或Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org/)，后者选择自动化模式。如本文所用的术语“N端半段结构域”是指HIBP表面受体蛋白的N端部分，其包含由多个环结构域连接的多个β链，其中一些β链经配置以形成β筒和相邻β折叠结构(称为手柄结构域)(参看：图1；氨基酸残基46至氨基酸残基342)。术语N端半段结构域进一步包括不限于具有SEQ.IDNO:8；SEQ.IDNO:10；SEQ.IDNO:24；SEQ.IDNO:26；SEQ.IDNO:36；SEQ.IDNO:38；SEQ.IDNO:121；SEQ.IDNO:127；SEQ.IDNO:229；SEQ.IDNO:231；以及SEQ.IDNO:233中示出的序列的所有多肽。如本文所用的术语“C端半段结构域”是指HIBP表面受体蛋白的C端部分，其包含由多个环结构域连接的多个β链，其中一些β链经配置以形成β筒和相邻β折叠结构(称为手柄结构域)。进一步参考图1和图2，C端半段手柄结构域为从β链16起并且直至且包括β链23的连续多肽结构域，其在图2中描绘的ApH49、ApH57以及ApH87TbpB多肽的情况下由氨基酸残基344至431组成，并且在从氨基酸残基314至氨基酸残基401的SEQ.ID.NO:2中(ApH49)，在从氨基酸残基363至氨基酸残基450的SEQ.ID.NO:27中(ApH57)，以及在从氨基酸残基315至氨基酸残基401的SEQ.ID.NO:12中(ApH87)。C端半段β筒结构域为从β链23起直至多肽的C端的连续多肽结构域，其在图2中描绘的ApH49、ApH57以及ApH87TbpB多肽的情况下为从氨基酸残基443起并且直至C端的多肽链，并且在从氨基酸残基413起的SEQ.ID.NO:2中(ApH49)，在从氨基酸残基462起的SEQ.ID.NO:27中(ApH57)，以及在从氨基酸残基413起的SEQ.ID.NO:12中。应注意，C端半段手柄结构域和C端半段β筒结构域可由短环(图1和图2中表示为“L24”)连接。应进一步注意，如本文所用的术语C端半段结构域特定地意图不仅包括C端半段β筒结构域，而且包括形成β折叠结构的手柄结构域，所述手柄结构域典型地包含大约90个或更多个氨基酸残基，并且相对于C端半段β筒结构位于N端。如本文所用的术语C端半段结构域进一步包括不限于所有SEQ.IDNO:5；SEQ.IDNO:6；SEQ.IDNO:22；SEQ.IDNO:33；SEQ.IDNO:34；SEQ.IDNO:119；SEQ.IDNO:125；SEQ.IDNO:179至SEQ.IDNO:195；SEQ.IDNO:213至SEQ.IDNO:218；SEQ.IDNO:230；SEQ.IDNO:232；SEQ.IDNO:234至SEQ.IDNO:278；以及SEQ.IDNO:288至SEQ.IDNO:292中示出的多肽。术语“环结构域”是指HIBP表面受体蛋白中连接两个β链的多肽序列。这些多肽序列的长度可从数个氨基酸残基至150个或更多个氨基酸残基显著变化。如本文中可互换使用的术语“TbpB”、“TbpB蛋白”、“TbpB多肽”是指任何及所有转铁蛋白结合蛋白B序列，包括所有细菌TbpB多肽和包含以下氨基酸残基的序列的多肽，所述氨基酸残基(i)大致上与构成本文所示出的任何TbpB多肽的氨基酸序列同一，所述氨基酸序列包括不限于SEQ.IDNO:2；SEQ.IDNO:12；SEQ.IDNO:28；SEQ.IDNO:107至SEQ.IDNO:115；SEQIDNO:117；SEQ.IDNO:123；SEQ.IDNO:131至SEQ.IDNO:147；SEQ.IDNO:177；SEQ.IDNO:178；SEQ.IDNO:196至SEQ.IDNO:204；SEQ.IDNO:206至SEQ.IDNO:212；以及SEQ.IDNO:219至SEQ.IDNO:228，或(ii)由能够在至少适度严格条件下与任何编码本文所示出的任何TbpB多肽的核酸序列杂交或除了使用同义密码子之外能够在至少适度严格条件下与任何编码本文所示出的任何TbpB多肽的核酸序列杂交的核酸序列编码。所述术语进一步包括成熟TbpB多肽以及任何TbpB前体，包括任何前TbpB或包含N端或其它信号序列的TbpB。如本文中可互换使用的术语“LbpB”、“LbpB蛋白”、“LbpB多肽”是指任何及所有乳铁传递蛋白结合蛋白B序列，包括所有细菌LbpB多肽和包含以下氨基酸残基的序列的多肽，所述氨基酸残基(i)大致上与构成本文所示出的任何LbpB多肽的氨基酸序列同一，所述氨基酸序列包括不限于SEQ.IDNO:285，或(ii)由能够在至少适度严格条件下与任何编码本文所示出的任何LbpB多肽的核酸序列杂交或除了使用同义密码子之外能够在至少适度严格条件下与任何编码本文所示出的任何LbpB多肽的核酸序列杂交的核酸序列编码。所述术语进一步包括任何LbpB前体，包括前LbpB。如本文中可互换使用的术语“TbpA”、“TbpA蛋白”、“TbpA多肽”是指任何及所有转铁蛋白结合蛋白A序列，包括所有细菌TbpA多肽和包含以下氨基酸残基的序列的多肽，所述氨基酸残基(i)大致上与构成本文所示出的任何TbpA多肽的氨基酸序列同一，所述氨基酸序列包括不限于SEQ.IDNO:152，或(ii)由能够在至少适度严格条件下与任何编码本文所示出的任何TbpA多肽的核酸序列杂交或除了使用同义密码子之外能够在至少适度严格条件下与任何编码本文所示出的任何TbpA多肽的核酸序列杂交的核酸序列编码。所述术语进一步包括任何TbpA前体，包括前TbpA。如本文中可互换使用的术语“LbpA”、“LbpA蛋白”、“LbpA多肽”是指任何及所有乳铁传递蛋白结合蛋白A序列，包括所有细菌LbpA多肽和包含以下氨基酸残基的序列的多肽，所述氨基酸残基(i)大致上与构成本文所示出的任何LbpA多肽的氨基酸序列同一，所述氨基酸序列包括不限于SEQ.IDNO:162，或(ii)由能够在至少适度严格条件下与任何编码本文所示出的任何LbpA多肽的核酸序列杂交或除了使用同义密码子之外能够在至少适度严格条件下与任何编码本文所示出的任何LbpA多肽的核酸序列杂交的核酸序列编码。所述术语进一步包括任何LbpA前体，包括前LbpA。如本文所用的术语“核酸序列”是指由天然存在的碱基、糖和糖间(骨架)键联组成的核苷或核苷酸单体的序列。所述术语还包括包含非天然存在的单体或其部分的修饰或取代的序列。本公开的核酸序列可为脱氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA)并且可包括天然存在的碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶核苷以及尿嘧啶。所述序列还可含有修饰的碱基。所述修饰的碱基的实例包括氮杂和脱氮杂腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶核苷和尿嘧啶以及黄嘌呤和次黄嘌呤。本文中可互换使用的术语“编码HIBP表面受体蛋白的核酸序列”和“编码HIBP表面受体多肽的核酸序列”是指任何及所有编码HIBP表面受体蛋白的核酸序列，包括任何HIBP表面受体蛋白和任何编码HIBP表面受体蛋白前体的核酸序列，包括不限于SEQ.IDNO:1；SEQ.IDNO:11；SEQ.IDNO:27；SEQ.IDNO:116；SEQ.IDNO:122；以及SEQ.IDNO:173中示出的那些。如本文所用，“HIBP表面受体蛋白前体”是指另外包含N端信号序列的HIBP表面受体蛋白分子，所述信号序列促进多肽链跨细胞质膜的输出。编码HIBP表面受体蛋白的核酸序列进一步包括以下任何及所有核酸序列，所述序列(i)编码大致上与本文所示出的HIBP表面受体蛋白序列同一的多肽；或(ii)与本文所示出的任何HIBP表面受体蛋白核酸序列在至少适度严格杂交条件下杂交或除了使用同义密码子之外将与其在至少适度严格条件下杂交。本文中可互换使用的术语“编码IOM蛋白的核酸序列”和“编码IOM多肽的核酸序列”是指任何及所有编码IOM蛋白的核酸序列，包括任何IOM蛋白和任何编码IOM蛋白前体的核酸序列，包括不限于SEQ.IDNO:151和SEQ.IDNO:161中示出的那些。如本文所用，“IOM蛋白前体”是指另外包含N端信号序列的IOM蛋白分子，所述信号序列促进多肽链跨细胞质膜的输出。编码IOM蛋白的核酸序列进一步包括以下任何及所有核酸序列，所述序列(i)编码大致上与本文所示出的IOM蛋白序列同一的多肽；或(ii)与本文所示出的任何IOM蛋白核酸序列在至少适度严格杂交条件下杂交或除了使用同义密码子之外将与其在至少适度严格条件下杂交。本文中可互换使用的术语“编码TbpB的核酸序列”、“编码TbpB多肽的核酸序列”是指任何及所有编码TbpB多肽的核酸序列，包括任何TbpB多肽，包括不限于SEQ.IDNO:1；SEQ.IDNO:11；SEQ.IDNO:27；SEQ.IDNO:116；SEQ.IDNO:122；以及SEQ.IDNO:173中示出的那些，并且进一步包括任何编码TbpB前体的核酸序列。如本文所用，“TbpB前体”是指另外包含N端信号序列的TbpB分子，所述信号序列促进多肽链跨细胞质膜的输出。编码TbpB多肽的核酸序列进一步包括以下任何及所有核酸序列，所述序列(i)编码大致上与本文所示出的TbpB多肽序列同一的多肽；或(ii)与本文所示出的任何TbpB核酸序列在至少适度严格杂交条件下杂交或除了使用同义密码子之外将与其在至少适度严格条件下杂交。本文中可互换使用的术语“编码LbpB的核酸序列”、“编码LbpB多肽的核酸序列”是指任何及所有编码LbpB多肽的核酸序列，包括任何LbpB多肽(包括不限于SEQ.IDNO:284中示出的序列)和任何编码LbpB前体的核酸序列。如本文所用，“LbpB前体”是指另外包含N端信号序列的LbpB分子，所述信号序列促进多肽链跨细胞质膜的输出。编码LbpB多肽的核酸序列进一步包括以下任何及所有核酸序列，所述序列(i)编码大致上与本文所示出的LbpB多肽序列同一的多肽；或(ii)与本文所示出的任何LbpB核酸序列在至少适度严格杂交条件下杂交或除了使用同义密码子之外将与其在至少适度严格条件下杂交。本文中可互换使用的术语“编码TbpA的核酸序列”、“编码TbpA多肽的核酸序列”是指任何及所有编码TbpA多肽的核酸序列，包括任何TbpA多肽(包括不限于SEQ.IDNO:151中示出的核酸序列)和任何编码TbpA前体的核酸序列。如本文所用，“TbpA前体”是指另外包含N端信号序列的TbpA分子，所述信号序列促进多肽链跨细胞质膜的输出。编码TbpA多肽的核酸序列进一步包括以下任何及所有核酸序列，所述序列(i)编码大致上与本文所示出的TbpA多肽序列同一的多肽；或(ii)与本文所示出的任何TbpA核酸序列在至少适度严格杂交条件下杂交或除了使用同义密码子之外将与其在至少适度严格条件下杂交。本文中可互换使用的术语“编码LbpA的核酸序列”、“编码LbpA多肽的核酸序列”是指任何及所有编码LbpA多肽的核酸序列，包括任何LbpA多肽(包括不限于SEQ.IDNO:161中示出的核酸序列)和任何编码LbpA前体的核酸序列。如本文所用，“LbpA前体”是指另外包含N端信号序列的LbpA分子，所述信号序列促进多肽链跨细胞质膜的输出。编码LbpA多肽的核酸序列进一步包括以下任何及所有核酸序列，所述序列(i)编码大致上与本文所示出的LbpA多肽序列同一的多肽；或(ii)与本文所示出的任何LbpA核酸序列在至少适度严格杂交条件下杂交或除了使用同义密码子之外将与其在至少适度严格条件下杂交。术语“大致上同一”意味着两个多肽序列优选地为至少50％同一，并且更优选地为至少85％同一并且最优选地至少95％同一，例如96％、97％、98％或99％同一。为了确定两个多肽序列之间的同一性的百分比，使用例如Needleman和Wunsch的比对方法(26)来比对所述两个序列的氨基酸序列，所述比对方法如由Smith和Waterman所修改(27)，使得在所述两个序列之间获得最高阶匹配并且在所述两个序列之间确定同一氨基酸的数目。用于精确地比对两种多肽的优选、广泛适用方法涉及与使用间隙开放罚分10和间隙延伸罚分0.1的BLOSUM62记分矩阵(29)一起使用的ClustalW算法(28)。这使得能鉴定两个序列之间的高记分比对，其中所述两个序列之一的总长度的至少50％牵涉于所述比对中。用于计算两个比对的氨基酸序列之间的同一性百分比的方法一般为领域认可的并且包括例如由Carillo和Lipton描述的那些(30)以及描述于ComputationalMolecularBiology,Lesk编OxfordUniversityPress,NewYork,1988,Biocomputing:InformaticsandGenomicsProjects中的那些。一般地，计算机程序将用于所述计算。可在这方面使用的计算机程序包括但不限于GCG(31)BLASTP、BLASTN以及FASTA(32)。“至少适度严格杂交条件”意味着选择促进溶液中两种互补核酸分子之间的选择性杂交的条件。杂交可针对核酸序列分子的全部或一部分发生。杂交部分典型地为至少15(例如20、25、30、40或50)个核苷酸长。本领域的技术人员将认识到核酸双链体或杂交体的稳定性由Tm确定，所述Tm在含钠缓冲液中为钠离子浓度和温度的函数(Tm＝81.5℃.-16.6(Log10[Na+])+0.41(％(G+C)-600/l)，或类似等式)。因此，在洗涤条件中确定杂交体稳定性的参数为钠离子浓度和温度。为了鉴定与已知的核酸分子类似但不同一的分子，可假定1％错配以产生Tm的约1℃降低，例如如果探寻具有>95％同一性的核酸分子，那么最终洗涤温度将降低约5℃。基于这些考虑，本领域的技术人员将能够容易地选择适当杂交条件。在优选实施方案中，选择严格杂交条件。例如，以下条件可用于实现严格杂交：在Tm(基于以上等式)-5℃下在5×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)/5×Denhardt氏溶液/1.0％SDS中杂交，随后在60℃下用0.2×SSC/0.1％SDS洗涤。适度严格杂交条件包括在42℃下在3×SSC中的洗涤步骤。然而，应理解可使用替代缓冲液、盐以及温度来实现相等严格性。关于杂交条件的额外指导可发现于：Green和Sambrook,MolecularCloning,aLaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2012(33)中。如本文中在核酸序列的情况下所用的术语“嵌合”是指至少两个连接的核酸序列，所述序列并非天然连接。嵌合核酸序列包括连接的具有不同天然起源的核酸序列。例如，构成连接至TbpB多肽或HIBP表面受体蛋白的核酸序列的细菌启动子的核酸序列被视为嵌合的，并且编码其中某些部分已经去除并且用TbpA多肽的部分置换的TbpB多肽的核酸序列被视为嵌合的。嵌合核酸序列也可包含相同天然起源的核酸序列，只要其并非天然连接。例如，构成获自特定细胞类型的启动子的核酸序列可连接至编码获自所述相同细胞类型的多肽但并非通常连接至构成所述启动子的核酸序列的核酸序列。嵌合核酸序列还包括包含连接至任何非天然存在的核酸序列的任何天然存在的核酸序列的核酸序列。术语“大致上不能结合宿主铁结合蛋白”意味着宿主铁结合蛋白结合于HIBP表面受体蛋白的能力以使得天然宿主铁结合蛋白(即，存在于宿主生物体中的宿主铁结合蛋白)与修饰的HIBP表面受体蛋白之间的结合相互作用的结合常数(Kd)或解离常数的值为天然宿主铁结合蛋白与其互补天然HIBP表面受体蛋白之间的结合相互作用的结合常数的值的至少10倍的方式减弱。换句话说，修饰的蛋白具有比天然受体蛋白低10倍的针对结合天然宿主铁结合蛋白的亲和力。在优选实施方案中，由修饰的蛋白结合天然宿主铁结合蛋白的相对亲和力比天然HIBP表面受体蛋白的所述亲和力低30倍，并且在最优选实施方案中，由修饰的蛋白结合天然宿主铁结合蛋白的相对亲和力比天然HIBP表面受体蛋白的所述亲和力低100倍。在进一步优选实施方案中，修饰的HIBP表面受体蛋白与天然宿主铁结合蛋白之间的结合常数为至少300nM。优选地，所述结合常数为至少500nM，并且最优选地为至少1μM。如本文所用的术语“大致上不含”为程度术语，意味着组合物并未含有大量据说所述组合物大致上不含的化合物。当组合物大致上不含化合物，例如大致上不含N端半段结构域时，所述组合物优选地包含少于5.0％的所述化合物，更优选地少于1.0％的所述化合物，并且最优选地少于0.1％的所述化合物。免疫原性组合物如上文所提及，本公开在至少一个实施方案中提供一种包含来自革兰氏阴性病原性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的免疫原性组合物，其中所述HIBP表面受体蛋白已经以使得其不能大致上结合宿主铁结合蛋白的方式被修饰。与HIBP表面受体蛋白一起的术语“修饰”意图指其中已经去除至少一个氨基酸残基或其中至少一个氨基酸残基已经由另一残基置换的非天然HIBP表面受体蛋白，或已经片段化为两种或更多种独立多肽的HIBP表面受体蛋白。因此，修饰的HIBP表面受体蛋白包括不限于截短的HIBP表面受体蛋白(例如HIBP表面受体蛋白的N端半段结构域或C端半段结构域)；其中已经去除一个或多个氨基酸残基的HIBP表面受体蛋白(例如其中已经去除N端半段结构域或C端半段结构域内的环结构域的一个或多个氨基酸的HIBP表面受体蛋白)；其中已经插入额外氨基酸的HIBP表面受体蛋白(例如其中一个或多个氨基酸已经添加至N端半段结构域或C端半段结构域内的环结构域的HIBP表面受体蛋白)；多聚体或延伸HIBP多肽(例如二聚体和三聚体以及N端半段结构域或C端半段结构域二聚体和三聚体)；已经通过定点诱变进行修饰以改变一个或多个氨基酸的HIBP表面受体蛋白；以及两种或更多种HIBP表面受体蛋白多肽的混合物(例如包含HIBP表面受体蛋白的独立N端半段结构域和C端半段结构域的混合物)。本公开的修饰的HIBP表面受体蛋白不能大致上结合天然宿主铁结合蛋白。如上文所提及，本公开一方面提供一种包含多肽或由多肽组成的免疫原性组合物，所述多肽包含可获自或获自革兰氏阴性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域，其中所述多肽不能大致上结合宿主铁结合蛋白。在其它方面，本公开提供一种多肽，所述多肽包含HIBP表面受体多肽的C端半段结构域或N端半段结构域，其中所述C端半段结构域或所述N端半段结构域包含由多个环结构域连接的多个β链，并且其中所述多个环结构域的至少一个环结构域已经被修饰，并且其中所述多肽不能大致上结合宿主铁结合蛋白。根据本公开，可使用任何包含可获自革兰氏阴性病原性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域或由所述结构域组成的多肽或编码所述多肽的核酸序列。在其中使用天然C端半段结构域的本公开的实施方案中，包含天然C端半段结构域的多肽并未包含HIBP表面受体蛋白的天然N端半段结构域并且未经由肽键化学连接至所述天然N端半段结构域，并且因此为分离的天然C端半段结构域，即与天然N端半段结构域分离的天然C端半段结构域。因此，在某些实施方案中，提供不含或大致上不含HIBP表面受体多肽的N端半段结构域或其部分的包含HIBP表面受体多肽的C端半段结构域的制剂。在其中使用天然N端半段结构域的本公开的实施方案中，包含天然N端半段结构域的多肽并未包含HIBP表面受体蛋白的天然C端半段结构域并且未经由肽键化学连接至所述天然C端半段结构域，并且因此为分离的天然N端半段结构域，即与天然C端半段结构域分离的N端半段结构域。