生物转化17α-羟基黄体酮生产11α,17α-双羟基黄体酮的提取工艺的制作方法

本发明属于生物化工技术领域，具体地说，涉及一种生物转化17α-羟基黄体酮生产11α,17α-双羟基黄体酮的提取工艺。

背景技术：

微生物羟基化反应是甾体药物生物转化类型中最重要的反应，在甾体微生物羟化反应研究中，关于C₁₁α微生物羟基化转化的报道较多，多集中在转化工艺的研究，包括培养基优化、底物增溶、转化条件等。

上海市农药研究开发的利用微生物转化17α-双羟基黄体酮生产11α,17α-双羟基黄体酮项目，菌种转化水平高，已达到工业化生产水平，产物11α,17α-双羟基黄体酮是一种生产甾体药物的关键中间体，用途广泛，如用于生产皮质激素、性激素、孕激素和螺内酯蛋白同化激素，还可用于合成可的松、强的松、黄体酮、雌烯醇、地塞米松等100余种药物。而关于这种生物转化17α-羟基黄体酮生产11α,17α-双羟基黄体酮的提取工艺，尤其是可大规模工业化应用的提取工艺尚未有报道，本发明填补了这一空缺。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种生物转化17α-羟基黄体酮生产11α,17α-双羟基黄体酮的提取工艺。提取工艺包括以下步骤：

对生物转化得到的发酵液进行提纯得到高纯度11α,17α-双羟基黄体酮晶体，包括发酵液固液分离、吸附液相中产物、萃取、浓缩、结晶、重结晶和干燥等步骤，具体如下：

(1)、发酵液经板框过滤，将固相(菌体和大部分产物)和液相(含少量产物)分离。

(2)、用吸附剂吸附发酵液固液分离所得液相中的产物，吸附剂可为活性炭、硅藻土、大孔吸附树脂等，优选2w/v％粉剂活性炭。过滤分离收集吸附剂。

(3)、将发酵液固液分离所得固相和吸附了液相产物的吸附剂合并，所得合并物简称固相物。

(4)、用萃取剂萃取固相物，每次用量值(ml)＝固相物重量值×10，萃取3次或以上， 使萃取收率＞95％，萃取液合并。萃取剂可为甲醇、丙酮、乙酸乙酯等，优选甲醇为萃取剂。

(5)、浓缩萃取液，完全去除溶剂，得到11α,17α-双羟基黄体酮粗晶体。

(7)、溶解粗晶体，溶剂可为二氯甲烷、二氯乙烷等，优选二氯甲烷。

(8)、粗晶体溶解液减压浓缩，温度在30-80℃，压力在0.09-0.020MPa，优选温度50℃、压力0.09Mpa。

(9)、浓缩液在4℃下搅拌结晶，过滤晶体，晶体烘干。重结晶的母液再减压浓缩，浓缩液在4℃下搅拌结晶，过滤晶体，晶体烘干。晶体纯度≥99％，两次结晶的产物结晶总收率≥95％。

本工艺具有操作简单、易于放大生产的优点，得到的11α,17α-双羟基黄体酮晶体纯度高。弥补了相关技术的缺失。

附图说明

图1为提取工艺流程图。

图2为不同吸附剂的吸附率图。

图3为粉剂活性炭投料量对吸附率的影响图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例1、底物和产物在各溶剂系统中的分配情况研究

分别测定17α-羟基黄体酮(底物d)和11α,17α-双羟基黄体酮(产物s)在常用溶剂氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷、DMF(二甲基甲酰胺)、甲醇、丙酮、乙酸乙酯以及水中的溶解度，为后续研究打下基础。

在50ml三角烧瓶中加入10ml溶剂，置于20℃振荡水浴锅中预热10min，向三角瓶中加入溶质，少量多次加入，直至出现少量溶质不溶解现象，此时达到饱和状态，再振荡10min，停止振荡静置片刻，取清液进行第一次液相分析，再振荡1h，停止振荡静置片刻，取清液进行第二次液相分析，两次结果具有重复性即获得饱和溶解度数据。

