一种莱菔素衍生物的可溶性盐及其制备方法
【专利摘要】一种莱菔素衍生化合物可溶性盐的制备方法属于抗癌化合物领域，尤其是莱菔素?谷胱甘肽结合物的可溶性盐的制备方法，莱菔素?谷胱甘肽结合物通过反应形成可溶性盐极大的提高了莱菔素?谷胱甘肽结合物的溶解度，从而而已解决给药过程中莱菔素?谷胱甘肽结合物药物浓度偏低的问题。所制备的莱菔素?谷胱甘肽结合物可溶性盐，它可以和合理量的药学上可以接受的辅料制备粉针剂，注射液，乳剂等。
【专利说明】
一种莱菔素衍生物的可溶性盐及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种莱菔素衍生化合物的可溶性盐及其制备方法，尤其是莱菔素-谷 胱甘肽结合物的可溶性盐的制备方法。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长 的正常调控导致异常增生与分化而形成的新生物。新生物一旦形成，便不再停止生长，他的 生长不受正常机体生理调节，而是破坏正常组织与器官，这一点在恶性肿瘤尤其明显。与良 性肿瘤相比，恶性肿瘤生长速度快，呈浸润性生长，易发生出血、坏死、溃疡等，并常有远处 转移，造成人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器功能受损等，最终造成患 者死亡。
[0003] 肿瘤的治疗方法有手术治疗、放射治疗和药物治疗（即化疗)等，其中化学治疗为 目前主要的治疗手段。化学治疗能治愈一部分肿瘤患者或延长患者的生命，在肿瘤治疗中 占有越来越重要地位。但是，传统的抗肿瘤药物对癌症细胞的杀灭率较低或需要较高的浓 度，因此产生了许多严重的毒副反应。随着生活水平的提高，人们对于癌症的治疗预期显著 提高，希望在治愈癌症的时候身体健康不受到很大的影响，因此，发现新的、高效抗肿瘤化 合物显得尤为迫切。
[0004] 莱菔素是中药莱菔子中提取的一种天然活性成分，与莱菔硫烷结构相近，也因此 与莱菔硫烷的抗癌效果相近。但是由于其结构不稳定，无法长期储存，严重限制了其应用。 莱菔素可与还原型谷胱甘肽等含巯基类的物质结合，使容易降解的基团被保护起来，并保 留了其抗癌活性，形成了全新的抗癌化合物。本发明的主要内容是研究了一种莱菔素衍生 物可溶性盐的制备方法，尤其是莱菔素-谷胱甘肽结合物的可溶性盐的制备方法，莱菔素-谷胱甘肽结合物通过反应形成可溶性盐极大的提高了莱菔素-谷胱甘肽结合物的溶解度， 从而而已解决给药过程中莱菔素-谷胱甘肽结合物药物浓度偏低的问题。
[0005] 本发明的具体方法和步骤如下：
[0006] 本发明的目的是提供一种莱菔素衍生物的可溶性盐的制备方法，尤其是莱菔素-谷胱甘肽结合物可溶性盐的制备方法，莱菔素-谷胱甘肽结合物的化学式为：
[0007]
[0008] 所述的可溶性盐在制备用于治疗人的肿瘤的药物中的应用。
[0009] 所述的可溶性盐在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。
[0010] 药物组合物，包含所述的可溶性盐以及药学辅料。
[0011] 所述的药物组合物，是片剂、胶囊剂、粉针剂、液剂或混悬剂等形式。
[0012] 制备所述的可溶性盐的方法，其特征在于：
[0013] (1)将莱菔素-谷胱甘肽结合物溶于1至1000体积倍的去离子水中将其溶解；
[0014] (2)在莱菔素-谷胱甘肽结合物溶液中加入0.1至10摩尔倍的碱；
[0015] (3)控制温度在0°C至80°C，搅拌1至120分钟；
[0016] (4)若反应体系固含量大于15%，则加入去离子水，将反应液固含量稀释至5%-15%之间；若反应体系固含量小于5%，则通过旋转蒸发仪浓缩反应液，至反应液固含量为 5%-15% 之间；
[0017] (5)过滤除去不溶性的杂质后，向反应液中加入0.1至500倍体积的与水互溶的有 机溶剂，控制温度在50°C至100°C，搅拌lmin至12〇11^11，1°(：/11-50°(：/11降温至-20至10°(：之 间，保持4_120h结晶产品；
[0018] (6)过滤后用无水乙醇洗涤，干燥。
[0019]步骤(2)中所描述的碱，可以为氢氧化钠，氢氧化钾，碳酸氢钠，碳酸钠，碳酸钾，碳 酸氢钾等药学上可接受的无机碱或有机碱
[0020] 所述制备方法中，所加入的与水互溶的有机溶剂可以为乙醇，甲醇，乙腈，异丙醇 等药学上可接受的有机溶剂。
[0021] 所制备的莱菔素-谷胱甘肽结合物可溶性盐，它可以和合理量的药学上可以接受 的辅料制备粉针剂，注射液，乳剂等。
【附图说明】
[0022]图1为化合物的质谱图谱。
[0023]图2为化合物的红外图谱。
[0024] 图3为化合物的1H-NMR图谱。
[0025] 图4为化合物的13C_NMR图谱。
[0026] 图5为化合物的制备色谱图谱。
【具体实施方式】
[0027]下面结合具体实施例对本发明做进一步的描述，但这些实施例的目的并不在于限 制本发明的保护范围。
[0028] 实施例1
[0029]将10g莱菔素-谷胱甘肽结合物溶于125ml去离子水中，向其中加入1.74g碳酸氢 钠，碳酸氢钠与莱菔素-谷胱甘肽结合物摩尔比1:1，50°c下搅拌30min。
[0030] 过滤除去不溶性杂质，加入700ml的无水乙醇，控制温度为75°C搅拌lh，置于梯度 降温仪中5 °C /h降温至4°C，4°C下保持72小时。
[0031] 将结晶析出固体过滤，用l〇〇ml无水乙醇洗涤3次，烘干6.5g，纯度为97.5 %的产 品。
[0032] 实施例2
[0033]将5g莱菔素-谷胱甘肽结合物溶于200ml去离子水中，向其中加入0.83g氢氧化钠， 氢氧化钠与莱菔素-谷胱甘肽结合物摩尔比2:1，室温下搅拌5min。
[0034]利用旋转蒸发仪50°C，45mbar下旋蒸将反应体系浓缩至50ml，过滤除去不溶性杂 质，加入300ml的无水甲醇，控制温度为95°C搅拌lh，置于梯度降温仪中2°C/h降温至0°C，0 °C下保持48小时。
[0035] 将结晶析出固体过滤，用50ml无水乙醇洗涤3次，烘干即得2.3g，纯度为96.1 %的 广品。
[0036] 实施例3
[0037]将15g莱菔素-谷胱甘肽结合物溶于100ml去离子水中，向其中加入2.14g碳酸钾， 碳酸钾与莱菔素-谷胱甘肽结合物摩尔比〇. 5:1，30°C下搅拌60min。