因此，在某些实施方案中，提供不含或大致上不含HIBP表面受体多肽的C端半段结构域或其部分的包含HIBP表面受体多肽的N端半段结构域的制剂。然而，在某些实施方案中可使用天然C端半段结构域或其部分和天然N端半段结构域或其部分的混合物，然而限制条件在于所述N端半段结构域和所述C端半段结构域未化学连接，即其未通过肽键化学连接。因此，本公开包括一种免疫原性组合物，其包含包含N端半段结构域的多肽和包含C端半段结构域的多肽的混合物，其中所述N端半段结构域和所述C端半段结构域未物理连接。为了获得本公开的多肽，可使用任何HIBP表面受体蛋白或可获自或获自任何革兰氏阴性细菌物种的TbpB多肽，所述细菌物种包括但不限于任何病原性细菌物种或菌株，并且包括但不限于属于细菌巴斯德菌科、莫拉氏菌科或奈瑟氏球菌科的任何细菌物种和属于细菌放线杆菌属、奈瑟氏球菌属、嗜血杆菌属、曼氏杆菌属、嗜组织菌属、巴斯德菌属或莫拉氏菌属的细菌物种。所述多肽进一步包括可获自或获自任何HIBP表面受体蛋白的任何多肽，或可获自或获自任何TbpB多肽的任何多肽，所述TbpB多肽可获自或获自以下细菌物种：胸膜肺炎放线杆菌(12,34)、猪放线杆菌、流感嗜血杆菌(35,36)、副猪嗜血杆菌(37)、睡眠嗜血杆菌(本领域中还称为睡眠嗜组织菌)(38)、溶血性曼氏杆菌(本领域中还称为溶血性巴斯德菌)(39)、卡他莫拉氏菌(40)、牛莫拉氏菌、淋病奈瑟氏球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌(41,42)、葡萄糖苷酶曼氏杆菌(本领域中还称为溶血性巴斯德菌)以及海藻糖巴斯德菌(本领域中还称为海藻糖巴斯德菌(Pasteurellatrehalosi))。可根据本文使用的示例性C端半段结构域和N端半段结构域多肽进一步包括SEQ.IDNO:5；SEQ.IDNO:6；SEQ.IDNO:22；SEQ.IDNO:33；SEQ.IDNO:34；SEQ.IDNO:119；SEQ.IDNO:125；SEQ.IDNO:179至SEQ.IDNO:195；SEQ.IDNO:213至SEQ.IDNO:218；SEQ.IDNO:230；SEQ.IDNO:232；SEQ.IDNO:234至SEQ.IDNO:278；以及SEQ.IDNO:288至SEQ.IDNO:292中示出的任何C端半段结构域，和SEQ.IDNO:8；SEQ.IDNO:10；SEQ.IDNO:24；SEQ.IDNO:26；SEQ.IDNO:36；SEQ.IDNO:38；SEQ.IDNO:121；SEQ.IDNO:127；SEQ.IDNO:229；SEQ.IDNO:231；以及SEQ.IDNO:233中示出的任何N端半段结构域，并且进一步包括可由HIBP多肽或TbpB多肽或通过使用由SEQ.IDNO:1；SEQ.IDNO:11；SEQ.IDNO:27；SEQ.IDNO:116；SEQ.IDNO:122；以及SEQ.IDNO:173编码的核酸序列制备的任何C端半段结构域或N端半段结构域，所述HIBP多肽或TbpB多肽包括不限于SEQ.IDNO:2；SEQ.IDNO:12；SEQ.IDNO:28；SEQ.IDNO:107至SEQ.IDNO:115；SEQIDNO:117；SEQ.IDNO:123；SEQ.IDNO:131至SEQ.IDNO:147；SEQ.IDNO:177；SEQ.IDNO:178；SEQ.IDNO:196至SEQ.IDNO:204；SEQ.IDNO:206至SEQ.IDNO:212；以及SEQ.IDNO:219至SEQ.IDNO:228中示出的多肽。使用这些核酸序列和多肽序列，额外的新颖HIBP表面受体蛋白和TbpB序列和C端半段结构域或N端半段结构域可容易地由本领域的技术人员鉴定。例如，可筛选表达文库、cDNA文库和基因组文库并且可针对类似序列搜索包含序列信息的数据库。本公开的免疫原性制剂在将其施用于脊椎动物受试者之后在所述脊椎动物受试者中引起免疫反应，呈刺激所述脊椎动物受试者产生抗体的形式。据此，所述抗体对至少一种革兰氏阴性菌株具反应性。然而，优选地所述抗体对多种菌株或细菌物种具交叉反应性和/或交叉保护性，并且优选地所述交叉反应性和/或交叉保护在表达一种或多种宿主铁结合蛋白(如转铁蛋白或乳铁传递蛋白)的宿主中获得。如本文所用的术语“交叉反应性”是指由获自一种菌株的免疫原性组合物诱导的免疫反应刺激能够另外与不同菌株或不同种反应的抗体的产生的能力。如本文所用的术语“交叉保护性”是指由获自一种菌株的免疫原性组合物诱导的免疫反应预防或削弱由至少一种额外菌株或细菌物种引起的感染或疾病的能力。在本公开的优选实施方案中，本公开的免疫原性组合物对多种菌株或细菌物种，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种细菌物种或菌株具交叉反应性和/或交叉保护性。交叉反应性被视为交叉保护的指标。本领域的技术人员应容易了解，本公开的前述方面通过允许一种免疫原性化合物(即，可获自HIBP表面受体蛋白的免疫原性化合物)的产生来促进疫苗制造，其提供对抗多种传染性菌株或细菌物种的保护。本公开的免疫原性制剂在脊椎动物受试者中且尤其在表达宿主铁结合蛋白(如转铁蛋白和乳铁传递蛋白)的脊椎动物受试者中产生意外有效的免疫反应，超出当使用利用天然HIBP蛋白的免疫制剂时所产生的免疫反应的有效性。所述有效免疫反应的一方面为免疫反应的量值。优选地，使用本公开的免疫原性组合物获得的抗体效价超出天然HIBP蛋白的抗体效价达至少2倍，更优选地至少5倍，最优选地至少10倍。在优选实施方案中，使用包含至少两种多肽的混合物，各多肽包含C端半段结构域或由C端半段结构域组成；或使用包含至少两种多肽的混合物，各多肽包含N端半段结构域或由N端半段结构域组成；或使用包含至少三种多肽的混合物，所述多肽包含至少两个C端半段结构域和至少一个N端半段结构域或由所述结构域组成；或使用包含至少三种多肽的混合物，所述多肽包含至少两个N端半段结构域和至少一个C端半段结构域或由所述结构域组成。在优选实施方案中，所述至少两种多肽可获自或获自能够感染相同脊椎动物物种的革兰氏阴性细菌属或种。因此，所述至少两种多肽将选自例如TbpB多肽的两个C端半段结构域，其中两个C端半段结构域可获自或获自TbpB多肽，所述TbpB多肽获自或可获自能够感染猪的放线杆菌株；或例如TbpB多肽的两个C端半段结构域，其中两个C端半段结构域可获自或获自TbpB多肽，所述TbpB多肽获自或可获自能够感染牛的嗜血杆菌株。在其中使用至少两个C端半段结构域的实施方案中，所述混合物优选地不含或大致上不含N端半段结构域或其部分。在其中使用至少两个N端半段结构域的实施方案中，所述混合物优选地不含或大致上不含C端半段结构域或其部分。在尤其优选的实施方案中，根据本公开，使用至少两种多肽的混合物，各多肽包含可获自或获自革兰氏阴性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或由所述C端半段结构域组成。在所述实施方案中，所述混合物优选地不含N端半段结构域或其部分。在尤其优选实施方案中，使用可获自或获自SEQ.IDNO:2；SEQ.IDNO:12；SEQ.IDNO:28；SEQ.IDNO:107至SEQ.IDNO:115；SEQIDNO:117；SEQ.IDNO:123；SEQ.IDNO:131至SEQ.IDNO:147；SEQ.IDNO:177；SEQ.IDNO:178；SEQ.IDNO:196至SEQ.IDNO:204；SEQ.IDNO:206至SEQ.IDNO:212；以及SEQ.IDNO:219至SEQ.IDNO:228中示出的HIBP表面受体多肽的任何两个C端半段结构域；或使用可获自或获自SEQ.IDNO:1；SEQ.IDNO:11；SEQ.IDNO:27；SEQ.IDNO:116；SEQ.IDNO:122；以及SEQ.IDNO:173中示出的核酸序列的任何两个C端半段结构域。在进一步优选实施方案中，使用选自SEQ.IDNO:5；SEQ.IDNO:6；SEQ.IDNO:22；SEQ.IDNO:33；SEQ.IDNO:34；SEQ.IDNO:119；SEQ.IDNO:125；SEQ.IDNO:179至SEQ.IDNO:195；以及SEQ.IDNO:213至SEQ.IDNO:218；SEQ.IDNO:230；SEQ.IDNO:232；SEQ.IDNO:234至SEQ.IDNO:278；以及SEQ.IDNO:288至SEQ.IDNO:292中示出的任何两个C端半段结构域。在进一步尤其优选实施方案中，使用可获自或获自HIBP表面受体蛋白的至少两个C端半段结构域，其中至少一个C端半段结构域可获自或获自属于细菌放线杆菌属、嗜血杆菌属、嗜组织菌属、曼氏杆菌属、莫拉氏菌属、奈瑟氏球菌属、巴斯德菌属(Pasteurella)和巴斯德菌属(Bibersteinia)的细菌物种。在进一步尤其优选实施方案中，使用至少两个C端半段结构域，其中至少一个C端半段结构域可获自或获自HIBP表面受体蛋白，所述HIBP表面受体蛋白可获自或获自胸膜肺炎放线杆菌，优选地SEQ.ID.NO:6或SEQ.IDNO:22中示出的C端半段结构域，或其中至少一个C端半段结构域可获自或获自HIBP表面受体蛋白，所述HIBP表面受体蛋白可获自或获自猪放线杆菌，优选地SEQ.IDNO:34中示出的C端半段结构域。在进一步尤其优选实施方案中，使用至少两个C端半段结构域，其中至少一个C端半段结构域可获自或获自HIBP表面受体蛋白，所述HIBP表面受体蛋白可获自或获自溶血性曼氏杆菌，优选地SEQ.ID.NO:232或SEQ.IDNO:234中示出的C端半段结构域，或其中至少一个C端半段结构域可获自或获自HIBP表面受体蛋白，所述HIBP表面受体蛋白可获自或获自葡萄糖苷酶曼氏杆菌。在进一步尤其优选实施方案中，使用至少两个C端半段结构域，其中至少一个C端半段结构域可获自或获自HIBP表面受体蛋白，所述HIBP表面受体蛋白可获自或获自淋病奈瑟氏球菌，优选地SEQ.ID.NO:213至SEQ.IDNO:,218中示出的C端半段结构域之一，或其中至少一个C端半段结构域可获自或获自HIBP表面受体蛋白，所述HIBP表面受体蛋白可获自或获自脑膜炎奈瑟氏球菌，优选地SEQ.ID.NO:119；SEQ.IDNO:125；SEQ.IDNO:128；SEQ.IDNO:129；SEQ.IDNO:130；SEQ.IDNO:131；SEQ.IDNO:152；SEQ.IDNO:154；SEQ.IDNO:156；SEQ.IDNO:158；SEQ.IDNO:160；SEQ.IDNO:164；SEQ.IDNO:166；SEQ.IDNO:168；SEQ.IDNO:179至SEQ.IDNO:195；以及SEQ.IDNO:235至SEQ.IDNO:278中示出的C端半段结构域之一。在进一步尤其优选实施方案中，使用至少两个C端半段结构域，其中至少一个C端半段结构域可获自或获自HIBP表面受体蛋白，所述HIBP表面受体蛋白可获自或获自海藻糖巴斯德菌，优选地SEQ.ID.NO:292中示出的C端半段结构域。在进一步优选实施方案中，使用至少两个可获自或获自HIBP表面受体多肽的C端半段结构域，其中所述两个C端半段结构域均可获自或获自两个细菌物种，所述细菌物种选自胸膜肺炎放线杆菌，优选地SEQ.IDNO:6或SEQ.IDNO:22中示出的C端半段结构域；猪放线杆菌，优选地SEQ.IDNO:34中示出的C端半段结构域；以及副猪嗜血杆菌，优选地SEQ.IDNO:294中示出的C端半段结构域。在进一步优选实施方案中，使用至少两个可获自或获自HIBP表面受体多肽的C端半段结构域，其中所述两个C端半段结构域之一可获自或获自淋病奈瑟氏球菌，优选地SEQ.ID.NO:213至SEQ.IDNO:,218中示出的C端半段结构域之一，并且另一个C端半段结构域可获自脑膜炎奈瑟氏球菌，优选地SEQ.ID.NO:119；SEQ.IDNO:125；SEQ.IDNO:128；SEQ.IDNO:129；SEQ.IDNO:130；SEQ.IDNO:131；SEQ.IDNO:152；SEQ.IDNO:154；SEQ.IDNO:156；SEQ.IDNO:158；SEQ.IDNO:160；SEQ.IDNO:164；SEQ.IDNO:166；SEQ.IDNO:168；SEQ.IDNO:179至SEQ.IDNO:195；以及SEQ.IDNO:235至SEQ.IDNO:278中示出的C端半段结构域之一。在进一步优选实施方案中，使用至少两个可获自或获自HIBP表面受体多肽的C端半段结构域，其中所述两个C端半段结构域之一可获自或获自溶血性曼氏杆菌，优选地SEQ.ID.NO:232；或SEQ.IDNO:234中示出的C端半段结构域，并且另一个C端半段可获自或获自海藻糖巴斯德菌，优选地SEQ.IDNO:292中示出的C端半段结构域。在进一步优选实施方案中，使用至少两个可获自或获自TbpB多肽的C端半段结构域，其中所述两个C端半段结构域均可获自或获自一种细菌物种或两种细菌物种，并且其中所述TbpB多肽或由其获得的C端半段结构域为抗原性趋异的。所述TbpB或C端半段结构域优选地获自能够交换TbpB变体的细菌物种或菌株。如本文中关于两种TbpB多肽或TbpB多肽的C端半段结构域所用的术语“抗原性趋异”意味着所述两种TbpB多肽或TbpB多肽的C端半段结构域当用于建构使用代表性数目的TbpB多肽或C端半段结构域多肽的系统发生树时属于系统发生树的趋异性分枝或组。据此，可建构具有任何量的TbpB或C端半段结构域多肽的系统发生树，然而，优选地使用至少25个TbpB多肽或C端半段结构域多肽，更优选地至少30个、至少40个或至少50个TbpB多肽或C端半段结构域多肽来建构系统发生树，并且优选地系统发生树以使得其包含至少2个高于根级别的节阶的方式建构，更优选地系统发生树包含至少3、4或5个高于根级别的节阶，最优选地至少6、7、8、9或10个高于根级别的节阶(如以下和图30中进一步解释)。抗原性趋异的TbpB多肽或C端半段结构域多肽优选地属于不同分枝，所述分枝(i)在低于系统发生树的最高阶节点至少2个节阶的节点处趋异(例如，如果系统发生树的最高阶节点为第9阶节点，那么抗原性趋异的多肽为在第7阶节点或更低阶节点(即，第6、第5、第4、第3、第2或第1阶节点)处趋异的那些多肽)；和/或(ii)在系统发生树的第1、第2或第3节阶处趋异。数种计算机程序可用于促进使用TbpB多肽或C端半段结构域多肽建构系统发生树，包括：(i)执行序列比对的计算机程序，如使用如T-Coffee服务器站点(http://www.tcoffee.org/)上所实施的M-Coffee比对算法的程序(43)；(ii)编辑比对的计算机程序，如GeneiousPro(44)；(iii)自动化清除比对的计算机程序，如GBlocks(45)；(iv)选择可与比对相容的演化模型的计算机程序，如ProtTestv3.2(Darriba等人,2011)；和(iv)产生系统发生树的计算机程序，如使用最大可能性方法PhyML(46)的程序，所述方法在一般时间可逆(GTR)模型(47)(48,49)或其它模型(如JTT+I+G+F模型或WAG+G＝F模型)上运行，或如PHYLIP和PAUP(UniversityofWashington)的程序。这些程序中的每一者均优选地经配置，使得树分枝被视为统计学显著的。然而，应注意位于更远端的分枝可具有较低统计学显著性，因此优选选择属于基于最低阶节点的组的株。现在参看图30，出于说明性目的显示具有根120、中间分枝(如由130、131、140、141、142以及143所说明)和总计38个远端分枝(如由远端分枝150、151、152、153、154以及155所说明)的系统发生树100，各远端分枝表示获自38种菌株(株1–38(110))之一的相关多肽。所示的各分枝源于节点(如由节点161、171、172、181、182、183以及184所说明)。因此，例如，分枝130源于节点161并且分枝143源于节点172。最接近树根(120)的节点(161)更特定地称为第一阶节点161；节点171和172更特定地称为第2阶节点171和172；节点181、182、183和184更特定地称为第3阶节点181、182、183和184；并且其它节点(加以必要的变更)可称为第4、第5、第6、第7等阶节点。图30中显示其它四组(组1(105)，菌株(110)1-17的多肽；组2(106)，菌株(110)18-24的多肽；组3(107)，菌株(110)25-30的多肽；以及组4(108)，菌株(110)26-38的多肽)。属于组1(105)或组2(106)的菌株的多肽均属于在系统发生树(100)的第一阶节点(161)处趋异的分枝(131)。同样，属于组3(105)或组4(106)的菌株的多肽均属于在系统发生树(100)的第一阶节点(161)处趋异的分枝(131)。因此，所有属于组1(105)或组2(106)的菌株的多肽与所有属于组3(107)或组4(108)的菌株的多肽抗原性趋异。属于组1(105)或组2(106)的菌株的多肽属于在系统发生树(100)的第2阶节点(172)处趋异的组。属于组1(105)的菌株的多肽据此还与属于组2(106)的菌株抗原性趋异。应注意，系统发生树可以不同格式，例如以矩形格式(例如图30中)或以圆形格式(如图10中)表示。使用TbpB多肽或C端半段或TbpB多肽建构的示例性系统发生树提供于图4(包含胸膜肺炎放线杆菌、猪放线杆菌和副猪嗜血杆菌株)、图10(包含脑膜炎奈瑟氏球菌株)、图26(包含脑膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌株)、图27(包含流感嗜血杆菌株)、图28(包含溶血性曼氏杆菌和海藻糖巴斯德菌株)和图29(包含卡他莫拉氏菌株)中。在进一步优选实施方案中，使用可获自或获自TbpB多肽的至少两个C端半段结构域，其中所述两个C端半段结构域均可获自或获自胸膜肺炎放线杆菌、猪放线杆菌和副猪嗜血杆菌。参看图4中所示出的系统发生树，在优选实施方案中，使用至少两个C端半段结构域，其中第一C端半段结构域获自选自属于图4中所示出的系统发生组1、系统发生组2或系统发生组3的胸膜肺炎放线杆菌、猪放线杆菌或副猪嗜血杆菌菌株的C端半段结构域中的任一者，并且其中第二C端半段结构域获自选自属于图4中所示出的系统发生组(非选出第一C端半段结构域的系统发生组)的胸膜肺炎放线杆菌、猪放线杆菌或副猪嗜血杆菌株的C端半段结构域中的任一者。在进一步优选实施方案中，使用至少三个C端半段结构域，其中使用属于属于图4中所示出的系统发生组1的胸膜肺炎放线杆菌、猪放线杆菌或副猪嗜血杆菌菌株的第一C端半段结构域，使用属于属于图4中所示出的系统发生组2的胸膜肺炎放线杆菌、猪放线杆菌或副猪嗜血杆菌菌株的第二C端半段结构域，并且使用属于属于图4中所示出的系统发生组3的胸膜肺炎放线杆菌、猪放线杆菌或副猪嗜血杆菌菌株的第三C端半段结构域。因此，举特定实例，来自猪放线杆菌H57(系统发生组1；图4黑色箭头)的C端半段结构域可与来自胸膜肺炎放线杆菌H87(系统发生组2；图4黑色箭头)的C端半段结构域和来自胸膜肺炎放线杆菌H49(系统发生组3；图4黑色箭头)的C端半段结构域组合。在进一步优选实施方案中，使用可获自或获自TbpB蛋白的至少两个C端半段结构域，其中所述两个C端半段结构域均可获自或获自脑膜炎奈瑟氏球菌。参看图10A中所示出的系统发生树，在优选实施方案中，使用至少两个C端半段结构域，其中第一C端半段结构域获自选自属于图10A中所示出的系统发生组1、系统发生组2、系统发生组3或系统发生组4的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的C端半段结构域中的任一者，并且其中第二C端半段结构域获自属于图10A中所示出的系统发生组(非选出第一C端半段结构域的系统发生组)的脑膜炎奈瑟氏球菌株的任一者。