一种冰胶支架及其制备方法和用途与流程

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种冰胶支架及其制备方法和用途，更具体地，涉及可溶解、大体积、贯通性多孔冰胶组织工程支架及其制备方法，以及利用此冰胶支架大规模扩增细胞和无损收集细胞、构建体外三维细胞培养微环境和体外三维类组织的方法，和将此类组织用于细胞生物学、组织工程、体外药物检测、病理学和药理学研究的方法。

背景技术：

医疗行业目前面临两大难点问题：器官捐赠无法满足临床患者需求；新药研发高投入、高风险却成功率低。因此，体外构建大型化组织器官模型用于临床移植、以及构建细胞组织模型用于药物筛选和评价，是再生医学的迫切目标。不论哪一种研究，都需要首先实现对细胞的体外长时间大量培养。然而因体外缺乏血管网机制，无法持续满足氧气和营养物质的有效输送，体外细胞大量培养仍然止步不前。构建体外细胞大量增殖培养的模式，是解决器官疾病、药物筛选评价的基石，对发展再生医疗领域具有重要意义。

再者，两维细胞培养已经发展了上百年，在各个生命科学领域有广泛应用。但是两维细胞培养存在许多固有的缺陷，为了弥补这些缺陷，近年来开始发展出了三维细胞培养技术。但是，三维细胞培养技术还存在许多问题，例如水凝胶型三维细胞培养机械性能差，不适合长期大规模培养，更无法用于反应器培养，而支架型三维细胞培养的光学性能和结构性能较差，透明度低，细胞装载量小且迁移距离受限，并且常常无法溶解，导致在应用中遇到很多困难。因此，急需开发出性能更加优异的三维细胞培养技术，以满足细胞培养、体外病理/药理/生理细胞结构体构建、药物检测和组织工程与再生医学的需要。

技术实现要素：

本发明提供了一种支架(例如细胞培养支架、组织工程支架等)及其制备方法，所述支架具备多种优点，例如透明、可溶解、大体积、机械性能好，可用于大规模的三维细胞培养，例如在反应器中的细胞培养。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种冰胶支架(例如细胞培养支架、组织工程支架)的制备方法，其包括以下步骤：

(a)将冰胶原料、氯化钙各自配成溶液后，再混合制得到冰胶前体溶液；

(b)将所得冰胶前体溶液注入模具中；

(c)将装载有所述冰胶前体溶液的模具进行梯度冷却，得到预凝胶三维结构体；

(d)以真空冷冻干燥的方式干燥步骤(c)中得到的所述预凝胶三维结构体，得到冰胶支架。

采用上述方法所得的冰胶支架经本领域常规紫外照射消毒后即可使用。所得冰胶支架具备多种优点，例如透明、可溶解、大体积、机械性能好，可用于大规模的三维细胞培养，例如在反应器中的细胞培养。

本发明所述的冰胶支架制备方法中，在步骤(a)中，所述冰胶原料选自以下一种或多种物质：明胶及其衍生物、海藻酸盐(例如海藻酸钠、海藻酸钙)及其衍生物、琼脂、基质胶、胶原、蛋白多糖、糖蛋白、透明质酸、壳聚糖、层粘连蛋白、纤维连接蛋白和纤维蛋白。

其中，所述冰胶原料溶液的质量浓度为1-20％；所述冰胶原料优选海藻酸钠，并配制成质量浓度1％-5％，更优选质量浓度为2.5％。所述氯化钙溶液的质量浓度为0.1-4％；或者所述氯化钙配制成浓度为5-30mM的溶液，优选浓度为5-10mM，更优选10mM。所述冰胶原料溶液与氯化钙溶液混合体积比为(0.2-20):1，优选(0.5-10):1，更优选(1-5):1。

本发明所述的冰胶支架制备方法中，在步骤(b)中，可通过注射器(例如1ml规格)将所得冰胶前体溶液注入模具中。

本发明所述的冰胶支架制备方法中，在步骤(b)中，所述模具选自圆形培养皿、6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板或384孔等规格的细胞培养板。

本发明所述的冰胶支架制备方法中，在步骤(c)中，所述梯度冷却为：将模具冷却至2-6℃(例如约4℃)保存0.5-3h(例如约2小时)，继续冷却至-10--30℃(例如约-20℃)保存6-15h(例如8-12小时)。