表1为两次测定数据的平均值，对分配情况进行分析：

在甲醇和丙酮中，11α,17α-双羟基黄体酮的溶解度明显高于17α-羟基黄体酮，分配比均大于1.5，这两种溶剂可以选作为萃取剂，其中甲醇的分配比高达2.7，是首选的萃取剂。

在二氯甲烷和二氯乙烷中，17α-羟基黄体酮的溶解度高于11α,17α-双羟基黄体酮，分配比均接近0.4，这两种溶剂可以选作为结晶步骤溶剂。

虽然底物和产物在水中的分配比达到7.46，但溶解度只有10^-3-10^-2g/L，溶解度过小，不适用于提取工艺。

表1底物和产物溶解度(单位：g/100ml)

实施例2、吸附剂筛选

由于产物在水相中有一定溶解度，大规模生产时水相中产物累积量也很可观，需要收集水相中的产物，筛选适用于吸附产物的吸附剂，共筛选7种吸附剂，分别为活性炭(4种型号，分别为粉剂、椰壳、颗粒769、颗粒781)、活性白土、硅藻土和酸性氧化铝，筛选吸附率高的吸附剂。取吸附剂1g，投入装有50ml发酵液水相的250ml具塞三角烧瓶中，于25℃水浴振荡30min，取水相分析产物含量，吸附前发酵液也分析产物含量，计算吸附率：吸附率％＝(初始含量－剩余含量)/初始含量×100

筛选到的吸附剂，对投料量进行考察，分别取吸附剂0.5g、1g、1.5g、2g、2.5g，投入装有50ml发酵液水相的250ml具塞三角烧瓶中，对应投料比为1％、2％、3％、4％、5％，于25℃水浴振荡1h，取水相分析产物含量，吸附前发酵液也分析产物含量，计算吸附率。

7种吸附剂的吸附率见图2，吸附率最佳的吸附剂为粉剂活性炭，吸附30min的吸附率达到99.5％。投料量为2w/v％的粉剂活性炭吸附1h的吸附率已接近100％，投料量达到3％后可以完全吸附(见图3)，考虑到生产成本和产生固体废料量两个因素，投料量选择2w/v％。

实施例3、萃取工艺

选用甲醇作为萃取剂。甲醇与水互溶，不能直接用于萃取发酵液。设计工艺路线：将发酵液固液分离，用2w/v％活性炭吸附液相中的产物，过滤收集活性炭，与固相合并得到待萃取固相物。用甲醇萃取上述固相物，每次用量值(ml)＝固相物重量值×10，考察萃取次数和收率。

用500ml发酵液(产物11α,17α-双羟基黄体酮8.1g；底物17α-羟基黄体酮2.4g)进行实验，固液分离后得到固相29g，液相475ml。用2w/v％活性炭吸附液相中产物，过滤收集活性炭9.5g，与固相合并得到固相物38.5g。

用甲醇萃取(385ml/次)，萃取结果见表2。从表中看，萃取2次时产物的收率就可达到近94％，萃取3次的产物收率达到97.5％，萃取4次的产物收率与萃取3次的收率接近，从生产成本考虑，采用萃取3次的工艺。

表2甲醇萃取结果

实施例4、结晶工艺

实施例2所得的萃取液约1150ml，经减压浓缩、烘干，得到粗晶体10g。

用1L二氯甲烷溶解粗晶体，50℃、0.09MPa减压浓缩至650ml左右(产物浓度1.22％，底物浓度0.32％)。浓缩液在4℃下搅拌结晶4h，过滤晶体，晶体烘干，得到晶体6.8g，分析晶体纯度达到99.4％，产物的结晶收率约为85％。

重结晶的母液约580ml，再减压浓缩至90ml左右(产物浓度1.21％，底物浓度2.21％)。浓缩液在4℃下搅拌结晶4h，过滤晶体，晶体烘干，得到晶体1.0g，分析晶体纯度达到99.0％，产物的结晶收率为85％。

两次结晶的产物结晶总收率为98％。

产物11α,17α-双羟基黄体酮和底物17α-羟基黄体酮在几种常用有机溶剂中的分配差异大，此特点大大简化了提取工艺，经图1所示的工艺流程可以得到纯度99％以上的产品晶体，产品的提取收率达到95％以上。