因此，仅举例来说，获自脑膜炎奈瑟氏球菌株B16B6(系统发生组1；图10A，黑色箭头)的TbpBC端半段结构域可与来自株M982(系统发生组4；图10A，黑色箭头)的TbpBC端半段结构域组合。在进一步优选实施方案中，使用至少三个C端半段结构域，其中所述C端半段结构域选自属于图10A中所示出的三个不同组的株(例如，选自各系统发生组1、系统发生组2和系统发生组3的C端半段结构域)。在进一步优选实施方案中，使用至少四个C端半段结构域，其中使用属于属于图10A中所示出的组1的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的第一C端半段结构域，使用属于属于图10A中所示出的组2的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的第二C端半段结构域，并且使用属于属于图10A中所示出的系统发生组3的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的第三C端半段结构域并且使用属于属于图10A中所示出的系统发生组4的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的第四C端半段结构域。因此，仅举特定实例，可选择来自脑膜炎奈瑟氏球菌株B16B6(系统发生组1；图10A，黑色箭头)、BZ169(系统发生组2；图10A，黑色箭头)、S3131(系统发生组3；图10A，黑色箭头)以及M982(系统发生组4；图10A，黑色箭头)的TbpBC端半段结构域。在进一步优选实施方案中，使用可获自或获自TbpB多肽的至少两个C端半段结构域，其中所述两个C端半段结构域之一可获自或获自脑膜炎奈瑟氏球菌并且另一个C端半段可获自或获自淋病奈瑟氏球菌。参看图26B中所示出的系统发生树，在优选实施方案中，使用至少两个C端半段结构域，其中第一C端半段结构域获自选自属于图26B中所示出的系统发生组3的淋病奈瑟氏球菌菌株的C端半段结构域中的任一者，并且其中第二C端半段结构域获自选自属于图26B中所示出的系统发生组1或组2的脑膜炎奈瑟氏球菌株的C端半段结构域中的任一者。更优选地，使用可获自或获自TbpB多肽的至少三个C端半段结构域，其中两个C端半段结构域可获自或获自脑膜炎奈瑟氏球菌并且另一个C端半段可获自或获自淋病奈瑟氏球菌。优选地，C端半段结构域选自属于图26B中所示出的系统发生组3的淋病奈瑟氏球菌菌株，第二C端半段结构域获自选自属于图26B中所示出的系统发生组2的脑膜炎奈瑟氏球菌株的C端半段结构域中的任一者，并且第三C端半段结构域获自选自属于图26B中所示出的系统发生组1的脑膜炎奈瑟氏球菌株的C端半段结构域中的任一者。在进一步优选实施方案中，使用可获自或获自TbpB多肽的至少四个C端半段结构域，其中三个C端半段结构域可获自或获自脑膜炎奈瑟氏球菌并且另一个C端半段可获自或获自淋病奈瑟氏球菌。优选地，C端半段结构域选自属于图26B中所示出的系统发生组3的淋病奈瑟氏球菌菌株，第二和第三C端半段结构域获自选自属于图26B中所示出的系统发生组2的两个不同子组(例如系统发生子组2.1和系统发生子组2.2)的脑膜炎奈瑟氏球菌株的C端半段结构域中的任一者，并且第四C端半段结构域获自选自属于图26B中所示出的系统发生组1的脑膜炎奈瑟氏球菌株的C端半段结构域中的任一者。在进一步优选实施方案中，使用可获自或获自TbpB多肽的至少四个C端半段结构域，其中两个C端半段结构域可获自或获自脑膜炎奈瑟氏球菌并且另两个C端半段可获自或获自淋病奈瑟氏球菌。优选地，所述两个选自淋病奈瑟氏球菌菌株的C端半段结构域属于图26B中所示出的系统发生组3的两个不同系统发生子组(例如子组3.1和子组3.2)，第三和第四C端半段结构域获自分别属于系统发生组1和系统发生组2的脑膜炎奈瑟氏球菌株。在另一实施方案中，使用可获自或获自TbpB多肽的至少五个C端半段结构域，其中三个C端半段结构域可获自或获自脑膜炎奈瑟氏球菌并且另两个C端半段可获自或获自淋病奈瑟氏球菌。优选地，所述两个选自淋病奈瑟氏球菌菌株的C端半段结构域属于图26B中所示出的系统发生组3的两个不同系统发生子组(例如子组3.1和子组3.2)，第三和第四C端半段结构域获自属于图26B中所示出的系统发生组2的两个不同系统发生子组(例如子组2.1和子组2.2)的脑膜炎奈瑟氏球菌株，并且第五C端半段结构域属于属于图26B中所示出的系统发生组1的脑膜炎奈瑟氏球菌株。在进一步优选实施方案中，使用可获自或获自TbpB多肽的至少六个C端半段结构域。在这一实施方案中，至少一个C端半段结构域获自或可获自脑膜炎奈瑟氏球菌并且至少一个C端半段结构域获自或可获自淋病奈瑟氏球菌，其它C端半段获自或可获自根据图26B抗原性趋异的株。在优选实施方案中，三个C端半段结构域可获自或获自脑膜炎奈瑟氏球菌并且另三个C端半段可获自或获自淋病奈瑟氏球菌。参看图26B，优选地所述三个获自淋病奈瑟氏球菌株的C端半段结构域属于三个抗原性趋异的组，并且所述三个获自脑膜炎奈瑟氏球菌的C端半段结构域属于三种抗原性趋异的株。在进一步优选实施方案中，使用可获自或获自TbpB多肽的至少两个C端半段结构域，其中所述两个C端半段结构域之一可获自或获自脑膜炎奈瑟氏球菌并且另一个C端半段可获自或获自淋病奈瑟氏球菌。参看图26A中所示出的系统发生树，在优选实施方案中，使用至少两个C端半段结构域，其中第一C端半段结构域获自选自属于图26A中所示出的系统发生组3或系统发生组1的淋病奈瑟氏球菌菌株的C端半段结构域中的任一者，并且其中第二C端半段结构域获自选自属于图26A中所示出的系统发生组2、组4或组5的脑膜炎奈瑟氏球菌株的C端半段结构域中的任一者。在进一步优选实施方案中，使用可获自或获自TbpB蛋白的至少两个C端半段结构域，其中所述两个C端半段结构域均可获自或获自流感嗜血杆菌。参看图27A和图27B中所示出的系统发生树，在优选实施方案中，使用至少两个C端半段结构域，其中第一C端半段结构域获自选自属于图27A或图27B中所示出的系统发生组1、系统发生组2或系统发生组3的流感嗜血杆菌菌株的C端半段结构域中的任一者，并且其中第二C端半段结构域获自属于图27A或图27B中所示出的系统发生组(非选出第一C端半段结构域的系统发生组)的流感嗜血杆菌株的任一者。因此，仅举例来说，获自流感嗜血杆菌株H216(系统发生组3；图27B，黑色箭头)的TbpBC端半段结构域可与来自株H214(系统发生组1；图27B，黑色箭头)的TbpBC端半段结构域组合。在进一步优选实施方案中，使用至少三个C端半段结构域，其中所述C端半段结构域选自属于图27A和图27B中所示出的三个不同组的株(即，选自各系统发生组1、系统发生组2和系统发生组3的C端半段结构域)。因此，仅举特定实例，可选择来自流感嗜血杆菌株H216(系统发生组3；图27B，黑色箭头)、H214(系统发生组1；图27B，黑色箭头)以及H011(系统发生组2；图27B，黑色箭头)的TbpBC端半段结构域。在进一步优选实施方案中，使用可获自或获自TbpB蛋白的至少两个C端半段结构域，其中所述两个C端半段结构域均可获自或获自溶血性曼氏杆菌。参看图28中所示出的系统发生树，在优选实施方案中，使用至少两个C端半段结构域，其中第一C端半段结构域获自选自属于图28中所示出的系统发生组1的溶血性曼氏杆菌菌株的C端半段结构域中的任一者，并且其中第二C端半段结构域获自属于系统发生组3的溶血性曼氏杆菌株中的任一者。在进一步优选实施方案中，使用可获自或获自TbpB多肽的至少两个C端半段结构域，其中所述两个C端半段结构域之一可获自或获自海藻糖巴斯德菌并且另一个C端半段可获自或获自溶血性曼氏杆菌。参看图28，在优选实施方案中，使用至少两个C端半段结构域，其中第一C端半段结构域获自选自属于图28中所示出的系统发生组2的海藻糖巴斯德菌菌株的C端半段结构域中的任一者，并且其中第二C端半段结构域获自选自属于图28中所示出的系统发生组1或组3的溶血性曼氏杆菌株的C端半段结构域中的任一者。在进一步优选实施方案中，使用可获自或获自TbpB蛋白的至少两个C端半段结构域，其中所述两个C端半段结构域均可获自或获自卡他莫拉氏菌。参看图29中所示出的系统发生树，在优选实施方案中，使用至少两个C端半段结构域，其中第一C端半段结构域获自选自属于图29中所示出的系统发生组1、系统发生组2或系统发生组3的卡他莫拉氏菌菌株的C端半段结构域中的任一者，并且其中第二C端半段结构域获自属于图29中所示出的系统发生组(非选出第一C端半段结构域的系统发生组)的卡他莫拉氏菌株的任一者。因此，仅举例来说，获自卡他莫拉氏菌株AAC34279.1(系统发生组3；图29，黑色箭头)的TbpBC端半段结构域可与来自株AAD12263.1(系统发生组1；图29，黑色箭头)的TbpBC端半段结构域组合。在进一步优选实施方案中，使用至少三个C端半段结构域，其中所述C端半段结构域选自属于图29中所示出的三个不同组的株(即，选自各系统发生组1、系统发生组2和系统发生组3的C端半段结构域)。因此，仅举特定实例，可选择来自卡他莫拉氏菌株AAC34279.1(系统发生组3；图29，黑色箭头)、AAD12263.1(系统发生组1；图29，黑色箭头)以及003664398.1(系统发生组2；图29，黑色箭头)的TbpBC端半段结构域。在尤其优选实施方案中，包含C端半段结构域或由C端半段结构域组成的多肽的前述混合物为可获自或获自TbpB多肽的C端半段结构域，包括不限于SEQ.IDNO:5；SEQ.IDNO:6；SEQ.IDNO:22；SEQ.IDNO:33；SEQ.IDNO:34；SEQ.IDNO:119；SEQ.IDNO:125；SEQ.IDNO:179至SEQ.IDNO:195；以及SEQ.IDNO:213至SEQ.IDNO:218；SEQ.IDNO:230；SEQ.IDNO:232；以及SEQ.IDNO:234至SEQ.IDNO:278中示出的C端半段结构域。C端半段结构域的前述混合物可通过混合包含个别C端半段结构域的制剂或通过重组制造包含两种或更多种C端半段结构域的融合多肽来制备。如上文所提及，本公开的免疫原性制剂优选地为交叉反应性的和/或交叉保护性的。虽然如上文所提及，包含单一C端半段结构域的制剂可为交叉反应性的和/或交叉保护性的，但C端半段结构域的混合物为尤其优选的，因为其可用于制备大致上加宽对抗更广泛范围的菌株和/或细菌物种的交叉反应性和/或交叉保护性的免疫原性制剂，并且允许制备提供免于由多种细菌物种或菌株传播的感染或疾病的保护的疫苗制剂。根据其它实施方案，包含HIBP表面受体多肽的C端半段结构域和/或N端半段结构域的多肽以使得连接所述C端半段结构域或所述N端半段结构域内的两个β链的环结构域被修饰并且所述多肽不能大致上结合宿主铁结合蛋白的方式制备。如本文中与环结构域一起使用的术语“修饰”是指已经去除或置换至少一个氨基酸残基的环。因此，所述C端半段结构域或所述N端半段结构域内的所得环可截短，或在其它实施方案中，所述氨基酸残基可用一个或多个替代氨基残基置换。图1和图2显示示例性HIBP表面受体蛋白的环结构域。图8和图14分别提供N端半段结构域和C端半段结构域中的环减少的实例。据此，至少一个连接HIBP结合膜受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域内的两个β链的环结构域被修饰以从所述环结构域去除至少一个氨基酸残基，所得多肽包含修饰的N端半段结构域或C端半段结构域并且不能大致上结合宿主铁结合蛋白。在其它实施方案中，去除多个氨基酸残基，例如从环结构域去除至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100个氨基酸残基。在其它实施方案中，去除环结构域整体。可选择所述环结构域中的任一者根据本公开进行修饰，只要所述修饰产生不能大致上结合宿主铁结合蛋白的多肽。因此，参看图1的示例性猪TbpB多肽，在其中一个环结构域被修饰的本公开实施方案中，可选择所述环结构域为环结构域L1-L32中的任一者(如分别由胸膜肺炎放线杆菌环L1-L32多肽序列例示：SEQ.IDNO:NO42；SEQ.ID:NO44；SEQ.ID:NO46；SEQ.ID:NO48；SEQ.ID:NO50；SEQ.ID:NO52；SEQ.ID:NO54；SEQ.ID:NO56；SEQ.ID:NO58；SEQ.ID:NO60；SEQ.ID:NO62；SEQ.ID:NO64；SEQ.ID:NO66；SEQ.ID:NO68；SEQ.ID:NO70；SEQ.ID:NO72；SEQ.ID:NO74；SEQ.ID:NO76；SEQ.ID:NO78；SEQ.ID:NO80；SEQ.ID:NO82；SEQ.ID:NO84；SEQ.ID:NO86；SEQ.ID:NO88；SEQ.ID:NO90；SEQ.ID:NO92；SEQ.ID:NO94；SEQ.ID:NO96；SEQ.ID:NO98；SEQ.ID:NO100；SEQ.ID:NO102；SEQ.ID:NO104；以及SEQ.ID:NO106，并且分别由核酸序列SEQ.ID:NO41；SEQ.ID:NO43；SEQ.ID:NO45；SEQ.ID:NO47；SEQ.ID:NO49；SEQ.ID:NO51；SEQ.ID:NO53；SEQ.ID:NO55；SEQ.ID:NO57；SEQ.ID:NO59；SEQ.ID:NO61；SEQ.ID:NO63；SEQ.ID:NO65；SEQ.ID:NO67；SEQ.ID:NO69；SEQ.ID:NO71；SEQ.ID:NO73；SEQ.ID:NO75；SEQ.ID:NO77；SEQ.ID:NO79；SEQ.ID:NO81；SEQ.ID:NO83；SEQ.ID:NO85；SEQ.ID:NO87；SEQ.ID:NO89；SEQ.ID:NO91；SEQ.ID:NO93；SEQ.ID:NO95；SEQ.ID:NO97；SEQ.ID:NO99；SEQ.ID:NO101；SEQ.ID:NO103；以及SEQ.ID:NO105编码)，如表1中进一步示出。在其中两个环结构域被修饰的本公开实施方案中，所述两个环结构域可为选自环结构域L1-L32结构域的任何两个环结构域(再次参看图1的示例性TbpB多肽)，如表2中进一步示出。在其中三个环结构域被修饰的本公开实施方案中，所述三个环结构域可为选自环结构域L1-L32结构域的任何三个环结构域(再次参看图1的示例性TbpB多肽)，如表3中进一步示出。在其中四个环结构域被修饰的本公开实施方案中，所述四个环结构域可为选自表3中示出的环的组合的任何三个环结构域加上一个选自环结构域L1-L32的额外环结构域(再次参看图1的示例性TbpB多肽)。在其它实施方案中，总计5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个环结构域可被修饰。本领域的技术人员应清楚，在本公开的这些实施方案中的每一者中，修饰的环结构域的精确数目可变化并且可选择为选自环L1-L32的任何5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个环结构域，其方式类似于关于其中已经修饰2或3个环结构域的实施方案所述的环结构域的选择。在尤其优选的实施方案中，C端半段结构域的环L18、L21、L23和L27之一或全部(如分别由胸膜肺炎放线杆菌SEQ.IDNO:76；SEQ.IDNO:82；SEQ.IDNO:86；以及SEQ.IDNO:96例示)被修饰。在进一步尤其优选的实施方案中，N端半段结构域的环L1、L5、L8和L12之一或全部(如分别由胸膜肺炎放线杆菌SEQ.IDNO:42；SEQ.IDNO:50；SEQ.IDNO:56；SEQ.IDNO:64例示)被修饰。可修饰的环结构域为连接在C端半段结构域或N端半段结构域的β筒或手柄结构域β折叠内组装的两个β链的环结构域，或连接两个组装的β链的环结构域，或前述环结构域的组合。为了截短C端半段结构域或N端半段结构域内的环结构域，所述多肽可以使得所述环结构域整体去除并且任选地用一个或多个连接的氨基酸置换的方式制备，因此在两个β链之间产生或多或少的直接连接，或以使得环结构域的一部分或多个部分去除的方式制备。据此，优选地从C端半段结构域或N端半段结构域的至少一个环结构域去除至少一半的氨基酸残基。在进一步优选实施方案中，去除所述环结构域的全部氨基酸残基的至少一半。因此，在其中环结构域包含例如40个氨基残基的所述实施方案中，将去除所述环结构域的至少20个氨基酸残基。在其它实施方案中，所述环结构域以使得所述环结构域的氨基酸残基的至少60％、70％、80％或90％去除的方式被修饰。在其它实施方案中，所述环结构域的多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸在截短之后保留，并且在其它实施方案中，所述环结构域的多达10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％在截短之后保留。在其中所述环结构域以使得所述环结构域的仅一部分去除的方式进行修饰的实施方案中，所去除的氨基酸残基可位于所述环结构域的N端，所述环结构域的C端，或N端与C端之间。在其中C端半段结构域或N端半段结构域的多个环结构域进行修饰的实施方案中，所述环减少可涉及从各环去除相同数目的氨基酸残基，例如可去除来自C端半段结构域或N端半段结构域内的各环的10个氨基酸残基，或所述环减少可涉及从各环去除不同量的氨基酸残基，例如一个环中的10个残基和另一环中的20个残基。在进一步优选实施方案中，C端半段结构域和/或N端半段结构域的环结构域内的氨基酸残基由其它基团置换，例如通过定点诱变，所得多肽包含修饰的C端半段结构域或N端半段结构域并且不能大致上结合宿主铁结合蛋白。图22提供各种TbpB多肽的N端半段结构域环区中的残基置换的实施例并且图23说明由于这些残基置换所引起的Tf结合的减少。因此，举例来说，环L1–L32中的任一者中均可置换一个或多个氨基酸残基。在某些优选实施方案中，置换N端半段结构域的环结构域L1、L3、L5或L8(如分别由胸膜肺炎放线杆菌SEQ.IDNO:42；SEQ.IDNO:46；SEQ.IDNO:50；以及SEQ.IDNO:56例示)中的一个或多个氨基酸残基。在优选实施方案中，环结构域L8内的芳族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)用脂族氨基酸(甘氨酸、缬氨酸、白氨酸、异白氨酸)置换。这些芳族氨基酸为其它情况下一般具阳离子性的表面区域中的表面可容易取得的芳族氨基酸残基。在尤其优选实施方案中，选择副猪嗜血杆菌TbpB多肽并且在所述TbpB多肽中进行以下突变中的一者或多者以获得修饰的TbpB多肽：Y93A(SEQ.IDNO:170；SEQ.IDNO:171)；Y117A(SEQ.IDNO:172；SEQ.IDNO:173)；Y167A(SEQ.ID.NO:174；SEQ.IDNO:175；)或W176A(SEQ.IDNO:176；SEQ.IDNO:177)，并且在进一步优选实施方案中，选择胸膜肺炎放线杆菌TbpB多肽并且在所述多肽中进行以下突变中的一者或多者以获得修饰的TbpB多肽：F171A(SEQ.IDNO:3；SEQ.IDNO:4)；Y95A(SEQ.IDNO:13；SEQ.IDNO:14)；Y121A(SEQ.IDNO:15；SEQ.IDNO:16)；Y174A(SEQ.IDNO:17；SEQ.IDNO:18)；或R179E(SEQ.IDNO:19；SEQ.IDNO:20)，并且在进一步优选实施方案中，选择猪放线杆菌TbpB多肽并且在所述多肽中进行以下突变中的一者或多者以获得修饰的TbpB多肽：F63A(SEQ.IDNO:29；SEQ.IDNO:30)或F152A(SEQ.IDNO:31；SEQ.IDNO:32)。