本发明所述的冰胶支架制备方法中，在步骤(d)中，所述真空冷冻干燥的温度为：-20--40℃，优选-25--35℃，更优选-30℃；所述真空冷冻干燥的压力为1-50Pa，优选2-4Pa，更优选3Pa；所述真空冷冻干燥的时间为20-40h，优选24h。

作为本发明优选的实施方式，所述冰胶支架的制备方法包括如下步骤：

(a)将质量浓度2.5％海藻酸钠溶液与10mM氯化钙溶液以2:1的体积比例混合，得到冰胶前体溶液；

(b)使用1ml一次性无菌注射器将所述冰胶前体溶液注入96孔板；

(c)将装载有所述冰胶前体溶液的96孔板冷却至4℃并保存2-2.5小时，再于-20℃保存8-12小时，得到预凝胶三维结构体；

(d)将步骤(c)中得到的所述预凝胶三维结构体在-30℃、3Pa的条件下进行真空冷冻干燥24h，得到冰胶支架。

本发明还提供上述方法得到的冰胶支架。一些实施方案中，所述冰胶支架的孔隙率为10％-99％，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或其任意区间。

在一些实施方案中，所述冰胶支架的孔径为1至300微米，例如5-250微米、10-250微米、20-200微米、50-200微米等。

在一些实施方案中，所述冰胶支架的平均孔径为1至300微米，例如5-250微米、10-250微米、20-200微米、50-200微米等。

在一些实施方案中，所述冰胶支架是透明的，优选地其透明度为20％-100％、30％-95％、40％-90％、50％-90％，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或其任意区间。

在一些实施方案中，所述冰胶支架的体积为0.01-1000mm³，优选0.1-500mm³、0.2-400mm³、0.3-300mm³、0.4-200mm³、0.5-100mm³、1-100mm³、2-100mm³、或2-50mm³，例如0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、50、100、200、500mm³或其任意区间。

在一些实施方案中，所述冰胶支架的吸水量为理论体积的1-15倍、1-10倍、1-5倍、1-3倍、2-10倍、2-5倍等。

在一些实施方案中，所述冰胶支架装载的细胞量为10²/cm³-10⁸/cm³，优选10⁴/cm³-10⁸/cm³、10⁵/cm³-10⁸/cm³或10⁶/cm³-10⁸/cm³，例如10²/cm³、10³/cm³、10⁴/cm³、10⁵/cm³、10⁶/cm³、10⁷/cm³、10⁸/cm³或其任意区间。

在一些实施方案中，所述冰胶支架具有良好的弹性，例如具有0.1至10kPa的杨氏模量，例如0.1、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10或其任意区间，在压缩时，本发明的冰胶支架表现出至少60％、70％、80％、90％、95％、98％或者更高的压缩应变而不发生永久形变或者机械破坏，在外力撤除时仍能恢复原有的形状；

在一些实施方案中，所述冰胶支架具有良好的机械性能，例如本发明的冰胶支架相比于常规凝胶表述出更高的机械稳定性。

本发明还提供了上述方法所得冰胶支架在如下方面中的用途：(1)制备用于治疗疾病或病症的材料；(2)制备组织修复或再生的材料；(3)制备矫形或整形的材料；(4)药物开发、药物筛选、药物检测或药物测试；(5)构建药理模型、病理模型、组织/器官模型或肿瘤模型。

本发明还提供上述方法所得冰胶支架在细胞三维培养中的具体应用。

本发明还提供一种细胞三维培养方法，将细胞接种于培养基中得到细胞混悬液，再将细胞混悬液施加于上述冰胶支架内进行三维培养。

本发明所述细胞三维培养方法中，所述细胞选自以下的一种或更多种细胞：神经细胞、血管细胞、内皮细胞、成纤维细胞、全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞、免疫细胞、软骨细胞、骨来源细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肝细胞、肝来源的干细胞或祖细胞、肝巨噬细胞、星状细胞、胆管上皮细胞、肿瘤细胞、肝窦内皮细胞和其他各种组织和器官来源细胞。其中，所述全能干细胞为小鼠胚胎来源全能干细胞和诱导性全能干细胞，优选已建立的全能干细胞系和/或可商业购得的，更优选不直接来源于胚胎。在某些实施方案中，所述全能干细胞是非人的全能干细胞。

