本发明属于医药制品
技术领域：
，涉及一种林可霉素的纯化方法，具体涉及利用二元混合萃取剂萃取林可霉素的方法。
背景技术：
：林可霉素(lincomycin)是一种碱性广谱抗生素，对大多数革兰氏阳性菌有效，临床上用于金黄色葡萄球菌、绿色链球菌、肺炎双球菌等引起的感染治疗。以林可霉素为原料药开发的克林霉素常用于败血症、呼吸道系统感染、皮肤软组织感染等多种疾病的治疗。林可霉素主要通过微生物发酵培养分离得到的一种抗生素，其分子结构中有多个手性中心，存在多个异构体，林可霉素在发酵过程中除主要产生林可霉素A组分外，还伴生少量副产物林可霉素B及林可霉素E等组分。相对林可霉素A组分，B组分抗菌活性较低，且毒性较大，这些副产物影响林可霉素为原料合成克林霉素等衍生物的收率和质量(岳晓日.盐酸林可霉素的萃取与结晶提纯，华东理工大学学报，2009，35(5)：673～676)。因此在林可霉素的生产中，需要通过一系列的纯化工艺，使得产品中的B组分含量尽可能低。林可霉素传统的提取工艺是以正丁醇为萃取剂萃取林可霉素实现工业化生产的，但该方法存在萃取效果差，溶剂操作环境差、消耗大、能耗高等缺点。目前国内外也有大量研究者报道采用吸附树脂纯化林可霉素，然而，树脂工艺纯化林可霉素存在的普遍性问题是吸附树脂再生时所需的酸、碱、水的用量很大、成本较高，因此，难以实现工业化应用。近年来，国内不少研究者研究开发了新型的萃取剂体系，如中性膦类萃取剂、混合醇类萃取剂(主要是癸醇的混合物)、肟类萃取剂、脂类萃取剂等，针对性的解决了林可霉素萃取过程中所遇到的一些问题。但是，这些萃取剂在生产过程中仍存在一些问题，如：中性膦类萃取剂价格高、毒性大；混合醇类萃取剂萃取率低，温度高，气味难闻；肟类萃取剂反萃取较难实现等；另外，这些萃取剂普遍存在萃取剂回收困难(卢珂.提取林可霉素的二元萃取剂的研究，中国抗生素杂质，2008,33(6)：338～341)。如专利CN103724380A公布采用仲辛醇作为萃取剂，具有较好的萃取效果及B组分去除效果，但仲辛醇沸点较高，不利于重复回收率用，以致其工艺成本加大。因此，开发新型的萃取剂具有重要的现实意义和应用价值。林可霉素的萃取剂的选择应满足萃取率高、选择性好的基本要求外，仍需兼顾损耗、能耗、安全、是否易回收等多方面因素。以苯甲醇与二氯甲烷为二元萃取体系除具备单一溶剂萃取体系的选择性高、分离效果好和适应性强的特点外，还具有纯化收率高，林可霉素副产物(如B组分等杂质)去除效果好等优点。技术实现要素：本发明针对现有技术的不足，提供了一种林可霉素的纯化方法，特别是林可霉素发酵液的纯化方法，该方法具有简单易行，成本较小，杂质成分去除率高的特点，且能够适用于工业化生产。为解决上述技术问题，本发明提供了一种林可霉素发酵液的纯化方法，包含以下步骤：①使用苯甲醇和二氯甲烷混合物为二元萃取剂对发酵液进行萃取，收集有机相；②对步骤①所收集有机相使用酸性纯化水进行反萃取，收集水相，得到反萃取液；③将反萃取液浓缩后用丙酮结晶。根据本发明一些实施例，苯甲醇所占二元萃取剂体积比为50％-80％。根据本发明一些实施例，步骤①所述的发酵液经过了过滤、浓缩。根据本发明一些实施例，步骤①所述的发酵液的pH为10-12。根据本发明一些实施例，步骤②所述反萃取时pH为1-3。根据本发明一些实施例，步骤①萃取和步骤②反萃取时发酵液的温度控制在10-30℃。