本公开包括前述修饰的多肽和编码这些多肽的核酸序列以及包含这些多肽的免疫原性组合物和疫苗组合物中的每一者。根据本公开的HIBP多肽的一个或多个环结构域的尺寸的减小或环结构域中的氨基酸的修饰优选地以使得所得多肽构象稳定的方式进行。术语“构象稳定”意味着所述多肽的构象状态或构象在所述环的尺寸的修饰或氨基酸残基的置换之后保持大致上相同。修饰的环结构域的构象状态可或多或少地改变。多肽的构象状态或构象的决定子包括：如多肽的氨基酸序列中反映的多肽的一级结构、多肽的二级结构(例如α螺旋、β折叠等)、多肽的三级结构(即，多肽链的三维折叠)和四级结构(即，多肽与其它蛋白亚单位的相互作用)。蛋白构象可进一步由环境因素，如pH、摩尔渗透压浓度、离子强度和盐浓度影响。环减少的设计可通过多个异源序列的比对和比较、本领域中已知的多种异源多肽的三维构象结构的比较和保守氨基酸取代的使用(例如，如gly、ala；val、ile；leu、met；asp、glu；asn、gln；ser、thr；lys、arg；cys、met；和phe、trp、tyr的组合)来获悉。此外，蛋白的构象状态可通过功能分析(例如，宿主铁结合蛋白的结合)或通过物理方法，如X射线结晶学或核磁共振(NMR)来分析。在其它实施方案中，选择包含最长环的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域的至少一个环结构域进行修饰。在其中所述环整体进行修饰的实施方案中，这一般将涉及至少25个氨基酸残基的去除并且可导致150个氨基酸残基或更多残基的去除。在优选实施方案中，对包含C端半段结构域或N端半段结构域的最长环(即，包含最多氨基酸残基)的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域的至少一个环结构域进行修饰。在进一步优选实施方案中，对包含C端半段结构域或N端半段结构域的最长环的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域的至少一个环结构域进行修饰，并且选择包含第二长的环的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域的第二环结构域进行修饰。在进一步优选实施方案中，选择包含最长环的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域的至少一个环结构域和包含第二长的环的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域的第二环结构域进行修饰并且选择包含第三长的环的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域的第三环结构域进行修饰。在进一步优选实施方案中，选择包含最长环的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域的至少一个环结构域和包含第二长的环的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域的第二环结构域进行修饰并且选择包含第三长的环的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域的第三环结构域进行修饰，并且选择包含第四长的环的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域的第四环结构域进行修饰。前述实施方案进一步详述于关于这一点的实施例3和4中。意外地，据此已经发现大致上由HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域组成的多肽可容易地产生，例如在微生物产生系统中(当一个或多个环结构域进行修饰时)，并且修饰的多肽大致上为构象稳定的。据此，修饰的C端半段结构域或N端半段结构域多肽可本身用作免疫原，或所述多肽可经调节以包含进一步修饰。可据此对所述多肽的修饰的C端半段结构域或N端半段结构域进行的修饰包括天然或修饰的C端半段结构域或N端半段结构域多肽的N端或C端多肽延伸的制备。所述N端和C端多肽延伸包括将第二全长C端半段结构域多肽添加至所述C端半段结构域，因此提供C端半段结构域二聚体；将第二全长N端半段结构域多肽添加至所述N端半段结构域，因此提供N端半段结构域二聚体；或包含C端半段结构域多肽的一部分或N端半段结构域多肽的一部分的添加。多聚体可使用相同单体多肽(即，均二聚体、均三聚体等)组装，或其可使用不同多肽，例如由不同变体获得的C端半段结构域或N端半段结构域组装(即，杂二聚体、杂三聚体等)。在优选实施方案中，组装表示不同病原体或病原株的杂多聚体蛋白。因此，在一个优选实施方案中，制备包含选自由胸膜肺炎放线杆菌、猪放线杆菌和副猪嗜血杆菌C端半段结构域或N端半段结构域组成的组的C端半段结构域或N端半段结构域的杂多聚体多肽。在尤其优选实施方案中，所述C端半段结构域或N端半段结构域选自由胸膜肺炎放线杆菌H49、猪放线杆菌H57和胸膜肺炎放线杆菌H87C端半段结构域或N端半段结构域组成的组。在进一步优选实施方案中，制备包含选自至少两个TbpBC端半段结构域的C端半段结构域或选自脑膜炎奈瑟氏球菌株的N端半段结构域的杂多聚体多肽。在尤其优选实施方案中，所述株选自脑膜炎奈瑟氏球菌M982或脑膜炎奈瑟氏球菌B16B6。杂多聚体蛋白可向不同病原体传达免疫原性。在进一步优选实施方案中，本公开提供(i)第一多肽，所述多肽包含可获自或获自革兰氏阴性病原性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的N端半段结构域或C端半段结构域，其中所述N端半段结构域或所述C端半段结构域包含由多个环结构域连接的多个β链，并且其中所述N端半段结构域或所述C端半段结构域的多个环结构域中的至少一个环结构域已经被修饰，所述第一多肽连接于(ii)第二多肽，所述多肽包含可获自革兰氏阴性细菌物种的HIBP表面受体蛋白或其一部分。在优选实施方案中，所述HIBP表面受体蛋白的所述部分为N端半段结构域或C端半段结构域。在进一步优选实施方案中，所述HIBP表面蛋白的所述部分为可获自或获自革兰氏阴性病原性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的N端半段结构域或C端半段结构域，其中所述N端半段结构域或所述C端半段结构域包含由多个环结构域连接的多个β链，并且其中所述N端半段结构域或所述C端半段结构域的多个环结构域中的至少一个环结构域已经被修饰。在其它实施方案中，制备多聚体多肽，所述多聚体蛋白包含多个N端和C端延伸，包括将第二、第三、第四、第五、第六或第七全长C端半段结构域多肽添加至所述C端半段结构域，因此提供C端半段结构域多聚体；或将第二、第三、第四、第五、第六或第七全长N端半段结构域多肽添加至所述N端半段结构域，因此提供N端半段结构域二聚体；或包含C端半段结构域多肽的一部分或N端半段结构域多肽的一部分的添加。因此，例如，在一个实施方案中，所述C端半段结构域为可获自可获自胸膜肺炎放线杆菌、猪放线杆菌和副猪嗜血杆菌的TbpB多肽的至少两个或至少三个C端半段结构域。根据所述实施方案，编码来自胸膜肺炎放线杆菌H49(SEQ.IDNO:5)、猪放线杆菌H57(SEQ.IDNO:33)和胸膜肺炎放线杆菌H87(SEQ.IDNO:21)的TbpBC端半段结构域的核酸序列可连接以形成编码涵盖所述三个C端半段(SEQ.IDNO:6；SEQ.IDNO:34；SEQ.IDNO:22)的单一多肽(SEQ.IDNO:40)的嵌合核酸序列(SEQ.IDNO:39)。相应地，在进一步实施方案中，本公开提供(i)第一多肽，所述多肽包含可获自或获自革兰氏阴性病原性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的N端半段结构域或C端半段结构域，其中所述N端半段结构域或所述C端半段结构域包含由多个环结构域连接的多个β链，并且其中所述N端半段结构域或所述C端半段结构域的多个环结构域中的至少一个环结构域已经被修饰，所述第一多肽连接于(ii)多个多肽，各多肽包含可获自革兰氏阴性细菌物种的HIBP表面受体蛋白或其一部分。在优选实施方案中，所述HIBP表面受体蛋白的所述部分为N端半段结构域或C端半段结构域。在进一步优选实施方案中，所述HIBP表面蛋白的所述部分为可获自或获自革兰氏阴性病原性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的N端半段结构域或C端半段结构域，其中所述N端半段结构域或所述C端半段结构域包含由多个环结构域连接的多个β链，并且其中所述N端半段结构域或所述C端半段结构域的多个环结构域中的至少一个环结构域已经被修饰。在其它实施方案中，在从HIBP表面受体蛋白的C端半段或N端半段的一个或多个环结构域去除一个或多个氨基酸之后，这些残基用一个或多个替代氨基酸残基置换。在一个实施方案中，所述替代氨基酸残基包含能够在脊椎动物宿主生物体中引起免疫反应的异源多肽抗原决定子。在其它实施方案中，所述替代氨基酸残基包含能够在脊椎动物宿主生物体中引起免疫反应的两种或更多种异源多肽抗原决定子。所述异源抗原决定子可对相同或不同病原性生物体具免疫交叉反应性。因此，应清楚据此HIBP表面受体蛋白的修饰的C端半段结构域或N端半段结构域可用作骨架以产生并且提供一种或多种抗原决定子。在一个优选实施方案中，TbpB的C端半段结构域或N端半段结构域的一个或多个环区用一个或多个可获自或获自IOM蛋白的多肽部分置换，所述IOM蛋白包括转铁蛋白结合蛋白(“TbpA”)或乳铁传递蛋白结合蛋白A(“LbpA”)。可据此使用的LbpA和TbpA多肽包括SEQ.IDNO:162和SEQ.IDNO:152中示出的那些。可据此使用的LbpA和TbpA多肽的部分包括SEQ.IDNO:286和SEQ.IDNO:287中示出的那些。这些片段可用于建构嵌合核酸序列和多肽，包括SEQ.ID.NO:163；SEQ.ID.NO:164；SEQ.ID.NO:165；SEQ.ID.NO:166；SEQ.ID.NO:167；以及SEQ.ID.NO:168中示出的那些。本公开的这一实施方案进一步详述于关于这一点的实施例7和8中。在进一步优选实施方案中，TbpB的C端半段或N端半段的一个或多个环结构域用富赖氨酸多肽序列置换，如实施例9中进一步描述。在所有包含包含N端半段结构域的HIBP表面受体多肽的上文所述实施方案中，优选的是所述N端半段结构域以使得N端锚定多肽或其大部分从所述N端半段结构域去除的方式被修饰。所述锚定多肽的长度可视所述HIBP表面受体多肽而变化，但典型地介于40至75个氨基酸长的范围内，并且位于成熟HIBP多肽的N端。因此，参看图1，其中所描绘的成熟TbpB多肽的锚定多肽为43个氨基酸长。相应地，在包含包含N端半段结构域的HIBP多肽的关于这一点的优选实施方案中，所述锚定多肽的长度减少达至少10个氨基酸残基，优选地至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75个残基。在其中选择所述锚定多肽的一部分用于长度减少的实施方案中，优选地去除所述锚定多肽的N端的连续部分，例如所述锚定肽的10个末端氨基酸残基，然而也可去除所述锚定多肽的其它部分。在进一步优选实施方案中，已经截短所述锚定肽的TbpB多肽包括SEQ.IDNO:279至SEQ.IDNO:283。本公开的发明人已经发现前述实施方案尤其为所需的，因为所述锚定多肽的去除会减少修饰的HIBP表面受体多肽的聚集，从而使所述多肽更容易产生，然而不会大致上影响所述多肽的免疫原性特性。因此，HIBP多肽的这种修饰可与大致上不能大致上结合本文所示出的宿主铁结合蛋白的修饰肽中的任一者一起使用，所述修饰肽包括本文所述的包含包含修饰的环结构域的N端半段结构域或C端半段结构域的HIBP多肽，和包含其中单一氨基酸已经以使得HIBP多肽大致上不能结合宿主铁结合蛋白的方式经置换的N端半段结构域或C端半段结构域的HIBP多肽。如上文所提及，根据本公开，所述HIBP表面受体蛋白以使得其不能大致上结合宿主铁结合蛋白的方式被修饰。宿主铁结合蛋白与修饰的HIBP表面受体蛋白的结合可使用能够评估所述结合的任何化学或生物化学分析来评估，所述分析包括例如固相结合分析、亲和力捕获分析或生物物理分析。进行这些分析的一般方法为本领域的技术人员已知的并且描述于例如(12,23-25,50,51)中。通过进行这些分析，在天然HIBP表面受体蛋白与天然宿主铁结合蛋白以及修饰的HIBP表面受体蛋白与天然宿主铁结合蛋白之间的结合特征的差异可容易地确定，并且可评估一系列修饰的HIBP表面受体蛋白以便确定其是否能结合宿主铁结合蛋白。可确定不同结合特征，包括结合常数(Kd)。如上文所提及，表征宿主铁结合蛋白与本公开的修饰的HIBP表面受体蛋白之间的结合的Kd至少为表征宿主铁结合蛋白与天然HIBP表面受体蛋白之间的结合的Kd的2倍。一种使用宿主转铁蛋白确定结合常数的示例性分析方法进一步描述于关于这一点的实施例11中。本公开进一步包括一种鉴定修饰的HIBP表面受体蛋白的方法，所述方法包括：(i)提供修饰的HIBP表面受体蛋白和天然HIBP表面受体蛋白；(ii)确定所述修饰的HIBP表面受体蛋白与宿主铁结合蛋白之间的结合特征以获得所述修饰的HIBP表面受体蛋白的结合特征；(iii)确定所述天然HIBP表面受体蛋白与宿主铁结合蛋白之间的结合特征以获得天然HIBP表面受体蛋白结合特征；(iv)比较修饰的HIBP表面受体蛋白特征的结合特征与天然HIBP表面受体蛋白特征；以及(v)鉴定展现大致上相对于天然HIBP表面受体蛋白的结合特征经调节的结合特征的HIBP表面受体蛋白。如本文所用的“大致上经调节”意味着所述修饰的HIBP表面受体蛋白与宿主铁结合蛋白之间的结合相互作用力大致上比所述天然HIBP表面受体蛋白与宿主铁结合蛋白之间的结合相互作用力弱。在优选实施方案中，所用的结合特征为与HIBP表面受体蛋白与宿主铁结合蛋白之间的结合相互作用有关的Kd，其中所述修饰的HIBP表面受体蛋白与宿主铁结合蛋白之间的结合相互作用的Kd值为所述天然HIBP表面受体蛋白与宿主铁结合蛋白之间的结合相互作用的Kd的值的至少2倍。进一步应注意，前述方法可用于同时或依序筛选多种不同的候选HIBP表面受体蛋白，并且在所筛选的候选HIBP表面受体蛋白中鉴定相对于所述天然HIBP表面受体蛋白展现结合特征的或多或少显著调节的那些。本公开进一步包括一种制备用作疫苗的修饰的HIBP表面受体蛋白的方法，所述方法包括：(i)提供修饰的HIBP表面受体蛋白和天然HIBP表面受体蛋白；(ii)确定所述修饰的HIBP表面受体蛋白与宿主铁结合蛋白之间的结合特征以获得修饰的HIBP表面受体蛋白的结合特征；(iii)确定所述天然HIBP表面受体蛋白与宿主铁结合蛋白之间的结合特征以获得天然HIBP表面受体蛋白的结合特征；(iv)比较修饰的HIBP表面受体蛋白的结合特征与天然HIBP表面受体蛋白的结合特征；(v)鉴定展现大致上相对于天然HIBP表面受体蛋白的结合特征经调节的结合特征的HIBP表面受体蛋白；以及(vi)制备用作疫苗的展现大致上相对于天然HIBP表面受体蛋白的结合特征经调节的结合特征的修饰的HIBP表面受体蛋白。根据前述，所鉴定的相对于所述天然HIBP表面受体蛋白的结合特征展现大致上经调节的结合特征的HIBP表面受体蛋白可用于制备免疫原性制剂，例如通过重组产生所述HIBP表面受体蛋白，分离所述HIBP表面蛋白并且制备包含所述HIBP表面受体蛋白的疫苗制剂。在其它实施方案中，本公开包含评估抗血清针对表面受体蛋白变体的交叉反应性的方法。相应地，本公开进一步包含一种评估抗血清针对表面受体蛋白变体的交叉反应性的方法，所述方法包括：(i)提供多种编码表面受体蛋白的核酸序列；(ii)确定所述多种表面受体蛋白中的核酸序列变化；(iii)选择表面受体蛋白的变体部分；(iv)将编码所述变体表面受体蛋白的N端或C端部分的核酸序列连接于编码容易经受酶促生物素标记的肽的核酸序列和能够控制宿主细胞中的表达的核酸序列以形成嵌合核酸序列；(v)将所述嵌合核酸序列引入至宿主细胞中并且表达所述嵌合核酸序列以产生包含融合于容易经受生物素标记的肽的变体表面受体蛋白的N端或C端部分的融合多肽；(vi)从所述宿主细胞制备细胞溶解产物；(vii)将细胞提取物应用于抗生蛋白链菌素涂布的免疫分析底物材料；以及(viii)将抗血清应用于所述免疫分析底物材料，洗涤所述免疫分析底物材料并且应用标记的第二缀合物以便评估抗血清与所述表面受体蛋白的变体部分之间的交叉反应性。编码容易经受生物素标记的肽的核酸序列可另外包含充足长度的核酸序列以在表达时允许融合多肽的多肽延伸，使得所述表面受体蛋白远离所述免疫分析底物材料并且由此完全可到达抗体的结合。所述抗生蛋白链菌素涂布的免疫分析底物材料可为任何底物材料，包括例如ELISA板。在其它实施方案中，本公开包含评估抗血清、表面受体蛋白变体的交叉反应性或保护性特性的方法，所述方法包括：(i)提供多种编码表面受体蛋白的核酸序列；(ii)确定所述多种表面受体蛋白中的核酸序列变化；(iii)提供包含能够置换编码表面受体蛋白的核酸序列的反向可选择标记物的宿主细胞；(iv)PCR扩增一个或多个编码表面受体蛋白的核酸序列的多个变体部分以获得多种编码表面受体变体的PCR产物，其中PCR扩增以允许所述PCR产物整合至包含反向可选择标记物的宿主细胞中的方式进行，并且其中所述PCR产物包含独特的外来核酸序列以便允许鉴定各PCR产物；(v)在包含反向可选择标记物的宿主细胞中引入并且表达所述多种PCR产物以提供抗原性HIBP变体的文库；以及(vi)在体内或体外免疫分析中使用所述文库的全部或一部分以分析所述文库或其一部分的交叉反应性或交叉保护性特性。所述体内或体外免疫分析可为任何分析，包括任何ELISA分析、功能免疫分析或动物感染模型。在其它实施方案中，本公开包含一种评估用于预防表达表面受体蛋白变体的革兰氏阴性菌株在哺乳动物上呼吸道中的定殖的疫苗的功效的方法，所述方法包括：(i)提供(a)来自所述疫苗所针对的病原体的宿主物种的表达哺乳动物CEACAM受体的转基因小鼠系，和(b)与所述转基因小鼠系遗传同一但不表达CEACAM受体的小鼠系；(ii)证明表达变体表面受体蛋白的革兰氏阴性菌株能够在所述转基因小鼠系的上呼吸道中定殖，并且不能在不表达CEACAM受体的小鼠系的上呼吸道中定殖；(iii)确定用源于所述表面受体蛋白的抗原免疫是否导致感染表达表面受体蛋白变体的革兰氏阴性菌株的转基因小鼠中的上呼吸道中不存在定殖；(iv)确定来自用源于所述表面受体蛋白的抗原免疫的动物的抗血清的提供是否导致感染表达表面受体蛋白变体的革兰氏阴性菌株的非转基因免疫小鼠中的上呼吸道中不存在定殖(v)制备包含来自所述革兰氏阴性菌株的表面受体蛋白的部分的文库并且在动物上呼吸道定殖模型中使用所述文库来评估用表面受体变体激发的动物的上呼吸道的定殖；以及(vi)任选地，提取并且制备从用于激发动物的所述文库和/或从获自在暴露后的适当时期激发的动物的样品获得的DNA，并且确定表达不同受体变体的株的比例。一般来说，本领域的技术人员在阅读本公开后应了解，根据本公开，可制备并且获得一系列不同的经调节多肽，所述多肽均为修饰的HIBP表面受体蛋白，其中所述修饰以使得修饰的HIBP表面受体蛋白不能大致上结合宿主铁结合蛋白的方式进行。