[0038] 加入去离子水100ml搅拌溶解，过滤除去不溶性杂质，加入1000ml的乙腈，控制温 度为85°C搅拌45min，置于梯度降温仪中10°C/h降温至-10°C，10°C下保持24小时。
[0039] 将结晶析出固体过滤，用150ml无水乙醇洗涤3次，烘干即得7.3g，纯度为96.8 %的 广品。
[0040] 实施例4
[00411将lg莱菔素-谷胱甘肽结合物溶于l00ml去离子水中，向其中加入0.464g氢氧化 钾，氢氧化钾与莱菔素-谷胱甘肽结合物摩尔比4:1，20°C下搅拌5min。
[0042]用旋转蒸发仪60°C，50mbar下旋蒸将反应体系浓缩至10ml，过滤除去不溶性杂质， 加入100ml的无水乙醇，控制温度为80°C搅拌60min，置于梯度降温仪中3°C/h降温至0°C，0 °C下保持72小时。
[0043] 将结晶析出固体过滤，用10ml无水乙醇洗涤3次，烘干即得0.37g，纯度为95.8 %的 广品。
[0044] 实施例5
[0045]将5g莱菔素-谷胱甘肽结合物溶于50ml去离子水中，向其中加入l.lg碳酸钠，碳酸 钠钾与莱菔素-谷胱甘肽结合物摩尔比1:1，50°c下搅拌5min。
[0046] 过滤除去不溶性杂质，加入200ml的异丙醇，控制温度为70°C搅拌30min，置于梯度 降温仪中5 °C /h降温至0 °C，0 °C下保持48小时。
[0047] 将结晶析出固体过滤，用50ml无水乙醇洗涤3次，烘干即得2.7g纯度为，95.3%的 广品。
[0048] 实施例6
[0049] -、材料和方法
[0050] 1.实验细胞系和相关化学试剂：人肺鳞癌细胞系H460购买自美国ATCC细胞库，培 养在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25%胰蛋白酶以及0.02%EDTA 常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[00511 2.化合物对H460血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的H460细胞消化成单个细 胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37 °C培养箱中培养。将化合物用无 菌去离子水溶解后，过0.22μπι滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II的最终浓度为 ΙμΜ、2μΜ、3μΜ、5μΜ、ΙΟμΜ、20μΜ和50μΜ，在Η460细胞接种培养24小时后，换成含有化合物相应 浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养细胞。再分 别培养48小时后，每孔加入20yL ΜΤΤ，在含有5%0)2的37°(：培养箱继续孵育3h后，洗净每孔 中的溶液，分别加入150yL的DMS0,摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长下的吸光度。以0小 时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度（IC50)，实验结果数据 见表1。
[0052]二、实验结果
[0053]表1显示，化合物对H460人肺鳞癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处理48小 时后，化合物对的H460细胞生长的半数抑制浓度(IC5Q)为9.116μΜ。
[0054] 实施例7
[0055] -、材料和方法
[0056] 1.实验细胞系和相关化学试剂:人宫颈癌细胞系Hela购买自美国ATCC细胞库，培 养在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25%胰蛋白酶以及0.02%EDTA 常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0057] 2.化合物对Hela血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的Hela细胞消化成单个细 胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37 °C培养箱中培养。将化合物用无 菌去离子水溶解后，过0.22μπι滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II的最终浓度为 ΙμΜ、2μΜ、3μΜ、5μΜ、ΙΟμΜ、20μΜ和50μΜ，在Hela细胞接种培养24小时后，换成含有化合物相应 浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养细胞。再分 别培养48小时后，每孔加入20yL MTT，在含有5%0)2的37°(：培养箱继续孵育3h后，洗净每孔 中的溶液，分别加入150yL的DMS0,摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长下的吸光度。以0小 时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度（IC50)，实验结果数据 见表1。
[0058] 二、实验结果
[0059]表1显示，化合物对Hela人宫颈癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处理48小 时后，化合物对的Hela细胞生长的半数抑制浓度(IC5Q)为14.92μΜ。
[0060] 实施例8
[0061] -、材料和方法