本发明所述细胞三维培养方法中，所述培养基为本领域技术人员所熟知的适用于细胞生长的培养基，例如DMEM、1640等。

本发明所述细胞三维培养方法中，所述三维培养的方式包括在静态培养、悬浮培养、振荡培养、灌流培养。其中，所述灌流培养是指将装有细胞混悬液的冰胶支架置于生物反应器(例如多流道生物反应器)中进行培养。

在本发明的一些实施方案中，生物反应器由人工合成生物材料制备。优选地，所述人工合成生物材料为如下材料中的至少一种：聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙交酯、聚乙交酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯或聚氧化乙烯。优选为聚酰胺，更优选为尼龙12。

本发明所述细胞三维培养方法中，所述多流道生物反应器是通过选择性激光烧结技术制成的，优选地通过包括以下步骤的方法制得：

(1)将设计的多流道生物反应器的三维数据(例如CAD数据)切分为单层薄片；

(2)重涂覆辊碾压活塞，将原料(例如尼龙12)粉末推为薄层；

(3)采用红外线烧结所述原料粉末表面，使之成为设计的构型底层；

(4)活塞调降位置，进入下一层结构的烧结；

(5)重复以上(2)到(4)的步骤，直至所有的薄片都完成烧结；

(6)将步骤(5)所得薄片浸入氢氧化钠溶液(例如，1N浓度的NaOH)中30分钟，改善表面亲水性能；

(7)将步骤(6)得到的薄片分别置于乙醇(例如，70％浓度的乙醇)中2小时，以及紫外下照射过夜；

(8)将步骤(7)所得的薄片通过粘合剂(例如浆糊)黏合接触面；

(9)将步骤(8)所得薄片外表面涂敷硅凝胶材料，放置24小时干燥。

进一步优选，所述多流道生物反应器由包括以下步骤的方法制备：

(1)使用三维CAD设计所述多流道生物反应器；

(2)将如上所述设计的三维CAD数据切分为单层薄片；

(3)重涂覆辊碾压活塞，将尼龙12粉末推为薄层；

(4)采用红外线烧结尼龙12粉末表面，使之成为设计的构型底层；

(5)活塞调降位置，进入下一层结构的烧结；

(6)重复以上3)到5)的步骤，直至所有的薄片都完成烧结，从而完成CAD设计的结构；

(7)将分散的三层如(6)中所述得到的生物反应器结构浸入1N浓度的氢氧化钠溶液中20-40分钟(例如30分钟)；

(8)将经过(7)步骤的三层反应器结构分别置于60-80％乙醇(例如70％)中1-3小时(例如2小时)，以及紫外下照射过夜；

(9)将经过(8)步骤的三层反应器通过浆糊黏合接触面；

(10)将经过(9)步骤的生物反应器外表面涂敷硅凝胶材料(Baskooku，来自日本Semedain公司)，放置24小时干燥，从而得到本发明的三层多流道生物反应器。

上述方法所得多流道生物反应器，其包含：

多个具有正六边形截面的培养腔体，和

分别与每个培养腔体流体连通的多个流通管道，

其中所述培养腔体在所述多流道生物反应器中呈蜂窝状排布。

所述培养腔体用于放置上述方法制备得到的冰胶支架，并由其培养得到细胞三维培养物。

在一些实施方案中，各个所述培养腔体内压力损耗一致，整个生物反应器内部传质一致。

本发明还提供了上述方法得到的细胞三维培养物。

本发明还提供上述细胞三维培养物在制备用于治疗疾病或病症、组织修复或再生以及矫形或整形的植入物中的用途。

本发明所述的冰胶支架具有可溶解、体积大、细胞负载高、孔隙率和通透率高、孔径大小可调节、弹性模量高以及可注射移植的特点。将其装载细胞并通过静态培养、灌流动态培养等方式进行细胞三维培养。本发明所述技术方案具有以下优点：

1、细胞植入率高

冰胶支架是由冰胶原料和氯化钙交联后，通过梯度冷冻形成的冰胶材料，具有极高的贯通孔隙率(如附图2所示)，易于细胞植入过程中的细胞贴壁附着，以及在培养过程中增殖后的细胞迁移。