这些经调节的多肽和制备所述经调节的多肽的方法均意图包括于本文所提供的组合物和方法的范围内。修饰的C端半段结构域或N端半段结构域多肽便利地通过提供编码HIBP表面受体蛋白的核酸序列并且以使得包含所述修饰的C端半段结构域或N端半段结构域的多肽在重组宿主生物体(例如微生物细胞)中表达的方式调节所述天然核酸序列来制备。对所述核酸序列的调节可使用多种核酸修饰技术来进行，所述技术将一般为本领域的技术人员已知，包括例如定点诱变、靶向诱变、随机诱变、添加有机溶剂、基因重排或这些技术和本领域的技术人员已知的其它技术的组合，各方法均设计为以使得其中环结构域被修饰的方式靶向所述C端半段结构域或N端半段结构域的环结构域。或者，编码尺寸修饰的C端半段结构域或N端半段结构域多肽的经调节的核酸序列可使用基因合成技术从头开始制备。用于制备并且修饰核酸序列的一般技术容易由熟练技术人员获得，例如在Green和Sambrook,MolecularCloning,aLaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2012,(33)中。在本公开的其它实施方案中，提供用于制备免疫原性组合物的方法。相应地，本公开提供一种用于制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括：(a)提供包含以下各物作为可操作性连接的组分的嵌合核酸序列：(i)编码包含可获自革兰氏阴性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域的多肽的核酸序列，其中所述多肽已经以使得其不能大致上结合宿主铁结合蛋白的方式被修饰；和(ii)能够控制重组宿主细胞中的表达的核酸序列；(b)将所述嵌合核酸序列引入至宿主细胞中并且使所述宿主细胞生长以产生所述包含所述C端半段结构域或N端半段结构域的多肽；(c)从所述宿主细胞回收所述包含C端半段结构域或N端半段结构域的多肽；以及(d)制备免疫原性组合物在某些实施方案中，所述C端半段结构域或N端半段结构域包含由多个环结构域连接的多个β链，并且其中所述多个环结构域中的至少一个环结构域已经被修饰，并且其中所述多肽已经以使得其不能大致上结合宿主铁结合蛋白的方式被修饰。在进一步优选实施方案中，本公开提供一种用于制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括：(a)提供包含以下各物作为可操作性连接的组分的嵌合核酸序列：(i)编码多肽的第一核酸序列，所述多肽包含可获自革兰氏阴性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的第一C端半段结构域或第一N端半段结构域；(ii)编码多肽的第二核酸序列，所述多肽包含可获自革兰氏阴性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的第二C端半段结构域或第二N端半段结构域；以及(iii)能够控制重组宿主细胞中的表达的核酸序列；(b)将所述嵌合核酸序列引入至宿主细胞中并且使所述宿主细胞生长以产生包含第一和第二C端半段结构域或第一和第二N端半段结构域的多肽；(c)从所述宿主细胞回收所述包含第一和第二C端半段结构域或第一和第二N端半段结构域的多肽；以及(d)制备免疫原性组合物。在优选实施方案中，所述第一和第二核酸以使得产生包含第一和第二C端半段结构域或第一和第二N端半段结构域的杂多聚体融合多肽的方式可操作性连接，并且其中所述杂多聚体融合多肽不能大致上结合宿主铁结合蛋白。据此，编码所述HIBP表面受体蛋白的核酸序列连接于能够控制宿主细胞中所述HIBP表面受体蛋白的表达的核酸序列。相应地，本公开还提供一种连接于能够控制宿主细胞中的表达的启动子的编码HIBP表面受体蛋白的核酸序列。可用于本文中的能够控制宿主细胞中的表达的核酸序列包括能够控制宿主细胞中多肽的表达的任何转录启动子。一般来说，当据此选择细菌宿主时使用获自细菌细胞的启动子，而当选择真菌宿主时将使用真菌启动子，当选择植物细胞时将使用植物启动子，等等。能够控制宿主细胞中的表达的其它核酸元件包括转录终止子、增强子等，其均可包括于本公开的嵌合核酸序列中。根据本公开，包含连接于编码包含可获自革兰氏阴性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域的多肽的核酸序列的能够控制宿主细胞中的表达的启动子的嵌合核酸序列可整合至确保宿主细胞中的良好表达的重组表达载体中，其中所述C端半段结构域或N端半段结构域包含由多个环结构域连接的多个β链，并且其中所述多个环结构域中的至少一个环结构域已经被修饰。相应地，本公开包括一种重组表达载体，所述载体包含以下各物作为可操作性连接的组分：(i)能够控制宿主细胞中的表达的核酸序列；和(ii)编码包含可获自或获自革兰氏阴性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域的多肽的核酸序列，其中所述多肽已经以使得其不能大致上结合宿主铁结合蛋白的方式被修饰。其中所述表达载体适用于宿主细胞中的表达。术语“适用于宿主细胞中的表达”意味着所述重组表达载体包含连接于实现宿主细胞中的表达所需的遗传元件的本公开的嵌合核酸序列。关于这方面可包括于表达载体中的遗传元件包括转录终止区、一个或多个编码标记基因的核酸序列、一个或多个复制起点等。典型地，本领域的技术人员还已知，所述遗传元件通过将例如呈5’至3’转录方向的启动子连接于编码序列而经可操作性连接。在优选实施方案中，所述表达载体进一步包含将所述载体或其一部分整合于宿主细胞的基因组中所需的遗传元件。在其它实施方案中，所述C端半段结构域或N端半段结构域包含由多个环结构域连接的多个β链，并且其中所述多个环结构域中的至少一个环结构域已经被修饰。根据本公开，所述表达载体可进一步含有标记基因。可根据本公开使用的标记基因包括使转化细胞不同于非转化细胞的所有基因，包括所有可选择和可筛选标记基因。标记基因可为抗性标记物，如针对例如卡那霉素或氨苄青霉素的抗生素抗性标记物。可用于通过目视检查鉴定转化体的可筛选标记物包括β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶(GUS)(美国专利号5,268,463和5,599,670)和绿色荧光蛋白(GFP)(52)。一种可尤其便利地使用的宿主细胞为大肠杆菌。大肠杆菌载体的制备可使用通常已知的技术来实现，所述技术如限制消化、接合、接合独立性克隆、凝胶电泳、DNA测序、聚合酶链反应(PCR)和其它方法。多种克隆载体可用于执行制备包括本发明人已经开发的定制载体的重组表达载体所需的必要步骤。如pUC或pET系列的载体等载体处于具有在大肠杆菌中具功能性的复制系统的载体之中。典型地，这些克隆载体含有允许转化细胞的选择的标记物。核酸序列可引入这些载体中，并且所述载体可通过制备感受态细胞、电穿孔或使用本领域的技术人员众所周知的其它方法引入大肠杆菌中。大肠杆菌可在如Luria-Broth培养基的适当培养基生长并且加以收集。重组表达载体可容易在收集和溶解细胞时从细胞回收。此外，关于重组载体的制备和重组生物体的生长的一般指导可发现于例如：Sambrook等人,MolecularCloning,aLaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001,第3版(33)中。重组蛋白的产生可发生在大肠杆菌株的整个生长中，优选地通过在生长期之后诱导表达以实现显著生物量。这将导致包含C端半段结构域或N端半段结构域或具有修饰的环的C端半段结构域或N端半段结构域的多肽的产生。所述多肽随后可通过多种不同蛋白纯化技术从其它宿主细胞组分回收、分离并且分开，所述纯化技术包括例如金属螯合物色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、疏水性相互作用色谱法、逆相色谱法、凝胶过滤等。关于蛋白纯化的其它一般指导可例如发现于：ProteinPurification:Principles,HighResolutionMethods,andApplications(53)中。如本文所用的术语“回收”意味着所述多肽以或多或少的纯形式获得。在优选实施方案中，可据此获得包含可获自革兰氏阴性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域的大致免疫原性多肽，其中所述C端半段结构域或N端半段结构域包含由多个环结构域连接的多个β链，并且其中所述多个环结构域中的至少一个环结构域已经被修饰。因此，据此获得的HIBP多肽可以大致上纯形式制备。“大致上纯”意味着所述免疫原性蛋白与其它宿主细胞组分分开。据此，所述免疫原性蛋白为至少95％纯，并且更优选地至少96％、97％、98％或99％纯。或者，可获得包含所述HIBP多肽的相对粗组分，例如含有所述多肽的细胞、含有所述多肽的细胞溶解产物或含有所述多肽的细胞组分。在其它实施方案中，本公开提供用于在脊椎动物受试者中引起免疫反应的方法。所述免疫反应可通过递送所述免疫原性蛋白或通过递送包含编码所述免疫原性蛋白的核酸序列的表达载体而引起。相应地，本公开进一步提供一种用于在脊椎动物受试者中引起免疫反应的方法，所述方法包括向所述受试者施用：(a)包含多肽的免疫原，所述多肽包含可获自革兰氏阴性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域，其中多肽不能大致上结合宿主铁结合蛋白；或(b)包含编码包含多肽的免疫原的核酸序列的表达载体，所述多肽包含可获自革兰氏阴性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域，其中所述多肽不能大致上结合宿主铁结合蛋白；以及其中所述免疫原以足以在所述脊椎动物受试者中引起免疫反应的量施用或表达。本公开还提供一种以下各物用于在脊椎动物受试者中引起免疫反应的用途：(a)包含多肽的免疫原，所述多肽包含可获自革兰氏阴性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域，其中多肽不能大致上结合宿主铁结合蛋白；或(b)包含编码包含多肽的免疫原的核酸序列的表达载体，所述多肽包含可获自革兰氏阴性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域，其中所述多肽不能大致上结合宿主铁结合蛋白。本公开进一步提供一种以下各物在制造用于在脊椎动物受试者中引起免疫反应的药物中的用途：(a)包含多肽的免疫原，所述多肽包含可获自革兰氏阴性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域，其中多肽不能大致上结合宿主铁结合蛋白；或(b)包含编码包含多肽的免疫原的核酸序列的表达载体，所述多肽包含可获自革兰氏阴性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域，其中所述多肽不能大致上结合宿主铁结合蛋白。本公开还提供用于在脊椎动物受试者中引起免疫反应的以下各物：(a)包含多肽的免疫原，所述多肽包含可获自革兰氏阴性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域，其中多肽不能大致上结合宿主铁结合蛋白；或(b)包含编码包含多肽的免疫原的核酸序列的表达载体，所述多肽包含可获自革兰氏阴性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域，其中所述多肽不能大致上结合宿主铁结合蛋白。在优选实施方案中，所述多肽包含至少两个C端半段结构域或至少两个N端半段结构域。在进一步优选实施方案中，所述多肽包含至少三个C端半段结构域或至少三个N端半段结构域。在某些实施方案中，所述C端半段结构域或N端半段结构域包含由多个环结构域连接的多个β链，并且其中所述多个环结构域中的至少一个环结构域已经以使得所述C端半段结构域或N端半段结构域不能大致上结合宿主铁结合蛋白的方式被修饰。本公开进一步包括一种用作药物的包含HIBP表面受体多肽的C端半段结构域或N端半段结构域的免疫原，其中所述C端半段结构域或所述N端半段结构域包含由多个环结构域连接的多个β链，并且其中至少一个环结构域已经被修饰。本公开进一步包括一种包含HIBP表面受体多肽的C端半段结构域或N端半段结构域的免疫原，其中所述C端半段结构域或所述N端半段结构域包含由多个环结构域连接的多个β链，并且其中至少一个环结构域已经被修饰，所述免疫原用于预防由传染性革兰氏阴性细菌引起的感染或疾病，所述细菌包括属于放线杆菌属、奈瑟氏球菌属、嗜血杆菌属、曼氏杆菌属、嗜组织菌属、巴斯德菌属或莫拉氏菌属的细菌。本公开进一步包括一种包含HIBP表面受体多肽的C端半段结构域或N端半段结构域的免疫原，其中所述C端半段结构域或所述N端半段结构域包含由多个环结构域连接的多个β链，并且其中至少一个环结构域已经被修饰，所述免疫原用于制造用于预防由传染性革兰氏阴性细菌引起的感染或疾病的药物，所述细菌包括属于放线杆菌属、奈瑟氏球菌属、嗜血杆菌属、曼氏杆菌属、嗜组织菌属、巴斯德菌属或莫拉氏菌属的细菌。疫苗制剂本公开进一步提供疫苗制剂。因此，本公开进一步提供一种包含源于来自革兰氏阴性病原性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的抗原的疫苗组合物，其中所述源于HIBP表面受体蛋白的蛋白已经以使得其不能大致上结合宿主铁结合蛋白的方式被修饰。本公开的疫苗组合物优选地包含包含多肽的疫苗，所述多肽包含可获自革兰氏阴性病原性细菌物种的HIBP表面受体蛋白、HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域，其中所述多肽以使得其不能大致上结合宿主铁结合蛋白的方式被修饰。在优选实施方案中，所述疫苗制剂包含属于两种不同细菌物种或两种不同菌株的C端半段结构域的混合物。在进一步优选实施方案中，所述多肽包含至少两个或至少三个N端半段结构域或C端半段结构域。在进一步优选实施方案中，所述至少两个或至少三个N端半段结构域或C端半段结构域形成杂多聚体。在其它实施方案中，所述C端半段结构域或N端半段结构域包含由多个环结构域连接的多个β链，并且其中所述多个环结构域中的至少一个环结构域已经被修饰。本公开的疫苗制剂包含呈或多或少的纯形式的免疫原性HIBP多肽。因此，据此，可获得大致上纯的HIBP多肽并且用于制备疫苗制剂。在其它实施方案中，可获得更粗的HIBP多肽制剂并且用于制备疫苗制剂。因此，例如，在所述实施方案中，包含所述HIBP多肽的细胞、细胞溶解产物或细胞组分可用于制备疫苗制剂。为了增大受试者中的免疫反应，本文所提供的组合物进一步优选地包括佐剂，如药理学试剂、细胞因子等。合适的佐剂包括增强所述受试者对本公开的免疫原性多肽的免疫反应的任何物质。佐剂的非限制性实例包括细胞因子，例如IL-1、IL-2、IL-12、IL-6，并且进一步包括无机盐，例如氢氧化铝、磷酸铝和磷酸钙；油乳液，例如矿物油、MF59、QS-21、MontamideISA51和ISA-720；Isocom，例如ISCOMATRIX；微生物衍生物，例如MPLA、巨噬细胞激活蛋白-2、病毒颗粒、LT/CT、CpG；天然聚合物，例如多糖；和合成聚合物，例如聚酐和聚酯，如Wilson-Welder等人所回顾(54)。佐剂可例如作为蛋白或其它大分子与多肽抗原的施用同时、在肽抗原的施用之前或之后施用。免疫原性蛋白的剂量针对人类受试者一般介于约0.1μg至约20mg、优选地10μg至约3mg范围内。然而，精确量必要时将视待治疗的受试者的年龄和一般状态、所治疗的病况的严重性、所递送的特定制剂、施用位点以及其它因素而变化。适当治疗有效量可容易地由本领域的技术人员确定。因此，本发明组合物的“治疗有效量”将为足以引起疾病或病况症状的治疗或预防或足以预防病原性细菌的定殖的量，并且将属于可通过常规试验确定的相对广泛范围内。包含本公开的免疫原性组合物的疫苗制剂优选地进一步包含媒介物、赋形剂和可存在于赋形剂或媒介物中的辅助物质，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等。这些媒介物、赋形剂和辅助物质一般为不会在受试者中诱导免疫反应的医药剂，并且可无不当毒性加以施用。药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体，如水、生理盐水、聚乙二醇、透明质酸、甘油和乙醇。药学上可接受的盐也可包括于其中，例如无机酸盐，如盐酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸的盐，如乙酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐等。尽管非所需，但还优选所述制剂将含有用作稳定剂的药学上可接受的赋形剂，尤其为了稳定化本公开的多肽。还用作肽的稳定剂的合适载体的实例包括不限于医药级的右旋糖、蔗糖、乳糖、山梨醇、肌醇、葡聚糖等。其它合适载体还包括不限于淀粉、纤维素、磷酸钠或磷酸钙、柠檬酸、甘氨酸、聚乙二醇(PEG)和其组合。本公开的疫苗制剂可用于预防由传染性革兰氏阴性细菌引起的感染或疾病，所述细菌包括不限于属于放线杆菌属、奈瑟氏球菌属、嗜血杆菌属、曼氏杆菌属、嗜组织菌属、巴斯德菌属或莫拉氏菌属的细菌，包括但不限于胸膜肺炎放线杆菌、猪放线杆菌、副猪嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏球菌。所述疫苗制剂可用于免疫任何脊椎动物受试者，包括表达宿主铁结合蛋白的任何脊椎动物受试者并且包括不限于任何哺乳动物受试者，包括任何人类受试者、猪受试者、牛受试者、马受试者、绵羊受试者、山羊受试者、犬受试者、猫受试者、野兔受试者并且进一步包括任何反刍动物受试者和鼠受试者。可免疫的其它脊椎动物受试者包括任何禽受试者和鱼受试者。本公开的疫苗制剂可在接受宿主生物体中展现增强的交叉反应性和/或交叉保护性免疫反应。应进一步注意，本公开的疫苗制剂可预防由传染性革兰氏阴性细菌引起的感染和/或定殖，包括脊椎动物受试者的呼吸道或生殖道的细菌定殖。本公开进一步包括一种包含HIPB表面受体蛋白、HIBP表面受体多肽的C端半段结构域或N端半段结构域的疫苗，其中所述C端半段结构域或所述N端半段结构域包含由多个环结构域连接的多个β链，并且其中至少一个环结构域已经被修饰，所述疫苗用于预防由传染性革兰氏阴性细菌引起的感染或疾病，所述细菌包括属于放线杆菌属、奈瑟氏球菌属、嗜血杆菌属、曼氏杆菌属、嗜组织菌属、巴斯德菌属或莫拉氏菌属的细菌。测试疫苗制剂据此，本公开的疫苗制剂的功效可例如通过确定存在于用疫苗制剂免疫的受试者的血清中的抗体效价，例如通过执行酶联免疫吸附分析(ELISA)来评估。相应地，本公开进一步包含一种用于评估疫苗制剂的功效的方法，所述疫苗制剂包含可获自革兰氏阴性病原性细菌物种的HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域，其中所述多肽以使得其不能大致上结合宿主铁结合蛋白的方式被修饰，所述方法包括：(a)向脊椎动物受试者施用包含可获自革兰氏阴性病原性细菌物种的HIPB表面受体蛋白或HIBP表面受体蛋白的C端半段结构域或N端半段结构域的疫苗制剂，其中所述多肽以使得其不能大致上结合宿主铁结合蛋白的方式被修饰；(b)从所述脊椎动物受试者获得血清；以及(c)分析所述血清中针对所述HIBP表面受体多肽的抗体的存在。