[0062] 1.实验细胞系和相关化学试剂：人肺癌细胞系Η446购买自美国ATCC细胞库，培养 在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25%胰蛋白酶以及0.02%EDTA常 规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0063] 2.化合物对H446血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的H446细胞消化成单个细 胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37 °C培养箱中培养。将化合物用无 菌去离子水溶解后，过0.22μπι滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II的最终浓度为 ΙμΜ、2μΜ、3μΜ、5μΜ、ΙΟμΜ、20μΜ和50μΜ，在Η446细胞接种培养24小时后，换成含有化合物相应 浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养细胞。再分 别培养48小时后，每孔加入20yL ΜΤΤ，在含有5%0)2的37°(：培养箱继续孵育3h后，洗净每孔 中的溶液，分别加入150yL的DMS0,摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长下的吸光度。以0小 时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度（IC50)，实验结果数据 见表1。
[0064] 二、实验结果
[0065]表1显示，化合物对H446人肺癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处理48小时 后，化合物对的H446细胞生长的半数抑制浓度（IC5Q)为6.098μΜ。
[0066] 实施例9 [0067] 一、材料和方法
[0068] 1.实验细胞系和相关化学试剂:人皮肤黑色素瘤细胞系Α375购买自美国ATCC细胞 库，培养在含10%胎牛血清的1^11-1640(取(：1〇1^)培养基中，用0.25%胰蛋白酶以及 0.02%EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0069] 2.化合物对A375血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的A375细胞消化成单个细 胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37 °C培养箱中培养。将化合物用无 菌去离子水溶解后，过0.22μπι滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II的最终浓度为 ΙμΜ、2μΜ、3μΜ、5μΜ、ΙΟμΜ、20μΜ和50μΜ，在Α375细胞接种培养24小时后，换成含有化合物相应 浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养细胞。再分 别培养48小时后，每孔加入20yL ΜΤΤ，在含有5%0)2的37°(：培养箱继续孵育3h后，洗净每孔 中的溶液，分别加入150yL的DMS0,摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长下的吸光度。以0小 时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度（IC50)，实验结果数据 见表1。
[0070] 二、实验结果
[0071] 表1显示，化合物对A375人皮肤黑色素瘤细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处 理48小时后，化合物对的A375细胞生长的半数抑制浓度（IC 5Q)为17.515μΜ。
[0072] 实施例10 [0073] 一、材料和方法
[0074] 1.实验细胞系和相关化学试剂:人乳腺癌细胞系MCF-7购买自美国ATCC细胞库，培 养在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25%胰蛋白酶以及0.02%EDTA 常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0075] 2.化合物对MCF-7血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的MCF-7细胞消化成单个 细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37 °C培养箱中培养。将化合物用 无菌去离子水溶解后，过0.22μπι滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II的最终浓度 为1以]?、2以]\1、3以]\1、5以]\1、1(^]\1、2(^]\1和5(^]\1，在]\07-7细胞接种培养24小时后，换成含有化合物 相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养细胞。 再分别培养48小时后，每孔加入20yL MTT，在含有5%0)2的37°(：培养箱继续孵育3h后，洗净 每孔中的溶液，分别加入150yL的DMSO，摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长下的吸光度。以 〇小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度(IC50)，实验结果数 据见表1。
[0076]二、实验结果
[0077]表1显示，化合物对MCF-7人乳腺癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处理48 小时后，化合物对的MCF-7细胞生长的半数抑制浓度（IC5Q)为9.599μΜ。
[0078] 实施例11
[0079] -、材料和方法