在一些实施方案中，本发明提供了一种林可霉素发酵液的纯化方法，由以下步骤组成：(1)将林可霉素发酵液的pH调节至3-5，过滤，得到滤液；(2)将滤液的pH调节至9-11，超滤，得透过液；(3)将透过液通过纳滤膜浓缩5-10倍，得到浓缩液；(4)将浓缩液的pH调节至10-12，加入发酵液体积20％-100％的苯甲醇和二氯甲烷混合物为二元萃取剂对发酵液进行萃取，收集有机相；(5)在步骤(4)得到的有机相中加入纯化水，调节溶液的pH为1-3后进行反萃取，收集水相，得到反萃液；(6)对步骤(5)得到的反萃液进行减压浓缩5-20倍，向浓缩液中加入2-10倍体积的丙酮进行结晶，干燥后即得粗品。根据本发明一些实施例，苯甲醇所占二元萃取剂体积比为50％-80％。根据本发明一些实施例，步骤(4)萃取和步骤(5)反萃取时温度控制在10-30℃。根据本发明一些实施例，步骤(5)反萃取中纯化水的加入量为有机相体积的25％-50％。根据本发明一些实施例，步骤(4)萃取和/或步骤(5)反萃取，可以是一次，也可以重复多次。本发明中所述的“重复多次”是指萃取和/或反萃取过程重复操作2～5次，例如萃取过程重复操作3次，反萃取过程重复操作3次；或萃取过程重复操作4次，反萃取过程重复操作4次；或萃取过程重复操作3次，反萃取过程重复操作4次。本发明所述的“加入发酵液体积20％-100％的苯甲醇和二氯甲烷混合物为二元萃取剂对发酵液进行萃取”，其中“20％～100％”为一次或多次萃取加入的苯甲醇和二氯甲烷混合物的总量为发酵液体积的20％～100％。本发明所述的“纯化水的加入量为有机相体积的25％-50％”为一次或多次反萃取加入的纯化水的总量为有机相体积的25％-50％。本发明有益效果在于：本发明提供的林可霉素发酵液纯化的方法，可以分离发酵液中的菌体残渣、大分子杂质及大部分的酸性蛋白和碱性蛋白，减少了萃取中易出现的乳化现象产生，具有提取率高，林可霉素副产物B组分等杂质去除效果好、产品回收率高的特点，整套处理工艺无需使用树脂工艺纯化，溶剂也方便回收，可以大大节约生产成本。具体实施方式以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。实施例中所用的原料均可以通过商业途径获得。本发明中的林可霉素B组分结构及定量检测均为参考《欧洲药典7.0》。实施例1取林可霉素发酵液300Kg，加草酸调节pH至3，经板框压滤，得到滤液；用NaOH调节滤液的pH至11，将碱化液通过陶瓷超滤膜进行超滤，超滤膜的孔径为0.1μm，回流阀控制入膜压力≤1.0Mpa，温度控制在10℃～35℃，得到陶瓷膜透过液；透过液通过纳滤膜浓缩10倍，纳滤膜的孔径为0.001μm，得到纳滤浓缩液；NaOH调节纳滤浓缩液的pH至12，向浓缩液中加入1/10倍浓缩液体积的苯甲醇与二氯甲烷二元萃取剂，苯甲醇的比例为60％，搅拌30min，萃取过程中料液温度控制为30℃，静止30min后分相，收集有机相。萃余相继续加入1/10倍浓缩液体积的上述相同比例的苯甲醇与二氯甲烷二元萃取剂，搅拌30min，静止30min后分相，收集有机相，重复萃取3次；将3次萃取的有机相合并，加入1/6倍体积的纯化水，HCl调节溶液的pH至2，反萃取过程中料液温度控制为30℃，搅拌30min，静止30min后分相，收集水相；有机相中继续加入1/6体积的纯化水，HCl调节溶液的pH至2，反萃取过程中料液温度控制为30℃，搅拌30min，静止30min后分相，收集水相，重复反萃取3次；将上述3次反萃取的水相合并。对反萃液进行减压浓缩10倍，向浓缩液中加入5倍体积的丙酮进行结晶、80℃烘箱干燥得到林可霉素粗品。实施例中，料液经酸碱处理、陶瓷膜超滤后的滤液无悬浮物；加入二元萃取剂苯甲醇与二氯甲烷的第1级萃取过程中，出现少量的乳化物，第2、3级萃取过程中几乎无乳化物；烘干后的粗品经高效液相色谱检测，林可霉素的含量达到98.67％，B组分含量为0.28％，收率为95.76％。