所述脊椎动物血清可在施用单一或多个(例如2、3或4个)剂量的疫苗制剂后进行分析。可使用来自单一或多种微生物不同株或物种的HIBP表面受体蛋白分离株执行分析，如ELISA分析。ELISA分析可涉及将所述HIBP表面受体多肽连接于载体蛋白，如麦芽糖结合蛋白。在分析针对多种HIBP表面受体蛋白分离株的抗体的反应性时，有可能评估所述疫苗制剂的交叉反应性。疫苗接种方案如本领域的技术人员鉴于本说明书的教导显而易知，使用上述多肽或使用编码所述多肽的核酸序列(DNA疫苗)的疫苗接种可以一个剂量在治疗过程中连续地或间歇地进行。确定施用的最有效方式和剂量的方法为本领域的技术人员众所周知的并且将随着递送载体、组合物的性质、所探寻的具体预防或疗法、靶标细胞和所治疗的受试者变化。单一和多次施用可以合适的医疗人员所选择的剂量水平和模式进行。上述医药制剂的施用可以一个剂量在治疗过程中连续地或间歇地进行。递送将最典型地经由针对液体组合物和针对含有微粒组合物的液体混悬液的常规针和注射器。另外，各种液体喷射注射器为本领域中已知的并且可用于施用本发明组合物。疫苗递送途径可变化。因此，本公开的疫苗可静脉内、皮下、肌肉内、阴道内、腹膜内、鼻内、口服或经由其它粘膜途径递送。确定施用的最有效方式和剂量的方法为本领域的技术人员众所周知的并且将随着递送媒介物、疗法的组合物、靶标细胞和所治疗的受试者变化。单一和多次施用可以主治医师或兽医所选择的剂量水平和模式进行。实施例以下为用于进行本公开的具体实施方案的实施例。所述实施例仅为了说明性目的提供，并且不意图以任何方式限制本公开的范围。实施例1-使用TbpBC端半段结构域、TbpBN端半段结构域和其混合物的免疫反应。这一实施例提供使用TbpB受体蛋白的子结构域来获得更需要的免疫反应的价值的说明。关于更需要的免疫反应的意思，我们考虑抗体反应的量值和抗体与变体TbpB蛋白的交叉反应性。图3A说明针对这一实施例的第一个实验的结果，其中不同宿主物种(小鼠、兔和猪)用来自人类病原体脑膜炎奈瑟氏球菌(株B16B6-SEQ.IDNO:117)或来自猪病原体胸膜肺炎放线杆菌(株H49-SEQ.IDNO:2)的完整TbpB免疫。来自免疫的动物的血清在我们的定制ELISA分析(参看下文)中针对免疫抗原进行测试。结果说明与来自人类病原体脑膜炎奈瑟氏球菌的TbpB(黑色条)相比，在使用来自猪病原体胸膜肺炎放线杆菌的TbpB(灰色条)的猪中的抗体反应的量值(效价)大致上低于其它宿主物种中，表明宿主转铁蛋白的结合影响针对TbpB的抗体反应的发展。第二个实验(图3B)涉及用来自牛病原体溶血性曼氏杆菌(株H196–SEQ.IDNO:206)的完整TbpB或来自猪病原体胸膜肺炎放线杆菌(株H49)的完整TbpB(SEQ.IDNO:2)、TbpBN端半段(SEQ.IDNO:8)或TbpBC端半段(SEQ.IDNO:6)使猪免疫。图3B说明在免疫之前(白色条)、在第一次免疫之后(浅灰色条)、在第二次免疫之后(深灰色条)和在第三次免疫之后(黑色条)个别猪中的免疫反应(条束)。应注意，效价表述为二进制对数以反映用于评估效价的两倍稀释。大多数猪在第三次免疫之后呈现高抗体效价(在26,000与256,000之间)，但数只用来自胸膜肺炎放线杆菌的完整TbpB或TbpBN端半段免疫的猪呈现大致上降低的效价(在5,300与8,000之间)。四只用完整TbpB免疫的猪中的两只和三只用TbpBN端半段免疫的猪呈现大致上降低的效价的观察结果表明宿主转铁蛋白的结合仅在所述动物的子集中影响抗体反应的发展。这一实施例中所说明的第三次实验(图3C)是设计为评估对抗完整TbpB和其子结构域的血清与来自猪病原体的不同代表性TbpB反应的能力以便评估所述抗血清的交叉反应性。猪用完整TbpB(SEQ.IDNO:2)、TbpBC端半段结构域(SEQ.IDNO:6)、TbpBN端半段结构域(SEQ.IDNO:8)或TbpBN端半段和TbpBC端半段的混合物免疫。所述血清针对(i)来自胸膜肺炎放线杆菌株H49的完整TbpB(SEQ.IDNO:2)、(ii)来自副猪嗜血杆菌株HP5的完整TbpB(SEQ.IDNO:115)或(iii)来自胸膜肺炎放线杆菌株H87的完整TbpB(SEQ.IDNO:12)进行测试。图3C中的结果说明来自胸膜肺炎放线杆菌株H49的TbpBC端半段结构域诱导比完整TbpB(针对来自株H87的异源TbpB的更高效价)或TbpBN端半段(针对株H87和HP5的更高效价)更具交叉反应性的免疫反应。这一分析中所用的TbpB是设计为表示存在于来自全世界的猪的胸膜肺炎放线杆菌、猪放线杆菌和副猪嗜血杆菌的临床疾病分离株中的总体序列和结构多样性(SEQ.IDNO:2；SEQ.IDNO:12；SEQ.IDNO:28；以及SEQ.IDNO:107至SEQ.IDNO:115)(图4)。因此，在这一实施例中，我们并未将我们的分析限于单一猪病原体，而是靶向在全世界猪产业中具有问题的三种不同的猪病原体。这些病原体共享用于从宿主获得铁的通用机制的事实提供了开发靶向来自共同抗原TbpB的三种病原体的疫苗的独特机会。这些结果指示通过使用一个或多个C端半段结构域作为抗原，产生针对全世界猪病原体的广泛交叉反应性反应并且因此可能考虑疫苗接种来消除这些病原体在全球的存在是切实可行的。意外地，由所述C端半段结构域诱导的增强的交叉反应性即使在所述C端半段与所述N端半段在免疫混合物中混合时(图3C，“N+C端半段”)也保留。这些结果教导我们，具有较小可变环区的抗原(与“N端半段”相比的“C端半段”，图1)能够诱导更具交叉反应性的抗体反应，并且这一增强的诱导交叉反应性免疫反应的能力即使在所述C端半段与其它抗原在免疫混合物中组合时也保留。更具体说来，这些结果指示所述N端半段产生更具株特异性的免疫反应的趋势仅能够在所述C端半段物理连接于所述N端半段时有效地抑制由所述C端半段诱导交叉反应性免疫反应。换句话说，意外地，所述N端半段产生更具特异性的免疫反应的倾向在所述N端半段与所述C端半段混合时大致上降低。就我们所知，先前尚未描述这种现象。所述结果还表明相对于所述C端半段，存在降低的针对完整TbpB和TbpBN端半段的反应(图3B、3C)，这可能指示宿主转铁蛋白的结合(仅存在于完整TbpB和TbpBN端半段中的特征)可调节猪中的免疫反应。重要的是提到与先前公开的研究形成对比，我们并未使用用于测量抗体水平的标准ELISA方法，因为我们鉴定出所述标准ELISA方法中的主要缺陷。我们观察到与通常所假定形成对比，纯化的蛋白不必要随机结合于ELISA板，从而潜在地在评估抗体与所述蛋白的表面上的表位的结合时提供重大偏差或缺陷。尤其是我们注意到，TbpB并且特别是TbpB的N端半段基本上以一个取向结合于ELISA板的固体表面，从而遮蔽所述N端半段的帽区，使得无法检测到转铁蛋白的结合(图5)。相比之下，具有N端麦芽糖结合蛋白(Mbp)伴侣的重组融合蛋白常用于转铁蛋白结合(图5)，所述伴侣为用于纯化的TbpBN端半段的前体。用来自人类、猪和牛病原体的TbpBN端半段并且在较小程度上用完整TbpB观察到这种现象。由于这些蛋白的序列极其不同(<30％总体序列同一性)，其指示这并非具体蛋白的独特特性，而是非随机结合可以变化的程度影响固相结合分析。为了克服这种缺陷，我们设计了一种借助于生物素残基使重组蛋白结合于抗生蛋白链菌素涂布的ELISA板的方法，所述生物素残基在细胞质中的蛋白表达期间酶促添加至N端。如图5中所示，酶促生物素标记的N端肽的添加恢复了所述TbpBN端半段结合转铁蛋白的能力。这种方法可更有效地暴露转铁蛋白结合区，与使用融合于Mbp的TbpN端半段的结果形成对比，如本图的左侧和右侧所指示。这种新型并且新颖的ELISA分析格式用于所有用于监测抗体反应性的我们的ELISA分析中，因为其确保完全并且相等接近靶标蛋白上的所有表位，因此在评估交叉反应性程度时提供真实比较。用于免疫实验的重组抗原使用编码N端聚组氨酸标签、麦芽糖结合蛋白和烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶裂解位点的定制T7表达载体在大肠杆菌的细胞质中产生。所述重组融合蛋白通过Ni-NTA色谱法分离，所述抗原通过(TEV)裂解释放并且通过Ni-NTA和Q-琼脂糖色谱法的组合纯化。FVB小鼠(来自CharlesRiver的白化体MHC单倍体H2q)、3月龄新西兰白兔和51日龄LargeWhiteLandraceF1杂交猪用于图3A中的免疫实验。纯化的重组蛋白与磷酸盐缓冲生理盐水和33％(图3A)或20％(图3B、图3C)EmulsigenD(MVPTechnologies)混合至25μg/0.1ml(小鼠)、50μg/0.5ml(兔)和100μg/2ml(猪)的最终浓度。三种注射液针对小鼠和兔皮下施用并且针对猪皮下(图3A)或肌肉内(图3B、图3C)施用。所述动物在第0、21、42天免疫并且在第56天收集最终血液。在第8周获取的血清在我们的定制固相ELISA分析中针对代表性蛋白进行测试。用于ELISA分析的重组融合蛋白使用编码N端优化的生物素标记序列、聚组氨酸标签、麦芽糖结合蛋白和烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶裂解位点的定制T7表达载体在大肠杆菌的细胞质中产生。这些蛋白在所述N端生物素标记序列处进行体内生物素标记，使得其可能应用于抗生蛋白链菌素涂布的ELISA板。基于先前的优化实验，来自使用用于生物素标记的融合蛋白的表达载体的小规模过夜蛋白表达实验的粗提取物足以使所述ELISA板饱和。所关注的抗血清的稀释液在磷酸盐缓冲生理盐水(PBST)中的2.5％脱脂乳中制备并且在室温下应用于所述板持续1小时。在去除和洗涤之后，在室温下通过HRP缀合的山羊抗小鼠、抗兔或抗猪IgG在1:100,000的稀释度下(关于抗猪为1:25,000)检测原发抗体持续1小时。效价表述为在A450>0.3下最后稀释度的倒数(大于平均值加上未添加血清的孔的背景读数的三个标准差)。经由ANOVA进行SEM误差的计算，其中进行TukeysHSD(真实显著性差异)测试作为事后测试。统计学显示关于所有血清，H49显著不同于H87并且所述N端半段显著不同于所述C端半段或N+C端半段。图3C中所示的星号表示与针对H49测试的C端半段或N+C端半段显著不同的特异性免疫/蛋白对。实施例2-猪病原体TbpBC端半段的三聚体的产生在这一实施例中，我们证明了表示存在于三种猪病原体中的TbpB的广泛多样性的三种重组工程改造的C端半段可连接在一起并且保持抗原性。此处所使用的工程改造的C端半段为获自胸膜肺炎放线杆菌、猪放线杆菌和副猪嗜血杆菌的那些(图4)。因此，编码来自株胸膜肺炎放线杆菌H49(SEQ.IDNO:6)、猪放线杆菌H57(SEQ.IDNO:35)和胸膜肺炎放线杆菌H87(SEQ.IDNO:22)的TbpBC端半段的基因连接形成编码图6的图A中的涵盖三种C端半段的单一多肽(SEQ.IDNO:40)的基因。在这种C端半段三聚体中存在连接所述C端半段的二级结构元件的相对短肽(由下划线指示)。所述连接肽由来自个别C端半段结构域的可信半段间序列组成。图6的图B说明了所述C段半段三聚体的产生并且与来自人类病原体脑膜炎奈瑟氏球菌株M982的重组工程改造的TbpBN端半段和C端半段的制剂相比。结果指示所述C段半段三聚体以良好质量产生并且为稳定的。然而，图6中说明的制剂在用于免疫实验之前需要额外纯化。由于稳定C端半段三聚体的产生并无主要屏障，所述C端半段三聚体产生并且纯化用于免疫实验以确定其是否保留免疫原性。如图7中所说明，所述C端半段三聚体能够诱导针对所述三种代表性TbpB的免疫反应，指示所述三种个别C端半段连接在一起不会大致上改变其免疫特性。结果还表明单一蛋白抗原可能够诱导能够与大多数(如果非所有)胸膜肺炎放线杆菌、猪放线杆菌和副猪嗜血杆菌猪病原体株反应的免疫反应，显示开发广泛交叉保护性猪疫苗的潜在希望。实施例3-胸膜肺炎放线杆菌TbpB的N端半段中的环区的减少在这一实施例中，来自猪病原体的三种代表性TbpB的N端半段结构域的环区被修饰以便确定其对交叉反应性免疫反应的诱导的影响。所述三种代表性TbpB来自猪放线杆菌株H57(SEQ.IDNO:28)、胸膜肺炎放线杆菌株H87(SEQ.IDNO:12)和胸膜肺炎放线杆菌株H49(SEQ.IDNO:2)。选择这些特定TbpB除了因为表示序列多样性以外，还因为可获得高分辨率结构数据；猪放线杆菌株H57(3PQU.pdb)、胸膜肺炎放线杆菌株H87(3PQS.pdb)和胸膜肺炎放线杆菌株H49(3HOL.pdb)。环减少过程导致关于来自猪放线杆菌株H57(SEQ.IDNO:36,38)的TbpBN端半段存在74个氨基酸(297-224)的总体损失，关于来自胸膜肺炎放线杆菌株H87(SEQ.IDNO:24,26)的TbpBN端半段存在45个氨基酸(248-203)的总体损失并且关于来自胸膜肺炎放线杆菌株H49(SEQ.IDNO:8,10)的TbpBN端半段存在27个氨基酸(274-247)的总体损失。关于胸膜肺炎放线杆菌株H49的环减少的设计出于说明性目的更详细描述于下文中。为了设计环减少，使来自株H49(3HOL.pdb)的TbpB的结构与来自株H87(3PQS.pdb)的TbpB的结构重叠，同时检视来自猪病原体的代表性TbpB的集合的多序列比对。通过检查结构和变化区域，鉴定数个针对潜在环减少的区域，所述区域经预测不扰乱所述N端半段的总体结构。这些区域包括根据标准命名法的环1、5、8a、8c和12(图2)，并且在图8中在所述TbpBN端半段的侧视图(图A)和顶视图(图B)的结构模型上加以说明。环减少是设计为除了去除氨基酸以外还通过在需要时选择适当氨基酸置换使对所述N端半段的总体折叠和结构的潜在扰乱减至最少。初始N端半段(顶部序列)和修饰的N端半段(底部序列)的氨基酸序列在图8图C中以序列比对加以说明，其中所述环区以灰色突出显示并且以灰色字体标记。编码图C中所说明的氨基酸序列的DNA序列针对大肠杆菌株中的表达加以优化并且接着进行合成。采用类似策略来产生针对来自胸膜肺炎放线杆菌株H87和猪放线杆菌株H57的TbpBN端半段的环减少，因为其表示来自猪病原体的TbpB的显著序列和结构多样性(图4)并且可获得相关结构(3PQS.pdb和3PQU.pdb)(12)。产生合起来可能诱导针对大多数(如果非全部)临床分离株的N端半段区的交叉反应性反应的工程改造的抗原的潜能将具有显著的用于增强靶向所述三种猪病原体的疫苗的有效性的潜能。所得基因克隆至编码N端聚组氨酸区、麦芽糖结合蛋白和在克隆的N端半段的编码序列之前的TEV(烟草蚀纹病毒)裂解位点的定制表达载体中。用于来自胸膜肺炎放线杆菌株H49的TbpBN端半段的工程改造的形式的表达质粒转化至携带插入lacZ启动子下游的T7RNA聚合酶基因的染色体拷贝的大肠杆菌表达株ER256中。使用利用lac启动子的葡萄糖抑制和乳糖诱导的自动诱导介质(55)执行小规模表达分析。因此，通过使用进入所述介质中的葡萄糖与乳糖的具体比率，最优地在对数生长中期起始所述T7RNA聚合酶的表达。细胞在过夜生长后用珠磨器溶解以溶解细胞，重组蛋白用Ni-NTA树脂或猪Tf-琼脂糖树脂捕获，洗涤并且结合的蛋白在SDS-PAGE缓冲液中洗脱。如图9中所说明，来自胸膜肺炎放线杆菌株H49、猪放线杆菌株H57或胸膜肺炎放线杆菌株H87的TbpBN端半段的环减少导致产生稳定蛋白，因此不干扰所述N端半段的总体折叠，并且提供适用于免疫的材料。上部图显示在Ni-NTA树脂上捕获的在小规模表达实验中产生的重组蛋白，其中野生型完整TbpB和TbpBN端半段作为对照。结果还显示不同于所述野生型蛋白，突变型蛋白不再能够大致上结合于猪转铁蛋白(Tf)。因此，在中间图中，工程改造的N端半段未由猪Tf–琼脂糖捕获。在底部图中，顶部图中所说明的材料用于使用HRP缀合的猪转铁蛋白的固相结合分析中并且不同于所述对照，工程改造的N端半段不呈现任何结合活性。我们预期在天然宿主猪中将存在这些蛋白的增强的免疫原性。因此，这一实施例显示用于去除TbpB蛋白的N端半段中的抗原性可变区的策略为切实可行的并且所述去除可导致增强的免疫原性。实施例4-脑膜炎奈瑟氏球菌TbpB的C端半段的交叉反应性这一实施例说明了根据本公开的来自人类病原体脑膜炎奈瑟氏球菌的TbpB的工程改造的衍生物的用途。作为第一步骤，我们检查了来自脑膜炎奈瑟氏球菌的TbpB的多样性并且确保我们将具有TbpB的代表性集合用于我们评估交叉反应性。图10说明在一段长时期内从全球收集的脑膜炎奈瑟氏球菌株中的TbpB的总体多样性加上来自奈瑟氏球菌细菌分离株基因组序列数据库(BIGSDBhttp://pubmlst.org/neisseria/)的额外序列(56)(41)。关于来自由图10A中的箭头、双箭头或线指示的株的TbpB的代表性集合的序列(SEQ.IDNO:117；SEQ.IDNO:123；SEQ.IDNO:132至SEQ.IDNO:147；SEQ.IDNO:177；以及SEQ.IDNO:178)包括于本申请中以定义各组中的序列多样性。存在脑膜炎奈瑟氏球菌TbpB的四个主要系统发生分组。组1包括具有同型ITbpB的株。同型ITbpB在特征上具有与同型IITbpB(80-85kDa)相比较小的TbpB(约65-70kDa)。通过多序列比对来比较所述序列披露了尺寸的差异主要归因于同型IITbpB中C端半段较大。同型IITbpB簇集成三个主要的系统发生组(组2-4，图10A)。说明TbpBC端半段的序列多样性的系统发生树(图10B)支持以下结论：C端半段序列主要负责两种TbpB同型的鉴定。图10A中组2的成员并未在C端半段系统发生树中簇集在一起，但在图10B中分布在整个树中，指示组2主要由N端半段序列定义。这指示如果免疫交叉反应性将通过针对C端半段的反应性来确定，那么将无需组2的具体代表。相比之下，用于鉴定TbpB序列的集合以表示总体TbpB多样性的箭头和线并未充分地表示总体C端半段多样性，因此选择两种额外株来提供C端半段多样性的更全面表示。来自由箭头、双箭头或线鉴定的株的C端半段序列包括于本申请中以提供序列多样性的代表性样品(SEQIDNO:87；SEQ.IDNO:93；以及SEQ.IDNO:147至SEQ.IDNO:163)。为了解决关于靶向来自脑膜炎奈瑟氏球菌的TbpB的疫苗是否可能诱导针对淋病奈瑟氏球菌的免疫反应的问题，我们执行了来自淋病奈瑟氏球菌的TbpB和TbpBC端半段的序列多样性的分析。来自脑膜炎奈瑟氏球菌研究的代表性TbpB和TbpBC端半段的序列(图10；SEQ.DNO:119；SEQ.IDNO:125；SEQ.IDNO:179至SEQ.IDNO:195；SEQ.IDNO:117；SEQ.IDNO:123；SEQ.IDNO:132至SEQ.IDNO:147；SEQ.IDNO:177；以及SEQ.IDNO:178)包括于所述分析中。如图26A中所说明，淋病奈瑟氏球菌TbpB最密切地与同型2TbpB相关并且形成脑膜炎奈瑟氏球菌同型2簇集内的两个子组。这表明在使用重组TbpB的定点突变体作为优选疫苗抗原的策略的情况下，可能主要由源于脑膜炎球菌TbpB的抗原实现广泛交叉保护。图26B说明与使用完整TbpB的情形形成对比，淋病奈瑟氏球菌TbpBC端半段为与脑膜炎奈瑟氏球菌C端半段不同的子组。因此，在使用C端半段来提供广泛交叉保护的策略的情况下，将需要来自淋病奈瑟氏球菌株的C端半段。为了比较截短的TbpB和TbpBC端半段诱导交叉反应性抗体反应的能力，选择源于脑膜炎奈瑟氏球菌株B16B6(由图10中的黑色箭头标记)的重组截短的TbpB和TbpBC端半段用于免疫分析。来自株B16B6的重组截短的TbpB和TbpBC端半段用于使兔免疫并且使用我们的新颖ELISA分析测试血清的交叉反应性(图5)。