[0080] 1.实验细胞系和相关化学试剂:人非小细胞肺癌细胞系Α549购买自美国ATCC细胞 库，培养在含10%胎牛血清的1^11-1640(取(：1〇1^)培养基中，用0.25%胰蛋白酶以及 0.02%EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0081 ] 2.化合物对A549血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的A549细胞消化成单个细 胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37 °C培养箱中培养。将化合物用无 菌去离子水溶解后，过0.22μπι滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II的最终浓度为 ΙμΜ、2μΜ、3μΜ、5μΜ、ΙΟμΜ、20μΜ和50μΜ，在Α549细胞接种培养24小时后，换成含有化合物相应 浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养细胞。再分 别培养48小时后，每孔加入20yL ΜΤΤ，在含有5%0)2的37°(：培养箱继续孵育3h后，洗净每孔 中的溶液，分别加入150yL的DMS0,摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长下的吸光度。以0小 时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度（IC50)，实验结果数据 见表1。
[0082] 二、实验结果
[0083]表1显示，化合物对A549人非小细胞肺癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处 理48小时后，化合物对的A549细胞生长的半数抑制浓度（IC5Q)为9.154μΜ。
[0084] 实施例12
[0085] -、材料和方法
[0086] 1.实验细胞系和相关化学试剂:人非小细胞肺癌细胞系Η1299购买自美国ATCC细 胞库，培养在含10%胎牛血清的1^11-1640(取(：1〇1^)培养基中，用0.25%胰蛋白酶以及 0.02%EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0087] 2.化合物对H1299血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的H1299细胞消化成单个 细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37 °C培养箱中培养。将化合物用 无菌去离子水溶解后，过0.22μπι滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II的最终浓度 为1以]?、2以]\1、3以]\1、5以]\1、1(^]\1、2(^]\1和5(^]\1，在!11299细胞接种培养24小时后，换成含有化合物 相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养细胞。 再分别培养48小时后，每孔加入20yL ΜΤΤ，在含有5%0)2的37°(：培养箱继续孵育3h后，洗净 每孔中的溶液，分别加入150yL的DMS0，摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长下的吸光度。以 〇小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度(IC50)，实验结果数 据见表1。
[0088] 二、实验结果
[0089]表1显示，化合物对H1299人非小细胞肺癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。 处理48小时后，化合物对的H1299细胞生长的半数抑制浓度（IC5Q)为8.333μΜ。
[0090] 实施例13
[0091] -、材料和方法
[0092] 1.实验细胞系和相关化学试剂:人肝癌细胞系HepG2购买自美国ATCC细胞库，培养 在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25%胰蛋白酶以及0.02%EDTA常 规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0093] 2.化合物对HepG2血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的HepG2细胞消化成单个 细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37 °C培养箱中培养。将化合物用 无菌去离子水溶解后，过0.22μπι滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II的最终浓度 为1以]?、2以]\1、3以]\1、5以]\1、1(^]\1、2(^]\1和5(^]\1，在他?62细胞接种培养24小时后，换成含有化合物 相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养细胞。 再分别培养48小时后，每孔加入20yL ΜΤΤ，在含有5%0)2的37°(：培养箱继续孵育3h后，洗净 每孔中的溶液，分别加入150yL的DMS0，摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长下的吸光度。以 〇小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度(IC50)，实验结果数 据见表1。
[0094] 二、实验结果
[0095]表1显示，化合物对HepG2人肝癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处理48小 时后，化合物对的IfepG2细胞生长的半数抑制浓度（IC5Q)为8.776μΜ。
[0096] 实施例14
[0097] 一、材料和方法