2、细胞存活率高

冰胶支架的高度贯通孔隙率易于氧气传导、培养液传输；将冰胶支架进行多级化组装过程中，多流道设计和构造保证整个结构体内部传质充分，如附图4所示，利于细胞生长，在培养中保持较高存活率。在负载细胞培养物时，显著地改善了细胞培养物的生长，例如显著增加了细胞培养物的生长速度以及显著增加了细胞培养物的生物学活性，如附图3和5所示。

3、细胞增殖快

冰胶支架自身的高度贯通孔隙率以及高效的多级组装模式，从微观到宏观实现氧气通导、传质均匀的条件，促使细胞大量增殖，如附图5所示。

4、可体外仿生复杂组织和器官的精细微结构

冰胶支架内部的孔径范围优选地为50-300微米，植入细胞可包括一种或多种细胞，形成具有多种细胞共培养环境的精细结构，是对体内复杂结构，特别是小叶、小泡和岛状结构的体外仿生结构体；将数量可控的冰胶支架多级组装成的一个宏观活性组织，是对体内复杂组织的体外仿生构建结构体。多级化组装过程中采用的多流道设计，更模拟了体内血管网络的分布，特别是对体内大型化复杂器官的体外仿生构建结构体。

5、透明

本发明的冰胶支架透明度高，如附图3所示，能够通过光学显微镜监测其所负载的细胞的生长情况并且有利于实时监测三维细胞培养的各种参数，从而有利于大规模细胞培养的控制。

6、可溶解

本发明的冰胶支架是可溶解的，，如附图5所示，非常有利于在大规模培养结束后收获细胞或者在体内实现其他预定功能。

附图说明

图1显示了本发明所述冰胶支架形成原理。

图2显示了本发明所述冰胶支架外观图及截面显微结构；其中(A)为一种示例性可溶解组织工程冰胶支架的外观图，标尺6mm；(B)为对A图所示冰胶支架标尺选取截面示意图；(C)为冰胶支架内部截面扫描电镜观察显微结构图，冰胶支架的内部结构为贯通大孔。

图3显示了本发明所述冰胶支架负载细胞并长期静态培养结果；其中，(A)为支架中细胞培养第1天、第3天、第7天光学显微镜图，以及培养第7天时支架外观图；冰胶支架呈光学透明、整体结构稳定；标尺：100um；(B)为静态培养7天后细胞死/活荧光染色图，绿色代表活细胞，红色代表死细胞。

图4显示了多流道灌流动态生物反应器设计图与实物图；其中，(A)为灌流动态生物反应器内部主体设计，1表示液体流通管道，2表示冰胶支架培养腔室；(B)为三层构建的多流道生物反应器设计图；(C)为三层构建的多流道生物反应器实物图；(D)为最终整合成形的多流道生物反应器外观实物图。

图5显示了溶解支架并收集细胞结果；其中，(A)为溶解冰胶支架后形成均匀溶液；(B)为支架溶解后收集细胞死活染色图，绿色为活细胞，红色为死细胞，标尺：200um；(C)为冰胶支架中细胞增殖情况并与二维培养细胞对照；*代表数据有显著性差异。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

术语

除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。

本文使用的术语“冰胶”是指在低于溶剂正常冰点的温度下所形成的由聚合物、蛋白质、或凝胶等构成的结构体，即通过冰冻浓缩(cryoconcentration)过程所形成的具有多孔结构的三维结构体。具体地，由于在冷冻过程中，所产生的冰晶纯度要远高于初始的溶液，那么就相当于溶液中所含的溶质被浓缩在剩余未结冰的溶液中，而溶质的浓缩又导致了剩余溶液冰点的下降，这一过程也被称为冰冻浓缩(cryoconcentration)。冰冻浓缩导致溶液的冷冻过程不是均一的，因而在最后形成的固体中溶质的分布也不是均一的。利用这一性质，先将聚合物、蛋白质、凝胶等的水溶液冷冻成固体，在冰点下保存，然后解冻，从而形成具有多孔结构的三维结构体(即冰胶)。本发明的冰胶可以由任何本领域技术人员已知可用的材料制成，包括但不限于：水凝胶、海藻酸盐、明胶、聚丙交酯、聚乙交酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactide-co-glycolide,PLGA)、胶原蛋白、Matrigel^TM、和透明质酸。