实施例2取林可霉素发酵液350Kg，加盐酸调节pH至5，经板框压滤，得到滤液；用NaOH调滤液的pH至9，将碱化液通过陶瓷超滤膜进行超滤，超滤膜的孔径为0.1μm，回流阀控制入膜压力≤1.0Mpa，温度控制在10℃～35℃，得到陶瓷膜透过液；透过液通过纳滤膜浓缩10倍，纳滤膜的孔径为0.001μm，得到纳滤浓缩液；用NaOH调节纳滤浓缩液的pH至10，向林可霉素浓缩液中一次性加入1/5倍浓缩液体积的苯甲醇与二氯甲烷二元萃取剂，苯甲醇的比例为50％，搅拌30min，萃取过程中料液温度控制为10℃，静止30min后分相，收集有机相。向萃取后的有机相中一次性加入1/4倍有机相体积的纯化水，HCl调节溶液的pH至1，反萃取过程中料液温度控制为10℃，搅拌30min，静止30min后分相，收集水相；对反萃液进行减压浓缩至20倍，向浓缩液中加入2倍体积的丙酮进行结晶、100℃烘箱干燥得到林可霉素粗品。实施例中，料液经酸碱处理、陶瓷膜超滤后的滤液无悬浮物；加入二元萃取剂苯甲醇与二氯甲烷萃取过程中，会出现一些乳化物；烘干后的粗品经高效液相色谱检测，林可霉素的含量为98.27％，B组分含量为0.25％，收率为95.87％。实施例3取林可霉素发酵液310Kg，加草酸调节pH至3，经板框压滤，得到滤液；用NaOH调节滤液的pH至11，将碱化液通过陶瓷超滤膜进行超滤，超滤膜的孔径为0.1μm，回流阀控制入膜压力≤1.0Mpa，温度控制在10℃～35℃，得到陶瓷膜透过液；透过液通过纳滤膜浓缩5倍，纳滤膜的孔径为0.001μm，得到纳滤浓缩液；纳滤浓缩液用NaOH调节pH至12，向浓缩液中加入1/4倍浓缩液体积的苯甲醇与二氯甲烷二元萃取剂，苯甲醇的比例为80％，搅拌30min，萃取过程中料液温度控制为30℃，静止30min后分相，收集有机相；萃余相继续加入1/4倍浓缩液体积的上述相同比例的苯甲醇与二氯甲烷二元萃取剂，搅拌30min，静止30min后分相，收集有机相，重复萃取4次；将4次萃取的有机相合并，加入1/8倍体积的纯化水，HCl调节溶液的pH至3，反萃取过程中料液温度控制为30℃，搅拌30min，静止30min后分相，收集水相；有机相中继续加入1/8体积的纯化水，HCl调节溶液的pH至3，反萃取过程中料液温度控制为40℃，搅拌30min，静止30min后分相，收集水相，重复反萃取4次；将上述4次反萃取的水相合并。对反萃液进行减压浓缩10倍，向浓缩液中加入10倍体积的丙酮进行结晶、50℃烘箱干燥得到林可霉素粗品。实施例中，料液经酸碱处理、陶瓷膜超滤、纳滤后的浓缩液中加入二元萃取剂苯甲醇与二氯甲烷萃取的过程中，出现少量的乳化物；烘干后的粗品经高效液相色谱检测，林可霉素的含量达到98.87％，B组分含量为0.21％，收率为95.12％。对比实施例如实施例1所述的工艺条件，考察一元萃取剂对最终产品的品质及纯化工艺收率的影响。其区别在于所用萃取剂为苯甲醇，正丁醇或二氯甲烷。不同一元萃取剂对产品品质及收率的影响如表1所示。对照实施例可以看出，常见的一元萃取剂(苯甲醇、二氯甲烷及正丁醇)对林可霉素中的B组分去除效果均较差，收率均较低，且在萃取过程中均出现大量的乳化物。表1不同一元萃取剂对产品品质及工艺收率的影响萃取剂种类苯甲醇正丁醇二氯甲烷A组分含量(％)91.2390.2889.29杂质B组分含量(％)2.231.191.06收率(％)92.1290.1385.26当前第1页1 2 3