[0098] 1.实验细胞系和相关化学试剂:人TNBC亚型的乳腺癌细胞系MDA-MB-453购买自美 国ATCC细胞库，培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25%胰蛋白 酶以及0.02%EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0099] 2.化合物对MDA-MB-453血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的MDA-MB-453细胞 消化成单个细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37°C培养箱中培养。 将化合物用无菌去离子水溶解后，过〇. 22μπι滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II 的最终浓度为1以]?、2以]\1、3以]\1、5以]\1、1(^]\1、2(^]\1和5(^]\1，在]\?从-]\?-453细胞接种培养24小时后， 换成含有化合物相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离 子水培养细胞。再分别培养72小时后，每孔加入20yL ΜΤΤ，在含有5%0)2的37°C培养箱继续 孵育3h后，洗净每孔中的溶液，分别加入150yL的DMSO，摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长 下的吸光度。以〇小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度 (IC50)，实验结果数据见表1。
[0100] 二、实验结果
[0101]表1显示，化合物对MDA-MB-453人肝癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处理 72小时后，化合物对的MDA-MB-453细胞生长的半数抑制浓度(IC5Q)为3.08μΜ。
[0102] 实施例15
[0103] 一、材料和方法
[0104] 1.实验细胞系和相关化学试剂:人TNBC亚型的乳腺癌细胞系MDA-MB-231购买自美 国ATCC细胞库，培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25%胰蛋白 酶以及0.02%EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0105] 2.化合物对MDA-MB-231血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的MDA-MB-231细胞 消化成单个细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37°C培养箱中培养。 将化合物用无菌去离子水溶解后，过〇. 22μπι滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II 的最终浓度为1以]?、2以]\1、3以]\1、5以]\1、1(^]\1、2(^]\1和5(^]\1，在]\?从-]\?-231细胞接种培养24小时后， 换成含有化合物相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离 子水培养细胞。再分别培养72小时后，每孔加入20yL ΜΤΤ，在含有5%0)2的37°C培养箱继续 孵育3h后，洗净每孔中的溶液，分别加入150yL的DMS0，摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长 下的吸光度。以〇小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度 (IC50)，实验结果数据见表1。
[0106] 二、实验结果
[0107] 表1显示，化合物对MDA-MB-231人肝癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处理 72小时后，化合物对的MDA-MB-231细胞生长的半数抑制浓度（IC 5Q)为8.71μΜ。
[0108] 实施例16 [0109] 一、材料和方法
[0110] 1.实验细胞系和相关化学试剂:人TNBC亚型的乳腺癌细胞系MDA-MB-436购买自美 国ATCC细胞库，培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25%胰蛋白 酶以及0.02%EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0111] 2.化合物对MDA-MB-436血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的MDA-MB-436细胞 消化成单个细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37°C培养箱中培养。 将化合物用无菌去离子水溶解后，过〇. 22μπι滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II 的最终浓度为1以]?、2以]\1、3以]\1、5以]\1、1(^]\1、2(^]\1和5(^]\1，在]\?从-]\?-436细胞接种培养24小时后， 换成含有化合物相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离 子水培养细胞。再分别培养72小时后，每孔加入20yL ΜΤΤ，在含有5%0)2的37°C培养箱继续 孵育3h后，洗净每孔中的溶液，分别加入150yL的DMSO，摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长 下的吸光度。以〇小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度 (IC50)，实验结果数据见表1。
[0112] 二、实验结果
[0113] 表1显示，化合物对MDA-MB-436人肝癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处理 72小时后，化合物对的MDA-MB-436细胞生长的半数抑制浓度（IC 5Q)为3.45μΜ。
[0114] 实施例17
[0115] -、材料和方法