本文中使用的术语“支架”是指在体内或体外起到支持作用的结构实体，也可以称为载体、基质等。特别地，本发明的支架可用于在体内或体外负载细胞，以利于细胞的生长。更特别地，本发明的支架是多孔的、可降解的、生物相容的。最特别地，本发明的支架是由冰胶构成的。优选地，本发明的冰胶支架是组织工程支架和/或细胞培养支架。

本文中使用的术语“交联溶液”是指在冰胶形成过程中起到交联作用的溶液，其可以是本领域技术人员公知可用于使得冰胶原料发生交联从而形成冰胶的材料，例如氯化钙溶液，优选10-1000mmol^-1，更优选50-300mmol^-1，最优选80-150mmol^-1，例如100mmol^-1浓度的氯化钙溶液。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、2.5％海藻酸钠溶液的制备

将海藻酸钠(来自Sigma公司)粉末与去离子水按照质量比为2.5︰97.5的比例混合，在80℃条件下加热3小时使其均匀溶解，之后分装，于4℃(短期使用)或者-20℃(长期使用)低温保存。每次使用前在细胞培养箱中保温10min后使其融化为均匀溶液。

实施例2、冰胶支架的制备方法

一种冰胶支架的制备，包括如下步骤：

1)将实施例1中所述将海藻酸钠粉末溶于去离子水中制成2.5％均质溶液，经过45mm滤纸(Millipore)过滤灭菌；

2)将1)制备得的2mL海藻酸钠溶液与1mL氯化钙溶液(10mM)均匀混合，形成具有一定粘度的冰胶前体溶液，并装载到1mL一次性无菌注射器中；

3)将2)中的冰胶前体溶液推射注入到96孔板内，每孔装载200μl前体溶液；

4)将3)中得到的装载有冰胶前体溶液的96孔板进行梯度冷却预凝胶处理，得到预凝胶三维结构体，即：4℃保存2小时，-20℃保存过夜；

5)将4)中得到的预凝胶三维结构体在-30℃，3Pa的低温、高真空条件下干燥24小时，形成三维冰胶细胞支架；

6)将5)中得到的冰胶支架结构照射紫外45分钟后，于无菌条件下保存。

所制得的冰胶支架外观和内部结构如图2所示，其中图2(C)显示了冰胶支架内部截面扫描电镜观察显微结构。

实施例3、多流道生物反应器设计与制备

一、实验仪器和材料的准备

1、实验仪器─选择性激光烧结制造仪

使用文献“Niino T,et al.,Laser sintering fabrication of three-dimensional tissue engineering scaffold with flow channel network.Biofabrication 2011；3:034104.”中公开的(由日本Aspect公司提供，型号为RaFaEI 300)的激光烧结制造仪来制备本发明的多流道生物反应器。

2、实验材料─尼龙12(Daicel-Evonik Ltd.日本)

二、多流道生物反应器的设计与制造

该生物反应器仿生肝脏器官，首先设计了具有正六边形截面的培养腔体，空间呈蜂窝型结构，该培养腔体按照肝小叶重复组装模式排列。之后根据培养腔体的排列方式，设计了交联的流通管道，分别进入每一个培养腔体，并通过计算每一处管道内径，保证各个培养腔体内压力损耗一致，整个生物反应器内部传质一致。按照设计在CAD软件(Daicel-Evonik Ltd.)内完成制图，如图1A所示。

