本发明属于中药提取技术领域，涉及一种水解法制备去苯甲酰基芍药苷的方法及其医药用途具体涉及通过芍药苷碱水解制备去苯甲酰基芍药苷的方法及其制备促凝血药物中的用途。
背景技术：
芍药苷(Paeoniflorin)是一种双环单萜糖苷类化合物，是中药材白芍和赤芍的主要活性成分，具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛等功效以及抗肿瘤和增强免疫力等多种药理作用，并能扩张冠脉血管，对抗急性心肌缺血，治疗缺血性脑血管疾病。现有技术对芍药苷的口服药代动力学研究表明，芍药苷口服生物利用度很低，仅为3-4％。造成芍药苷口服生物利用度低的主要原因是芍药苷口服后在肠道细菌分泌的β-葡萄糖苷酶和酯酶的催化下转化成了芍药苷的代谢产物Ⅰ和Ⅱ。但是，并没有证据表明在体内发挥药理作用的是芍药苷还是其代谢产物。因此，为了提高药物的生物利用度，有必要对芍药苷进行结构修饰或者其衍生物进行进一步的研究。
沈阳药科大学的徐秀玲利用羧酸酯酶对芍药苷进行水解，通过硅胶柱色谱纯化了水解产物，鉴定其为去苯甲酰基芍药苷(Debenzoylpaeoniflorin)，但该制备方法工艺较为繁琐，工业适用性低，且并没有对去苯甲酰基芍药苷进行相关活性研究。本发明旨在提供一种制备工艺更为简单，产品纯度更高的去苯甲酰基芍药苷的制备方法及其医药用途。
技术实现要素：
为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的是通过碱水解的方法对芍药苷进行结构修饰得到去苯甲酰基芍药苷，该方法主要包括芍药苷碱水解、萃取除杂及结晶等步骤，最终获得了纯度>98％的去苯甲酰基芍药苷，通过药理学研究发现其具有显著的促凝血活性。本发明所述去苯甲酰基芍药苷的制备方法工艺简单易行且工业适用性强，制备得到的去苯甲酰基芍药苷具有显著的促凝血活性。其可以为该药物进一步开发成相关新药提供思路及数据支持。其中去苯甲酰基芍药苷的结构式如下所示：
本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供一种水解法制备去苯甲酰基芍药苷的方法，其具体包括如下步骤：
①芍药苷碱水解：准确称取纯度98％的芍药苷并将其加入到0.1～2M的氢氧化钠溶液中，控制溶液温度为20～80℃并搅拌反应，反应30min后即得芍药苷碱水解液，其中氢氧化钠溶液与芍药苷的体积质量比为100:1～10:1；
②萃取除杂：将①得到的芍药苷碱水解液用酸溶液pH调至1.5，搅拌10min后过滤，滤液加入相同体积的中等极性有机溶剂萃取两次，萃余相用碱溶液调节pH值至中性，得到中性溶液；
③结晶：将步骤②得到中性溶液浓缩至干膏，用中等极性的有机溶剂回流溶解后过滤，将滤液减压浓缩至原体积的1/5～1/2，缓慢冷却析出类白色粉末，过滤、干燥后得到去苯甲酰基芍药苷。
本发明对步骤①碱水解的温度进行了优选，优选地，水解所需的温度为30～60℃。温度太低反应缓慢，温度太高容易发生副反应，降低产物收率和纯度。
本发明对步骤②中所用的中等极性有机溶剂进行了优选，优选地，萃取所用的中等极性有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯或正丁醇中的一种或多种。考虑到溶剂毒性，选择了毒性较小的这三种溶剂。
本发明对步骤③中所用的中等极性有机溶剂进行了优选，步骤③所述溶解所用中等极性有机溶剂为乙醇、丙酮、氯仿或乙酸乙酯中的一种。优选地，溶解所用的中等极性有机溶剂为乙醇或丙酮中的一种或两种。去苯甲酰基芍药苷在这两种溶剂中的溶解度更合适，不仅可以获得更高的质量，而且还可以保证较高的收率。
本发明还提供一种去苯甲酰基芍药苷的医药用途，即去苯甲酰基芍药苷在制备促凝血药物中的用途。本发明实施例6实验结果发现，与空白对照组相比，芍药苷组具有较弱的促凝血活性，而去苯甲酰基芍药苷具有显著的促凝血活性，凝血时间缩短至原来的60％。
本发明与现有技术相比，存在以下优点：
1.本发明所述的水解法制备去苯甲酰基芍药苷的方法工艺简单且工业适用性强，与现有技术酶解法相比，其反应速度更快，制备成本更低；且本发明通过实验优化了芍药苷的碱 水解工艺的参数，其制备方法更经济实用。