[0116] 1.实验细胞系和相关化学试剂:人TNBC亚型的乳腺癌细胞系MDA-MB-468购买自美 国ATCC细胞库，培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25%胰蛋白 酶以及0.02%EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0117] 2.化合物对MDA-MB-468血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的MDA-MB-468细胞 消化成单个细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37°C培养箱中培养。 将化合物用无菌去离子水溶解后，过〇. 22μπι滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II 的最终浓度为1以]?、2以]\1、3以]\1、5以]\1、1(^]\1、2(^]\1和5(^]\1，在]\?从-]\?-468细胞接种培养24小时后， 换成含有化合物相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离 子水培养细胞。再分别培养72小时后，每孔加入20yL ΜΤΤ，在含有5%0)2的37°C培养箱继续 孵育3h后，洗净每孔中的溶液，分别加入150yL的DMSO，摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长 下的吸光度。以〇小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度 (IC50)，实验结果数据见表1。
[0118] 二、实验结果
[0119] 表1显示，化合物对MDA-MB-468人肝癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处理 72小时后，化合物对的MDA-MB-468细胞生长的半数抑制浓度（IC 5Q)为3.59μΜ。
[0120] 实施例18
[0121] -、材料和方法
[0122] 1.实验细胞系和相关化学试剂:人ER+亚型的乳腺癌细胞系MCF-7购买自美国ATCC 细胞库，培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25%胰蛋白酶以及 0.02%EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0123] 2.化合物对MCF-7血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的MCF-7细胞消化成单个 细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37 °C培养箱中培养。将化合物用 无菌去离子水溶解后，过0.22μπι滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II的最终浓度 为1以]?、2以]\1、3以]\1、5以]\1、1(^]\1、2(^]\1和5(^]\1，在]\0 7-7细胞接种培养24小时后，换成含有化合物 相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养细胞。 再分别培养72小时后，每孔加入20yL ΜΤΤ，在含有5%0)2的37°(：培养箱继续孵育3h后，洗净 每孔中的溶液，分别加入150yL的DMSO，摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长下的吸光度。以 〇小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度(IC50)，实验结果数 据见表1。
[0124] 二、实验结果
[0125] 表1显示，化合物对MCF-7人肝癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处理72小 时后，化合物对的MCF-7细胞生长的半数抑制浓度（IC 5Q)为3.48μΜ。
[0126] 实施例19
[0127] 一、材料和方法
[0128] 1.实验细胞系和相关化学试剂：人ER+亚型的乳腺癌细胞系ZR-75-1购买自美国 ATCC细胞库，培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25%胰蛋白酶 以及0.02%EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0129] 2.化合物对ZR-75-1血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的ZR-75-1细胞消化成 单个细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37 °C培养箱中培养。将化合 物用无菌去离子水溶解后，过0.22μπι滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II的最终 浓度为ΙμΜ、2μΜ、3μΜ、5μΜ、ΙΟμΜ、20μΜ和50μΜ，在ZR-75-1细胞接种培养24小时后，换成含有 化合物相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养 细胞。再分别培养72小时后，每孔加入20yL MTT，在含有5^^02的37°(：培养箱继续孵育3h 后，洗净每孔中的溶液，分别加入150yL的DMSO，摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长下的吸 光度。以〇小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度（IC50 )，实 验结果数据见表1。
[0130]二、实验结果
[0131] 表1显示，化合物对ZR-75-1人肝癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处理72 小时后，化合物对的ZR-75-1细胞生长的半数抑制浓度（IC 5Q)为2.82μΜ。
[0132] 实施例20
[0133] 一、材料和方法