重要的是认识到包括于本申请中的C端半段的多个序列恰在N端半段上的筒结构域的最后一个β链的末端后开始，因此包括N端半段与C端半段之间的连接区(L15，图2)。因此，将有可能制备具有N端截短的稳定、功能性C端半段，其去除L15区(B16B6C端半段中的14个氨基酸)用于免疫实验。选择源于分布在系统发生树中的株的TbpB的代表性集合(黑色和灰色箭头，图10)以评估血清的交叉反应性。由两个双头箭头指示的两种额外TbpB已经包括于所述分析中以提供更全面覆盖，但不可在分析时获得。所述蛋白在我们的具有N端生物素标记序列的定制表达载体中表达，并且应用于抗生蛋白链菌素涂布的ELISA板。测试来自用所述工程改造的C端半段和源于株B16B6的截短的TbpB免疫的兔的血清识别TbpB变体组的能力。针对截短的TbpB的抗血清具有高于抗C端半段抗血清的针对同源TbpB(B16B6)的效价，和略微较高或相等的针对来自异源株(H44/76)之一的TbpB的效价。然而，所述抗C端半段抗血清具有高于所述抗TbpB抗血清的针对来自所有其它异源株的TbpB的抗体效价。因此，所述C端半段在其诱导交叉反应性抗体的能力方面比完整TbpB卓越。在这一免疫实验中，所述重组抗原如上文所述产生并且用于使用20％EmulsigenD(VSA)佐剂中的50μg纯化的抗原在后面区域中皮下使兔(新西兰白兔，3月龄，雌性)免疫。所述兔在0、3和6周时免疫。在第8周获取的血清在我们的定制固相ELISA分析中针对代表性蛋白进行测试。用于所述ELISA分析中的重组融合蛋白如上文所述产生。在所述定制ELISA分析中测试的重组蛋白为来自脑膜炎奈瑟氏球菌株的完整TbpB的截短形式(失去最初19-36个氨基酸)；(i)B16B6(SEQ.IDNO:117)，(ii)H44/76(SEQ.IDNO:133)，(iii)S3131(SEQ.IDNO:132)，(iv)M990(SEQ.IDNO:134)，(v)M978(SEQ.IDNO:135)，(vi)M992(SEQ.IDNO:138)，(vii)P3006(SEQ.IDNO:139)，(viii)120M(SEQ.IDNO:137)，(ix)MC58(SEQ.IDNO:136)以及(x)M982(SEQ.IDNO:123)。基于先前的优化实验，来自使用用于生物素标记的融合蛋白的表达载体的小规模过夜蛋白表达实验的粗提取物足以使所述ELISA板饱和。所关注的抗血清的稀释液在磷酸盐缓冲生理盐水(PBST)中的2.5％脱脂乳中制备并且在室温下应用于所述板持续1小时。原发抗体在室温下通过HRP缀合的山羊抗兔IgG在1:100,000的稀释度下检测持续1小时并且效价表述为在A450>0.3下最后稀释度的倒数。实施例5-脑膜炎奈瑟氏球菌TbpBC端半段的二聚体的产生图11中的结果说明来自人类病原体脑膜炎奈瑟氏球菌的TbpBC端半段结构域能够诱导相对于完整TbpB增强的交叉反应性反应。在这一实施例中，我们证明了有可能产生稳定并且具免疫原性的涵盖所述两种C端半段的单一多肽。所述两种C端半段来自具有抗原性趋异TbpB的株，即株B16B6和M982，所述株表示TbpB的两种同型(图10)。图12的图A说明单一基因，所述基因建构为编码用于实施例4中所述的免疫实验的两种代表性TbpBC端半段(SEQ.IDNO:150)。图12的图B说明与个别组分TbpBC端半段的制剂相比，C端半段二聚体的产生。存在合理的C端半段二聚体的产生水平，所述C端半段二聚体看来相对稳定，但在用于免疫实验之前将需要额外纯化。图13说明由来自脑膜炎奈瑟氏球菌株M982和B16B6的TbpBC端半段组成的二聚体能够诱导针对来自两种物种的完整TbpB的有效免疫反应。实施例6-来自脑膜炎奈瑟氏球菌的C端半段的环区的减少。在这一实施例中，我们证明了有可能大致上减少来自脑膜炎奈瑟氏球菌的C端半段的环区。所述减少为适用的，因为其提供了缺乏可用作用于呈现来自其它抗原或其它病原体的表位的便利‘骨架’的大环区的衍生物，并且进一步可呈现所需的免疫特性。在这一实施例中，来自脑膜炎奈瑟氏球菌株M982的C端半段结构域的环区被修饰以从大的柔性环区去除总计82个氨基酸。天然C端半段和具有四个大的柔性环的显著减少的工程改造的C端半段的结构模型说明于图14的图A中。针对减少所靶向的四个环并未在基于蛋白结晶学的结构(3VE2.pdb)中拆分，指示存在所述环的构象的变化，这是为什么所述环在图A的左侧的模型中由虚线表示。用于环去除的策略通过检查详细结构(3VE2.pdb)同时评估所选C端半段的序列比对的序列变化来开发。然而，提供所述环之间的最有效桥接而不潜在地破坏所述结构为用于选择桥接氨基酸的主要准则。天然C端半段(SEQ.IDNO:125)、缺乏靶向的环中的每一者的工程改造的衍生物和其中去除所有四个环的‘无环’C端半段(SEQ.IDNO:129)的序列比对说明于图14的图B中。使用重叠延伸剪接方法(SOEing)(57)，制备编码个别环缺失和其中去除所有四个环的‘无环’C端半段的基因。在用于产生来自脑膜炎奈瑟氏球菌M982的重组C端半段的表达质粒上执行所述SOEing方法，使得所得工程改造的蛋白的稳定性可能容易进行评估。所述载体编码N端聚组氨酸标签、编码麦芽糖结合蛋白的基因和在所插入的编码TbpBC端半段的基因之前的TEV(烟草蚀纹病毒)裂解位点。所述表达质粒转化至携带插入至lacZ基因中的T7RNA聚合酶基因的染色体拷贝的大肠杆菌表达株ER256中，并且因此在lac启动子的控制下。使用自动诱导介质(55)执行小规模表达分析。在过夜生长后，收集细胞并且溶解，并且将离心后的上清液组分应用于Ni-NTA树脂，洗涤并且结合的蛋白在SDS-PAGE缓冲液中洗脱。如图15中所说明，具有环18、环21、环23或环27的显著减少的重组C端半段的产率与天然C端半段蛋白(WT)可相当，指示个别环的去除不会不利地影响蛋白稳定性。图15还显示在所有四个环中去除81个氨基酸不会影响所产生的蛋白的水平，指示所有四个环的去除不会干扰C端半段的总体折叠。重要的是提到所述‘无环’C端半段容易以良好质量产生并且纯化，并且已经从纯化的‘无环’C端半段获得晶体结构。这指示工程改造的抗原可容易以大致上稳定形式在适用于商业应用的产生水平下产生。因此，这一实施例不仅显示用于去除抗原性可变区的策略为切实可行的，而且所得蛋白可适合作为表位呈现骨架，因为核心结构的折叠不受所述环的尺寸和性质的变化影响。最后，如图16中所说明，‘无环’C端半段(SEQ.IDNO:129，最后两条)为免疫原性的并且能够诱导针对完整(天然)TbpB抗原(SEQ.IDNO:123)的强烈抗体反应。本图说明所述无环C端半段实际上在小鼠中诱导高于初始TbpBC端半段(SEQIDNO:125)抗原的针对来自脑膜炎奈瑟氏球菌株M982的TbpB的抗体效价(比较本图中的第3条和第1条)。令人惊讶的是以下观察结果：所述‘无环’C端半段诱导与来自B16B6的天然TbpBC端半段类似的针对来自株B16B6的异源TbpB的抗体水平，不过事实上其序列为极其趋异的(图10)。图16中第2条与第4条的比较说明这两种蛋白诱导类似的针对来自株B16B6的完整TbpB的抗体水平。在这些实验中，FvB雌性小鼠用具有20％emulisgenD的25ug纯化的蛋白抗原在第0、21和42天免疫并且使用我们的定制ELISA分析评估在第56天获取的血清的终点效价。所述B16B6TbpBC端半段、M982TbpBC端半段或修饰的M982TbpB(‘无环’)用于免疫的四只小鼠中的每一者。针对生物素标记的完整M982或B16B6TbpB蛋白评估终点效价。效价用山羊抗小鼠IgGH+L过氧化物酶缀合的抗体在1:100,000下确定。终点效价确定为有可能可信赖地检测到正信号时所处的最后稀释度的倒数。各血清一式三份允许并且结果显示为所有使用所述治疗的小鼠的平均值+/-SEM。实施例7-TbpA部分插入至TbpB的工程改造的C端半段中。在这一实施例中，编码完整外膜蛋白转铁蛋白结合蛋白A(TbpA)的细胞外表面环的区段的DNA剪接至编码来自脑膜炎奈瑟氏球菌株M982的修饰或‘无环’TbpBC端半段的基因中，导致编码各种杂合TbpA-TbpB蛋白的基因。剪接TbpA的所选区域至TbpBC端半段骨架上的原因在于其提供比完整TbpA蛋白更有效的产生方式，并且提供特异性地靶向TbpA的表面区域以诱导抗体的能力。编码实施例6中制备的TbpB多肽(SEQIDNO:97)的修饰的C端半段的基因用作起点(进一步参看：图14的图A(中间模型)。编码来自TbpA的不同表面环的区段的DNA(图17，图A)剪接至其中较大的环已经从TbpBC端半段多肽去除的位点(图17，图B)中。来自TbpA的β筒细胞外环3、10和11的部分(58)(图A中空间填充并且标记的区域)插入至工程改造的TbpBC端半段的修饰的环区18、21和23(图B)中。同样，来自插入TbpA-转铁蛋白结构中的人类转铁蛋白的C1与C2结构域之间的N端插塞区的区段(插塞环，图A)插入至修饰的TbpBC端半段的修饰的环27中。TbpA环组装于TbpBC端半段上使用重叠延伸剪接方法(SOEing)(57)进行。在用于产生来自脑膜炎奈瑟氏球菌M982的重组C端半段的表达质粒上执行所述SOEing方法，使得所得工程改造的蛋白的稳定性可能容易进行评估。所述载体编码N端聚组氨酸标签、编码麦芽糖结合蛋白的基因和在所插入的编码TbpBC端半段的基因之前的TEV(烟草蚀纹病毒)裂解位点。所述表达质粒转化至携带插入至lacZ基因中的T7RNA聚合酶基因的染色体拷贝的大肠杆菌表达株ER256中，并且因此在lac启动子的控制下。使用自动诱导介质(55)执行小规模表达分析。在过夜生长后，收集细胞并且溶解，并且将离心后的上清液组分应用于Ni-NTA树脂，洗涤并且结合的蛋白在SDS-PAGE缓冲液中洗脱。如图18的图A中所说明，外来TbpA区段插入至修饰的TbpBC端半段的环中导致产生稳定的重组蛋白。图18的图A中所说明的重组蛋白含有N端聚组氨酸标签、麦芽糖结合蛋白融合伴侣以及TEV(烟草蚀纹病毒)蛋白酶裂解位点。图18的图B说明通过用TEV蛋白酶裂解从所述重组蛋白融合伴侣释放野生型和突变型C端半段。结果证明外来蛋白区段的插入不会大致上影响工程改造的C端半段的稳定性，表明外来区段不会干扰所述C端半段的核心结构元件的正常折叠。这些结果暗示所述C端半段看来为用于呈现外来表位的稳定并且通用的蛋白骨架，其可能最终用于呈现来自多种抗原和抗原变体的表位，从而提供了用于产生具有产生广泛交叉保护性免疫反应的能力的工程改造的抗原的额外策略。最后，如图19中所说明，含有剪接至其中减少或去除大的环的区域中的TbpA区域的修饰的TbpBC端半段为免疫原性的。本图说明杂合TbpA-TbpBC端半段蛋白诱导等于或高于母体修饰的(‘无环’)C端半段的抗体效价。应注意，呈现来自TbpA的环10和环11的区域的蛋白具有最高效价(图19中的第2条和第3条)。在本实验中，FvB雌性小鼠用具有20％emulisgenD的25μg纯化的蛋白抗原在第0、21和42天免疫并且使用我们的定制ELISA分析评估在第56天获取的血清的终点效价。三只小鼠用其中去除所有四个环的‘无环’C端半段(SEQ.IDNO:97)免疫。五只小鼠用于用四种其它杂合抗原中的任一者免疫；(i)具有插入至TbpBC端半段环21中的TbpA环10的‘无环’C端半段(SEQ.IDNO:154)，(ii)具有插入至TbpBC端半段环23中的TbpA环11的‘无环’C端半段(SEQ.IDNO:156)，(iii)具有插入至TbpBC端半段环27中的TbpA环3螺旋的‘无环’C端半段(SEQ.IDNO:158)，或(iv)具有插入至TbpBC端半段环18中的TbpA插塞环的‘无环’C端半段(SEQ.IDNO:160)。血清针对呈现所插入的所有四个TbpA环的修饰的M982C端半段的生物素标记的重组形式(SEQ.IDNO:131)进行测试。效价用山羊抗小鼠IgGH+L过氧化物酶缀合的抗体在1:100,000下确定。终点效价确定为有可能可信赖地检测到正信号时所处的最后稀释度的倒数。各血清一式三份运行并且结果显示为所有使用所述治疗的小鼠的平均值+/-SEM。实施例8-LbpA部分插入至TbpB的修饰的C端半段中。在这一实施例中，来自株MC58的完整外膜蛋白乳铁传递蛋白结合蛋白A(LbpA)的细胞外表面环的区段(SEQ.IDNO:162)剪接至实施例6中所描述的来自脑膜炎奈瑟氏球菌株M982的修饰的TbpBC端半段(SEQ.IDNO:129)中。剪接LbpA的所选区域至TbpBC端半段骨架上的原因在于其提供比完整LbpA蛋白更有效的产生方式，并且提供特异性地靶向LbpA的表面区域以诱导抗体的能力。结合实施例7，我们能够说明杂合蛋白的产生如何可能提供诱导针对存在于脑膜炎奈瑟氏球菌表面上的三种不同蛋白的免疫反应的机会，从而提供潜在‘疫苗逃避’的更大屏障，在所述‘疫苗逃避’中关键靶标蛋白的抗原变体能够逃避针对疫苗抗原产生的免疫反应的影响。由于不存在可用于LbpA的结构，使用3个基于网络的蛋白预测服务器：SWISS模型、I-TASSER和PHYRE2执行LbpA的结构建模，试图获得最适当的模型。最初执行BLAST搜索以发现用于由已知的TbpA结构(58)建模的最适当LbpA，并且披露了来自株MC58的LbpA(SEQ.IDNO:130)为最适当的。MC58LbpA与K454TbpA的比对通过ClustalW产生并且用作SWISS模型中用于比对模式的输入。在PHYRE2中，用于K454TbpA结构的PDBID和MC58LbpA的FASTA序列分别作为模板和靶标提交。仅MC58LbpA的FASTA序列提交至I-TASSER。均方根差(RMSD)用于评估在Pymol(http://www.pymol.org/)中重叠由所述模板结构产生的不同模型后所述模型的相似性。选择由PHYRE2产生的LbpA模型作为最适当模型并且将其用于选择用于产生杂合或嵌合蛋白的环区(图20，图A)。在实施例6中制备的TbpB多肽的‘无环’C端半段(SEQ.IDNO:129)用作起点。编码来自LbpA细胞外环3和环2的区域的DNA插入编码侧接工程改造的TbpBC端半段的环18和21的β链的DNA之间(图20，图B)。使用Pymol分析TbpBC端半段中的环区和用于插入的LbpA中的相应环的距离以确保LbpA置换环被结构化为在由所述环预测的距离参数内。LbpA环组装于TbpBC端半段上如实施例6和7中使用SOEPCR进行，并且序列分析确认MC58LbpA螺旋3和环2插入无环M982TbpBC端半段中。所述杂合蛋白的设计涉及将来自LbpA螺旋3区域的15个氨基酸(蛋白序列：383-YGTDEAEKFRDKSGV)插入至M982C端半段的环18区域(SEQ.IDNO:166)中，和将来自LbpA环2区域的11个氨基酸(蛋白序列：LNRWVKERIEQL)插入至M982C端半段的环21区域(SEQ.IDNO:164)中(图20>，图B)。用于转化重组质粒和执行初步表达试验的方法如实施例7中所述。初步筛选证明重组蛋白的产率较高(底部左侧，图B，图20)，可相当于或优于由用作骨架的天然C端半段或无环C端半段获得的结果(数据未示)。清楚地，结果进一步证明外来蛋白区段的插入不会大致上影响工程改造的C端半段的稳定性，表明外来区段不会干扰所述C端半段的核心结构元件的正常折叠。实施例9-使用流感嗜血杆菌的TbpBC端半段工程改造用于缀合物荚膜疫苗应用的环迄今已经开发的缀合物荚膜疫苗大多数已经使用一种基于毒素的疫苗组分作为用于缀合多糖荚膜材料的载体。关于缀合荚膜多糖至破伤风或白喉毒素或类毒素的策略存在数种缺点。一种是由于持续暴露于也存在于用于常规免疫的疫苗中的载体蛋白而不利地影响有效免疫反应的诱导的潜能；免疫耐受性的发展。第二种是所述载体与天然暴露于所述病原体无关，因此当遇到所述病原体时将不会充分引起最相关T细胞帮助。缀合物荚膜疫苗已经非常成功地预防表达特异性荚膜多糖(通常称作血清型或血清组)的细菌病原体的感染，并且事实上预防定殖。然而，关于表达其它多糖荚膜类型的细菌基本上不存在交叉保护，其最终可导致由表达所述疫苗不涵盖的多糖的株引起的疾病。所引起的扩展由所述缀合物荚膜疫苗涵盖的多糖荚膜类型的范围的需要已经导致持续开发扩展范围的疫苗的前景并且认为最终溶液在于能够提供显著交叉保护的基于蛋白的疫苗。然而，如果开发能够诱导广泛交叉保护的基于蛋白的疫苗，那么其将不可能被接受替换现有缀合物荚膜疫苗。将另一疫苗添加至已经认可的常规免疫方案中可能被视为引入基于蛋白的疫苗的潜在屏障。在这一实施例中，我们已经工程改造缀合环至含有42个赖氨酸残基的来自流感嗜血杆菌的TbpBC端半段中，所述赖氨酸残基大致上超过所述TbpBC端半段的剩余部分中的赖氨酸(赖氨酸残基)的总数，其将经预测以使关键表位中赖氨酸的修饰减至最少，这仅仅因为那些与活化的碳水化合物部分反应的赖氨酸将进行修饰并且碳水化合物与蛋白的比率可在缀合过程期间加以控制。编码来自株H36的工程改造的流感嗜血杆菌TbpBC端半段的基因的序列说明于图21的图A中，其中具有由增加的字体尺寸(14对12)指示的编码缀合环的DNA区域(SEQ.IDNO:167)。缀合环的插入位点和序列使用来自作为模型的脑膜炎奈瑟氏球菌MC58的LbpB中大的带负电的环来设计(59)。基本上，所述LbpB环的序列用作模板并且赖氨酸用于置换所述环中的天冬氨酸或谷氨酸残基。所述缀合环工程改造至β链22与23之间所述TbpBC端半段的手柄结构域上，在环23的位置中(图2)。所述环的位置在图21的图B中使用用于由置换环23的小得多的环(包含11个氨基酸)产生的流感嗜血杆菌C端半段的结构模型来说明。所插入的残基作为空间填充球加以说明。所述工程改造的环实际上包含构成总体C端半段(352个氨基酸残基)的尺寸的超过1/4的91个氨基酸并且所述环在整个C端半段中作为突出显示的残基加以示出，其中所述工程改造的环于SEQ.IDNO:205中示出。这显示所述环结构域可容纳大量的额外氨基酸。缀合区的包括将不限于插入至所述N端半段或C端半段的环区中，而是例如可能通过在完整TbpB或TbpB半段的N端处包括赖氨酸残基的簇集来提供。实施例10-在TbpB的表面结合环中产生氨基酸取代并且评估其Tf结合特性建构所述TbpB蛋白的表面环中的一系列定点突变体以探究其对功能和免疫特性的影响。为了靶向用于修饰的表面暴露的氨基酸，在TbpB中进行定点突变，关于所述TbpB我们具有源于x射线结晶学的结构(12,13)。使用重叠延伸剪接聚合酶链反应(SOEPCR)方法将突变引入至编码源于猪病原体胸膜肺炎放线杆菌、猪放线杆菌和副猪嗜血杆菌的截短的TbpB蛋白的基因中。其包括源于株H49的胸膜肺炎放线杆菌TbpB20-528(氨基酸20-528)(ApH49TbpB，SEQ.IDNO:2)，和ApH49TbpB20-528的F171A突变体(SEQID.NO:4)。还包括源于株H87的胸膜肺炎放线杆菌TbpB26-528(氨基酸26-528)(ApH87TbpB，SEQ.IDNO:12)和Y95A突变体(SEQ.IDNO:14)、Y121A突变体(SEQ.IDNO:16)、Y174A突变体(SEQ.IDNO:18)和R179E突变体(SEQ.IDNO:20)。还产生源于株H57的猪放线杆菌TbpB27-577(氨基酸27-577)(AsH57TbpB，SEQ.IDNO:28)、F63A突变体(SEQ.IDNO:30)和F152A突变体(SEQIDNO:32)。最后，还制备源于Nagasaki株Hp5的副猪嗜血杆菌TbpB27-577(氨基酸27-577)(Hp5TbpB，SEQ.IDNO:115)、Y93A突变体(SEQ.IDNO:170)、Y117AA突变体(SEQ.IDNO:172)、Y167A突变体(SEQ.IDNO:174)和W176A突变体(SEQ.IDNO:176)。