生物反应器的制造采用选择性激光烧结技术。具体步骤如下：

1)将如上所述设计的三维CAD数据切分为单层薄片；

2)重涂覆辊碾压活塞，将尼龙12粉末推为薄层；

3)采用红外线烧结尼龙12粉末表面，使之成为设计的构型底层；

4)活塞调降位置，进入下一层结构的烧结；

5)重复以上2)到4)的步骤，直至所有的薄片都完成烧结，最后CAD设计的结构得以完成。

6)分散的三层生物反应器结构浸入1N浓度的氢氧化钠溶液中30分钟，改善表面亲水性能；

7)将经过6)步骤的三层反应器结构分别置于70％乙醇中2小时，以及紫外下照射过夜；

8)将经过7)步骤的三层反应器通过浆糊黏合接触面；

9)将经过8)步骤的生物反应器外表面涂敷硅凝胶材料(Baskooku，来自日本Semedain公司)，放置24小时干燥。

组装成型的多流道生物反应器如图4D所示。

实施例4、使用冰胶支架静态培养细胞

将HepaRG细胞(来自Sigma公司)以10⁶/mL的密度均匀分散在细胞培养基(添加了10％FBS的DMEM(Hyclone)培养基)中。然后，将细胞混悬液(200μl)滴加在根据实施例2制备的位于96孔板中的冰胶支架内，在细胞培养箱中37℃5％CO2的条件下静态培养。结果如图3所示。图3(A)显示出支架中细胞培养第1天、第3天、第7天光学显微镜观察，以及培养第7天时支架外观。其中，冰胶支架呈光学透明、整体结构稳定。图3(B)显示静态培养7天后细胞死/活荧光染色，绿色代表活细胞，红色代表死细胞。以上结果显示，使用本发明的冰胶支架能够有效地进行细胞三维培养，不论是在支架表面还是内部均能有效保持细胞活力。

实施例5、冰胶支架的多级组装式的细胞大规模增殖培养

一、实验仪器和材料的准备

1、实验仪器─冰胶支架，多流道生物反应器

2、实验材料─HepaRG细胞，Sigma公司二、冰胶支架内细胞植入与培养

1)将HepaRG细胞以10⁶/mL的密度均匀分散在全能干细胞培养基(添加了10％FBS的DMEM(Hyclone)培养基)中；

2)将1)中的细胞混悬液(200μl)滴加在根据实施例2制备的位于96孔板中的冰胶支架内，在细胞培养箱中37℃5％CO2的条件下静置6小时；

3)将2)中载有HepaRG细胞的冰胶支架，转移至根据实施例3制备的多流道生物反应器中进行三维培养，其中三维培养为灌流培养方式；具体参数为5％CO2，37℃，采用上述1)中细胞培养基灌流培养，流速5.6ml/min，培养液中含氧率为97％(2.1×10-7mol O2/cm3)，培养时间为1周以上。

培养结束后，用含有55mM柠檬酸钠(Invitrogen)和20mM EDTA(Invitrogen)浸泡细胞结构体5min，从而使得支架溶解并收集细胞。图5(A)显示冰胶支架溶解后形成均匀溶液，图5(B)显示了支架溶解后所收集细胞的死活染色结果，绿色为活细胞，红色为死细胞，图5(C)显示冰胶支架中细胞增殖情况并与二维培养细胞进行比较。以上结果显示，相比于二维培养，本发明的冰胶支架能够有效地进行细胞三维培养，并且大大提升了细胞增殖速率。

对比例

一种冰胶支架的制备，按照实施例1所述的方法，区别在于：

步骤4)中，梯度冷却条件为：0℃保存1小时，-35℃保存过夜；

将所得冰胶支架按照实施例4所述方法培养细胞，结果为冰胶支架的孔隙率、孔隙结构大小和通透性都降低，影响了细胞负载率和细胞增殖。由此可见，采用本发明所述方案制得的冰胶支架具备较高贯通孔隙率和较大孔隙结构、负载细胞量大、利于细胞在支架中增殖和迁移的优点，可更好的用于大规模三维细胞培养。

以上描述地仅是优选实施方案，其只作为示例而不限制实施本发明所必需特征的组合。所提供的标题并不意指限制本发明的多种实施方案。术语例如“包含”、“含”和“包括”不意在限制。此外，除非另有说明，没有数词修饰时包括复数形式，以及“或”、“或者”意指“和/或”。除非本文另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的意思与本领域技术人员通常理解的相同。

本申请中提及的所有公开物和专利通过引用方式并入本文。不脱离本发明的范围和精神，本发明的所描述的方法和组合物的多种修饰和变体对于本领域技术人员是显而易见的。虽然通过具体的优选实施方式描述了本发明，但是应该理解所要求保护的本发明不应该被不适当地局限于这些具体实施方式。事实上，那些对于相关领域技术人员而言显而易见的用于实施本发明的所描述的模式的多种变体意在包括在随附的权利要求的范围内。