[0134] 1.实验细胞系和相关化学试剂：人ER+亚型的乳腺癌细胞系ZR-75-1购买自美国 ATCC细胞库，培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25%胰蛋白酶 以及0.02%EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0135] 2.化合物对ZR-75-1血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的ZR-75-1细胞消化成 单个细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37 °C培养箱中培养。将化合 物用无菌去离子水溶解后，过0.22μπι滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II的最终 浓度为ΙμΜ、2μΜ、3μΜ、5μΜ、ΙΟμΜ、20μΜ和50μΜ，在ZR-75-1细胞接种培养24小时后，换成含有 化合物相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养 细胞。再分别培养72小时后，每孔加入20yL MTT，在含有5^^02的37°(：培养箱继续孵育3h 后，洗净每孔中的溶液，分别加入150yL的DMS0，摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长下的吸 光度。以〇小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度（IC50 )，实 验结果数据见表1。
[0136] 二、实验结果
[0137] 表1显示，化合物对ZR-75-1人肝癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处理72 小时后，化合物对的ZR-75-1细胞生长的半数抑制浓度（IC 5Q)为2.82μΜ。
[0138] 实施例21
[0139] -、材料和方法
[0140] 1.实验细胞系和相关化学试剂:人HER2+亚型的乳腺癌细胞系Sk-br-3购买自美国 ATCC细胞库，培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25%胰蛋白酶 以及0.02%EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0141 ] 2.化合物对Sk-br-3血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的Sk-br-3细胞消化成 单个细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37 °C培养箱中培养。将化合 物用无菌去离子水溶解后，过0.22μπι滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II的最终 浓度为ΙμΜ、2μΜ、3μΜ、5μΜ、ΙΟμΜ、20μΜ和50μΜ，在sk-br-3细胞接种培养24小时后，换成含有 化合物相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养 细胞。再分别培养72小时后，每孔加入20yL MTT，在含有5^^02的37°(：培养箱继续孵育3h 后，洗净每孔中的溶液，分别加入150yL的DMS0，摇床震荡10min，测定每孔490nm波长下的吸 光度。以〇小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度（IC50 )，实 验结果数据见表1。
[0142] 二、实验结果
[0143] 表1显示，化合物对Sk-br-3人肝癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处理72 小时后，化合物对的Sk-br-3细胞生长的半数抑制浓度（IC5Q)为2.82μΜ。
[0144] 表1为结构式II在多种肿瘤细胞中的48小时的1(：50值
[0145] 表2为结构式II在不同亚型乳腺癌中72小时的1(：50值
[0146] 表1
[0147]
【主权项】
1. 一种莱菔素衍生物的可溶性盐，其化学式如下：2. 权利要求1所述的化合物在制备用于治疗人的肿瘤的药物中的应用。3. 权利要求1所述的化合物在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。4. 药物组合物，包含权利要求1所述的化合物以及药学辅料。5. 按照权利要求4所述的药物组合物，是片剂、胶囊剂、粉针剂、液剂或混悬剂形式。6. 制备如权利要求1所述的一种莱菔素衍生物的方法，其特征在于： (1) 将莱菔素-谷胱甘肽结合物溶于1至1000体积倍的去离子水中将其溶解； (2) 在莱菔素-谷胱甘肽结合物溶液中加入0.1至10摩尔倍的碱； (3) 控制温度在0 °C至80 °C，搅拌1至120分钟； (4) 若反应体系固含量大于15%，则加入去离子水，将反应液固含量稀释至5%-15%之 间；若反应体系固含量小于5 %，则通过旋转蒸发仪浓缩反应液，至反应液固含量为5 % -15%之间； (5) 过滤除去不溶性的杂质后，向反应液中加入0.1至500倍体积的与水互溶的有机溶 剂，控制温度在50°C至100°C，搅拌Imin至12〇11^11，1°(：/11-50°(：/11降温至-20至10°(：之间，保 持4-120h结晶产品； (6) 过滤后用无水乙醇洗涤，干燥。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于:有机溶剂为乙醇，甲醇，乙腈或异丙醇。8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于:碱为氢氧化钠，氢氧化钾，碳酸氢钠，碳酸 钠，碳酸钾或碳酸氢钾。
【文档编号】A61K31/145GK106008663SQ201610320397
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月15日
【发明人】袁其朋, 王忠鹏, 程立, 姚越, 田桂芳, 况鹏群, 任萌, 刘玉婷
【申请人】北京化工大学