所述重组蛋白最初由含有聚组氨酸标签、麦芽糖结合蛋白和TEV蛋白酶裂解位点的N端融合伴侣产生。这使我们能使用硝基纤维素膜和酶促标记的猪转铁蛋白或通过用猪-琼脂糖亲和树脂捕获来自粗提取物的重组融合蛋白来分离适用于固相结合分析的重组蛋白(13)。使用这些分析，容易观察到天然TbpB的强烈结合，而多种定点突变体的结合降低。尽管有可能从这些实验推导针对猪的结合的半定量结合常数，我们选择利用多种不同的生物物理和生物化学方法来获得结合亲和力的更精确并且定量性测量。如图22中所示，使用等温量热法、表面等离子体共振或生物膜层干涉测量法(23-25)，针对天然TbpB的亲和常数(Kd)一般在20至60nM范围内，其中例外为来自猪放线杆菌的TbpB，其结合动力学略微独特并且具有120nM的估计Kd(12)。数种突变引起亲和常数(Kd)的≥100倍增加，如来自胸膜肺炎放线杆菌株H49的TbpB中的F171A突变、来自胸膜肺炎放线杆菌株H49的TbpB中的Y174A突变或来自副猪嗜血杆菌株HP5的TbpB中的Y167A或W176A突变。有趣的是注意到这些突变体均映射到环8。实施例11-评估在表面结合环中具有氨基酸取代的TbpB衍生物的免疫特性为了测试源于在结合Tf方面具有缺陷的TbpB的突变型蛋白的免疫特性，重要的是测试天然宿主中的所述蛋白，并且优选地直接测试其保护宿主免于靶向的病原体的感染的能力。因此，在充分确立的针对副猪嗜血杆菌的感染模型中起始实验，其中丧失初乳的小猪在出生后28天开始免疫并且在第63天用副猪嗜血杆菌激发(37,60)。在这种感染模型中，源于激发株的商业疫苗(PorcillisGlasser)提供完全保护以免死亡并且转铁蛋白受体的重组形式先前已经提供激发后15天20-30％存活。五只或六只猪的各组用来自Hp5激发株的重组完整TbpB、定点Y167ATbpB蛋白、PorcillisGlasser疫苗或单独佐剂免疫。所述猪用标准108激发剂量的副猪嗜血杆菌Hp5(Nagasaki)株激发并且监测持续15天时期。如图23中所说明，用对照PorcilisGlasser疫苗免疫的五只猪中仅有1只经受得住所述激发，表明Hp5株的更具毒性变体用于这一实验中。追踪实验，其中来自感染的猪的株的分离株具有较低存活率，从而支持这一结论。尽管所述激发株具有增强的毒性，所有六只用Y167ATbpB免疫的猪均存活15天，并且所述六只猪中有5只具有极少或无症状并且在尸体剖检时观察到极少或无病理学。这种保护程度与用野生型蛋白免疫的六只猪(其中仅3只猪经受所述激发后存活)形成对比。所述3只存活的猪在激发后具有显著临床症状并且在尸体剖检时显示显著病理学。总之，这一实验说明Y167ATbpB突变型蛋白诱导与野生型蛋白相比卓越的保护性免疫反应，并且由于所述两种蛋白除了转铁蛋白结合特性外实际上同一(图22)，天然蛋白的次最佳免疫反应可归因于宿主转铁蛋白的结合。为了提供所述突变对所述免疫反应的影响的进一步证据，评估B细胞和T细胞反应。分析在激发前即刻(两次免疫之后)和在激发之后96小时获取的血样的适应性免疫反应。通过FACS分析评估所述样品的成熟B细胞(αIgM+CD21+)和T辅助细胞(CD4+CD8α-)子集。图24中的结果证明在激发之前，Y167A突变型TbpB抗原已经诱导强于天然TbpB抗原或商业PorcilisGlasser疫苗的B细胞反应(图A)和T辅助细胞反应(图B)。在激发之后96小时，对突变型TbpB的反应(51.48％±1.18％)显著高于对天然TbpB(45.65％±1.20％)或PG疫苗(44.83％±1.59％)的反应(图24，图C)。在T辅助细胞反应中观察到类似倾向，然而，三组之间的百分比差异不太明显(图24，图D)。然而，在96小时之后在用天然TbpB或PorcilisGlasser疫苗免疫的组中仅剩下3/6和2/5存活的猪，并且由于低反应者为倾向于更早死亡的猪，在96h时间点观察到的各组之间的差异实际上为低估值。实施例12-针对TbpB衍生物的免疫反应能够预防定殖尽管感染模型确实提供评估疫苗的潜在功效的机会，其很少仿效天然感染过程，在天然感染过程中病原体的传播通常在感染确立之前导致宿主上呼吸道的定殖。设计成预防脑膜炎、肺炎和侵入性感染的缀合物荚膜疫苗已经显示从上呼吸道消除靶向的细菌(17)，从而提供保护非免疫个体的群体免疫的额外优势。预防定殖的能力此后已经变成用于对疫苗实施作出决定的重要特征(18)。因此，设计预防定殖的疫苗可为明智的，使得连同预防感染，其可消除引起疾病的病原体的贮主。利用表征脑膜炎奈瑟氏球菌和人类CEACAM受体的相互作用的先前研究(61)，我们开发了一种能够支持脑膜炎奈瑟氏球菌的定殖的转基因人源化小鼠模型(62)。这种模型是基于脑膜炎奈瑟氏球菌Opa蛋白与人类CEACAM1受体的特异性相互作用，并且可能潜在地扩展至天然或人工利用这种相互作用的其它病原体。用脑膜炎球菌组C缀合物荚膜疫苗使所述转基因小鼠免疫导致定殖模型中的消除性粘膜免疫性或换句话说，预防组C脑膜炎奈瑟氏球菌而不是具有其它荚膜类型的株的定殖。这种模型用于测试TbpB和其衍生物预防脑膜炎奈瑟氏球菌的定殖的能力。由于在免疫阶段期间这些小鼠中不存在人类转铁蛋白，不必要使用如实施例11中所述的工程改造的非结合TbpB。如图25A中所说明，用重组截短的TbpB免疫的9只小鼠中有8只在用1×107CFU的脑膜炎奈瑟氏球菌株M982进行鼻内激发后3天不具有可检测水平的脑膜炎奈瑟氏球菌。在用单独佐剂治疗的对照小鼠中，8只小鼠中有6只具有可检测水平的脑膜炎奈瑟氏球菌存在。重要的是提到这是第一种显示出能够预防定殖的蛋白抗原并且由于我们对所涉及的机制的理解有限，无法假定这种特征是表面蛋白抗原所共有的。在追踪实验中，我们比较了TbpB与另一种表面脂蛋白，即因子H结合蛋白，其为两种疫苗中的关键组分，并且比较了TbpB与个别TbpB子结构域。如图25B中所说明，所述C端半段能够与完整TbpB或TbpBN端半段一样良好地或优于完整TbpB或TbpBN端半段预防定殖，这又与因子H结合蛋白一样有效地或更有效地在这一实验中诱导消除性免疫性。在全身性免疫下所述TbpBC端半段诱导消除性粘膜免疫性的能力是尤其振奋人心的发现，因为其缺乏Tf结合意味着其将在天然宿主中同样有效，并且其增强的诱导交叉反应性免疫反应的能力(图3，图11)将促进广泛交叉保护性疫苗的开发。如先前所述执行定殖研究(62)。表达人类CEACAM-1转基因的8只或更多只C57/Bl6的各组(室内繁殖)在第0和21天皮下接受100ul的指定免疫。各组接受指定蛋白(25ug)或在无菌磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)(Gibco)中稀释至每次注射100ul的体积的用20％EmulsigenD(MVPLaboratories)辅助的无蛋白对照。在第35天，小鼠用Isofluran(Baxter)麻醉并且经由鼻内滴注接种，其中两只动物进行脑膜炎奈瑟氏球菌株M982的传代。为了制备接种体，用于感染的菌株在GC琼脂(BecktonDickinson)上生长过夜；过夜生长菌苔收集至含有1mMMgCl2的1mlPBS(PBS/Mg)中并且测量OD600以调节细菌数目。调节培养物，使得各最终10μl接种体含有大致1×107个集落形成单位。定殖剂量的密度经由在GC琼脂上连续稀释涂板来确认。在感染后三天(第38天)，通过二氧化碳窒息处死小鼠。通过用250ulPBS/Mg进行气管灌洗，随后用再悬浮于500ulPBS/Mg中的聚酯签涂药器(PuritanMedicalProducts)直接擦拭鼻孔来评估定殖的负荷。在补充有VCNT抑制剂(BectonDickinson)的GC琼脂上过夜生长后对样品计数以预防鼻菌落的生长。根据多伦多大学动物伦理审查委员会(AnimalEthicsReviewCommitteeoftheUniversityofToronto)进行动物实验。实施例13-包含TbpB或其部分的混合物的疫苗制剂由于具有TbpB的病原体专门停留于其特定宿主(人类、猪、牛和/或相关反刍动物)中并且由于TbpB能够预防定殖(图25)，基于靶向TbpB的工程改造的抗原的广泛交叉保护性疫苗具有消除所述病原体的潜能。为了加宽针对革兰氏阴性病原体谱的疫苗制剂的功效，可组合获自不同细菌物种或菌株的TbpB或其部分，例如C端半段结构域。在这一实施例中，我们提供了用于制备疫苗制剂的TbpB多肽或其组合的优选组合。鉴定TbpB多肽的有效组合时的一个重要考虑因素是不同株、物种和属能够容易地交换tbpB基因，因此充当所述疫苗未涵盖的TbpB变体的潜在贮主的程度。影响tbpB基因的水平交换的一个重要因素是固有地存在于这些天然可转化物种中的摄取信号序列(USS)的性质(63,64)。这些细菌优先摄取含有所述特异性USS的DNA并且将其并入其基因组中，从而提供用于并入其表面抗原的抗原性变体的极其有效的机制。在脑膜炎奈瑟氏球菌的情况下，我们具有适当地表示总体序列多样性的广泛株集合(图10A)。在公共数据库上关于这种病原体可获得来自全世界的序列的尤其大的集合，其表示序列多样性的极其全面的理解。由于具有TbpB并且通常停留于人类上呼吸道中的其它人类病原体(流感嗜血杆菌、卡他莫拉氏菌)在其基因组DNA中不含对奈瑟氏菌具特异性的USS，其不构成用于抗体变体的现成贮主。因此，本发明实施例包括包含工程改造的TbpB抗原的组合的疫苗制剂，所述组合包含至少两种获自选自图10A中所示出的两种不同系统发生簇集的脑膜炎奈瑟氏球菌株的TbpB多肽或其部分(例如C端半段结构域)。所述疫苗制剂潜在地能够诱导交叉反应性(图11)和交叉保护性抗体反应，可能潜在地用于从人类群体消除脑膜炎奈瑟氏球菌。通常停留于人类泌尿生殖道中的相关病原体淋病奈瑟氏球菌共享相同USS，因此可能潜在地由于这两种物种偶尔存在于相同粘膜表面上而用作抗原变化的贮主。然而，淋球菌TbpB的序列多样性相对于脑膜炎奈瑟氏球菌中的多样性的分析(图26A)指示其主要为存在于脑膜炎奈瑟氏球菌中的序列多样性的子集，从而预期通过我们的方法的略微延伸，工程改造的抗原的集合可能用于潜在地能够消除任一病原体的定殖的疫苗。关于工程改造的C端半段(图26B)，其将涉及包括特异性地靶向淋病奈瑟氏球菌TbpB变体的C端半段。一些共生奈瑟氏球菌分离株中TbpB的存在表示抗原变体的另一种潜在贮主，因此我们的方法延伸包括来自共生奈瑟氏球菌的代表性变体可能为必要的以有效地消除表达能够引起疾病的奈瑟氏球菌的TbpB。因此，本发明实施例包括包含工程改造的TbpB抗原的组合的疫苗制剂，所述组合包含脑膜炎奈瑟氏球菌TbpB多肽或其部分(例如C端半段结构域)和淋病奈瑟氏球菌TbpB多肽或其部分(例如C端半段结构域)。猪病原体胸膜肺炎放线杆菌、猪放线杆菌和副猪嗜血杆菌共享相同USS并且因而，TbpB序列多样性分布在所述三种物种中(图4)，使得主要系统发生簇集具有来自至少两种物种的代表。因此，重要的是当开发针对这些病原体的基于TbpB的疫苗时考虑所有三种物种中的总体TbpB序列变化。这是我们开发能够诱导针对来自超过一种物种的抗原的免疫反应的工程改造的抗原的相当不寻常方法的基础(图6，图7)，并且由于TbpB能够预防定殖，使用可能用于从其猪宿主消除所有三种病原体的方法。因此，本发明实施例包括一种包含工程改造的TbpB抗原的组合的疫苗制剂，所述组合包含至少两种获自胸膜肺炎放线杆菌、猪放线杆菌和副猪嗜血杆菌的TbpB多肽或其部分(例如C端半段结构域)。关于流感嗜血杆菌，由具有b型多糖荚膜的株和缺乏多糖荚膜的不可分型株引起的截然不同的疾病谱已经引起对分别靶向各组的疫苗的关注。由于表达组A多糖荚膜的株引起的侵袭性疾病的近期增加已经促使考虑开发靶向组A株的疫苗(65)。对流感嗜血杆菌株中TbpB多样性的评估指示存在三种主要的系统发生簇集(图27A)，其中不可分型株分布于所有三个组中。由于所有流感嗜血杆菌株共享相同USS，有可能TbpB多样性的分布将不受荚膜类型影响，并且源于基于TbpB的工程改造的抗原的交叉保护性疫苗的开发将有效地靶向b型株、不可分型株和表达其它荚膜类型的株。因此，我们的方法将促进开发针对流感嗜血杆菌的广泛保护性基于TbpB的疫苗作为独立疫苗，或作为用于缀合物荚膜疫苗的载体(图21)。因此，本发明实施例包括包含工程改造的TbpB抗原的组合的疫苗制剂，所述组合包含至少两种获自选自图27A中所示出的两种不同系统发生簇集的流感嗜血杆菌株的TbpB多肽。不同于脑膜炎奈瑟氏球菌和流感嗜血杆菌，卡他莫拉氏菌株的基因组中不存在明显USS，然而其为天然可转化的，其中对于卡他莫拉氏菌DNA存在强烈偏好。因此，由靶向TbpB的工程改造的抗原开发针对卡他莫拉氏菌的广泛交叉保护性疫苗仅需要考虑来自卡他莫拉氏菌的TbpB的多样性(图29)。源于构成所述三个主要组的株的抗原应足以诱导能够预防卡他莫拉氏菌的定殖的广泛交叉保护性疫苗。因此，本发明实施例包括包含工程改造的TbpB抗原的组合的疫苗制剂，所述组合包含至少两种获自选自图29中所示出的两种不同系统发生簇集的卡他莫拉氏菌株的TbpB多肽。牛病原体溶血性曼氏杆菌(先前称作溶血性巴斯德菌)为牛中的牛呼吸道疾病(航运热)和绵羊中的呼吸道感染的主要原因。已经重新分类为两个物种葡萄糖苷酶曼氏杆菌和海藻糖巴斯德菌(Bibersteiniatrehalosi)的绵羊病原体海藻糖巴斯德菌(Pasteurellatrehalosi)与溶血性曼氏杆菌共享USS。这种病原体可主要引起以下发现：这些物种共享共同基因池(66)。与所述牛病原体形成对比，睡眠嗜组织菌(先前称作睡眠嗜血杆菌)具有不同USS，因此并非针对溶血性曼氏杆菌的抗原变体的贮主。存在三个主要的来自溶血性曼氏杆菌、葡萄糖苷酶曼氏杆菌和海藻糖巴斯德菌的TbpB的系统发生谱系，其明显涵盖绵羊和牛的病原体(66)(图28)，其中变体的簇集主要限于牛或绵羊。因此，将有可能考虑开发靶向牛、绵羊或两种反刍动物物种中的疾病的源于TbpB的工程改造的抗原。因此，本发明实施例包括包含工程改造的TbpB抗原或其部分(例如C端半段结构域)的组合的疫苗制剂，所述组合包含至少两种获自选自图28中所示出的两种不同系统发生簇集的溶血性曼氏杆菌、葡萄糖苷酶曼氏杆菌和海藻糖巴斯德菌株的TbpB多肽。所有公布、专利和专利申请均以引用的方式全文并入本文，其并入程度就如同各个别公布、专利或专利申请特定地且个别地指示以引用的方式全文并入一般。参考文献1.SchryversAB.04-261990.AMethodforIsolatingandPurifyingTransferrinandLactoferrinReceptorProteinsfromBacteriaandthePreparationofVaccinesContainingtheSame.Francepatent0528787，00528787/EPB1.2.Quentin-MilletM-J，LissoloL.April15，19931993.SubunitvaccineforNeisseriameningitidisinfectionsandcorrespondingpurifiedsubunits.PCTpatentWO93/07172.3.DanveB，LissoloL，MignonM，DumasP，ColombaniS，SchryversAB，Quentin-MilletMJ.1993.Transferrin-bindingproteinsisolatedfromNeisseriameningitidiselicitprotectiveandbactericidalantibodiesinlaboratoryanimals.Vaccine11：1214-1220.4.Gray-OwenSD，SchryversAB.1996.Bacterialtransferrinandlactoferrinreceptors.TrendsMicrobiol4：185-191.5.LoRYC，SchryversAB，PotterAA.11-291996.TransferrinBindingProteinsofPasteurellaHaemolyticaandVaccinesContainingSamepatent09720934WO.6.LoosmoreS，HarknessR，SchryversA，ChongP，Gray-OwenS，YangY-P，MurdinA，KleinM.06-071995.Transferrinreceptorgenesandimmunogenlccompositionsderivedtherefrompatent05922323.7.SchryversAB.06-071995.Vaccineforconferringbacterialimmunitycontaininglactoferrinreceptorproteinpatent06060058.8.MyersLE，SchryversAB，HarknessRE，LoosmoreSM，DuR-P，YangY-P，KleinMH.03-081996.DNAencodingatransferrinreceptorofMoraxellapatent06090576.9.PotterAA，GerlachGF，WillsonPJ，Rossi-CamposA.March2，19991999.Actinobacilluspleuropneumoniaetransferrinbindingproteinvaccinesandusesthereof.USpatent5,876,725.10.PotterAA，RiouxC，SchryversAB.03-102000.CloningandExpressionofHaemophilusSomnusTransferrin-BindingProteinspatent00053765WO.11.MorgenthauA，PogoutseA，AdamiakP，MoraesTF，SchryversAB.2013.Bacterialreceptorsforhosttransferrinandlactoferrin：molecularmechanismsandroleinhost-microbeinteractions.FutureMicrobiology8：1575-1585.12.CalmettesC，YuR-H，SilvaLP，CurranD，SchriemerDC，SchryversAB，MoraesTF.2011.Structuralvariationswithinthetransferrinbindingsiteontransferrinbindingprotein，TbpB.JournalofBiologicalChemistry286：12683-12692.13.MoraesTF，YuR-H，StrynadkaNC，SchryversAB.2009.Insightsintothebacterialtransferrinreceptor：thestructureoftransferrinbindingproteinBfromActinobacilluspleuropneumoniae.MolecularCell35：523-533.14.CalmettesC，AlcantaraJ，SchryversAB，MoraesTF.2012.Thestructuralbasisoftransferrinironsequestrationbytransferrinbindi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