2.本发明通过芍药苷碱水解、萃取除杂及结晶工艺步骤的组合的工艺制备得到去苯甲酰基芍药苷，其中得到的去苯甲酰基芍药苷的产品纯度更高，且本发明通过结晶的方法获得高纯度的去苯甲酰基芍药苷，与硅胶柱色谱纯化法相比制备成本更低，制备时间更节省。
3.本发明通过药理实验发现去苯甲酰基芍药苷具有显著的促凝血活性，与芍药苷相比，其促凝血活性更强。大鼠凝血时间测定实验显示，凝血时间缩短至空白对照组的60％。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例中。本发明下述实施例中，如无特别说明，所述的去苯甲酰基芍药苷的色谱检测方法为：色谱柱：Phenomenex C18(4.6mm×250mm)；流动相：乙腈-0.1％磷酸(20：80)；柱温：30℃；流速1ml/min；进样量：10μl。蒸发光散射检测器条件：Impactor：On，漂移管温度：45℃，氮气流速：1.5L/min。通过面积归一化方法计算纯度。
实施例1一种水解法制备去苯甲酰基芍药苷的方法
称取纯度98％的芍药苷10g，加入0.1M的氢氧化钠溶液500ml，在30℃条件下搅拌反应30min得到芍药苷碱水解液。水解液用盐酸调节pH值至1.5，搅拌10min后过滤，滤液再加入相同体积的乙酸乙酯萃取两次，水相再用氢氧化钠溶液调节pH值至中性。浓缩干，加入1400mL氯仿回流溶解后过滤，将滤液减压浓缩至280ml，缓慢冷却析出类白色粉末，过滤、干燥后得到去苯甲酰基芍药苷6.2g，纯度98.3％。
实施例2一种水解法制备去苯甲酰基芍药苷的方法
称取纯度98％的芍药苷10g，加入1M的氢氧化钠溶液1000ml，在60℃条件下搅拌反应30min得到芍药苷碱水解液。水解液用盐酸调节pH值至1.5，搅拌10min后过滤，滤液再加入相同体积的乙酸丁酯萃取两次，水相再用氢氧化钠溶液调节pH值至中性。浓缩干，加入360mL无水乙醇回流溶解后过滤，将滤液减压浓缩至130ml，缓慢冷却析出类白色粉末，过滤、干燥后得到去苯甲酰基芍药苷6.4g，纯度99.0％。
实施例3一种水解法制备去苯甲酰基芍药苷的方法
称取纯度98％的芍药苷10g，加入2M的氢氧化钠溶液100ml，在20℃条件下搅拌反应30min得到芍药苷碱水解液。水解液用盐酸调节pH值至1.5，搅拌10min后过滤，滤液再加入相同体积的正丁醇萃取两次，水相再用氢氧化钠溶液调节pH值至中性。浓缩干， 加入720mL乙酸乙酯回流溶解后过滤，将滤液减压浓缩至220ml，缓慢冷却析出类白色粉末，过滤、干燥后得到去苯甲酰基芍药苷5.7g，纯度98.2％。
实施例4一种水解法制备去苯甲酰基芍药苷的方法
称取纯度98％的芍药苷10g，加入0.1M的氢氧化钠溶液200ml，在30℃条件下搅拌反应30min得到芍药苷碱水解液。水解液用盐酸调节pH值至1.5，搅拌10min后过滤，滤液再加入相同体积的乙酸乙酯萃取两次，水相再用氢氧化钠溶液调节pH值至中性。浓缩干，加入500mL丙酮回流溶解后过滤，将滤液减压浓缩至180ml，缓慢冷却析出类白色粉末，过滤、干燥后得到去苯甲酰基芍药苷6.5g，纯度99.2％。
实施例5一种水解法制备去苯甲酰基芍药苷的方法
称取纯度98％的芍药苷10g，加入0.5M的氢氧化钠溶液200ml，在80℃条件下搅拌反应30min得到芍药苷碱水解液。水解液用盐酸调节pH值至1.5，搅拌10min后过滤，滤液再加入相同体积的氯仿萃取两次，水相再用氢氧化钠溶液调节pH值至中性。浓缩干，加入450mL无水乙醇回流溶解后过滤，将滤液减压浓缩至150ml，缓慢冷却析出类白色粉末，过滤、干燥后得到去苯甲酰基芍药苷6.0g，纯度98.3％。
实施例6去苯甲酰基芍药苷的促凝血活性研究
取15只大鼠，随机分三组，每组五只，分别设空白对照组、芍药苷组、去苯甲酰基芍药苷组。其中芍药苷的纯度为98％，去苯甲酰基芍药苷为按照本发明实施例4制备得到的去苯甲酰基芍药苷。按30mg/kg静脉注射，连续给药2周。用毛细采血管从大鼠眼眶静脉丛取血10cm，每隔20S掰掉0.5cm，待出现拉丝时表明凝血，通过凝血时间的长短来计算促凝血活性，试验结果如表1所示。结果发现，与空白对照组相比，芍药苷组具有较弱的促凝血活性，而去苯甲酰基芍药苷具有显著的促凝血活性，凝血时间缩短至原来的60％，P<0.05。
表1 各组别促凝血试验结果数据表(以凝血时间s为指标)
注：＊：P<0.05，与空白对照组比较。