一种从蓬蘽中分离纯化天竺葵素花色苷单体的方法与流程

本发明涉及天然产物的分离纯化，特别涉及一种从蓬蘽中分离纯化天竺葵素花色苷单体的方法。

背景技术：

花色苷是广泛存在于果蔬中的一类水溶性色素，不同种类的花色苷结构不同，其颜色也各不相同，从而赋予了果蔬由红色、紫红到蓝色等鲜艳的色彩。近年来，大量的研究证实天然果蔬来源的花色苷具有抗氧化、抗肿瘤、预防心血管疾病、缓解糖尿病症状及控制肥胖等生物活性。天竺葵素-3-O-葡萄糖苷(Pelargonidin 3-O-glucoside，以下简称Pg3G)是花色苷中最具有代表性的化合物，具有优良的生物活性。已有研究表明，Pg3G具有抗氧化、防护氧化应激损伤等功效。因此，食物来源的Pg3G不仅可以作为天然色素用于食品加工，而且还可以作为天然抗氧化剂及功能食品因子用于保健食品的开发

蓬蘽(蔷薇科悬钩子属中空心莓组)，具有抗寒性强、果实品质优良、植株直立性和丰产性强等优点。然而，迄今为止人们对蓬蘽中的植物化学成分研究较少，未有对蓬蘽中花色苷组分的研究。本发明人在前期的研究基础上发现蓬蘽中富含花色苷，其中Pg3G为主要花色苷，其含量占总花色苷含量的85—90％左右，因此蓬蘽可以作为一种提取Pg3G的优质原料。

目前在花色苷的分离纯化研究中，主要以大孔树脂吸附洗脱和制备液相色谱技术联用为主，但制备液相这种传统分离方法无法实现对目标化合物的高效、快速分离，且耗时长，会造成死吸附，损失较大，得率较低等问题。高速逆流色谱是20世纪80年代发展起来的一种连续高效的液—液分配色谱分离技术，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，相对于传统的固—液柱色谱技术，它不用任何固态的支撑物或载体，因而避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，不仅使样品能够全部回收，回收的样品更能反映其本来的特性，特别适合于天然生物活性成分的分离。

目前还未发现使用高速逆流色谱技术从蓬蘽中分离制备天竺葵素-3-O-葡萄糖苷的研究和报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于开发利用我国蓬蘽花色苷资源，并提供一种可以从蓬蘽中大量分离制备高纯度的天竺葵素-3-O-葡萄糖苷的方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案包括以下步骤：

(1)蓬蘽花色苷提取物制备：将新鲜蓬蘽洗净，与酸性乙醇溶液混合后在25-45℃、避光条件下超声提取60-240min，真空抽率，得到的滤渣重复提取一次，合并滤液，在40-60℃下真空旋转蒸发除去乙醇，得到蓬蘽花色苷粗提液；

(2)蓬蘽花色苷上样液制备：将所得的蓬蘽花色苷粗提液用乙酸乙酯萃取，合并水相，40-60℃真空旋转蒸发除去残留的乙酸乙酯，得到蓬蘽花色苷上样液；

(3)大孔树脂预处理：用95％乙醇或者甲醇浸泡大孔树脂12-48h,然后装柱后用95％乙醇或者甲醇冲洗至流出液与水1:1混合后不浑浊为止，然后用水冲至无醇味备用；

(4)大孔树脂吸附：将所述蓬蘽花色苷上样液注入大孔树脂中，先用去离子水以冲洗树脂，再用酸性甲醇或乙醇溶液洗脱，收集红色明显的洗脱液，在40-60℃下真空旋转蒸发除去甲醇或乙醇，得到花色苷浸膏，将所述浸膏用少量的去离子水溶解，之后冷冻干燥得到蓬蘽花色苷提取物冻干粉；

(5)高速逆流色谱制备单体

将正丁醇：甲基叔丁基醚：乙腈：水：三氟乙酸置于分液漏斗中配制两相溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱的螺旋管道；在25℃下，主机正转，将流动相以3mL/min泵入，至两相溶剂在管道中达到平衡状态后；将样品用流动相溶解后，进样，在紫外检测器下检测，根据高速逆流色谱图，收集第三个波峰到波谷时间段流出的组分，即可得到天竺葵素-3-O-葡萄糖苷。

优选的，步骤(1)中的酸性乙醇是50％-95％(v/v)的乙醇溶液，且含酸0.1％-2％(v/v)，酸为盐酸、甲酸或乙酸。

优选的，步骤(1)中的第一次提取料液比在1g：4mL—1g：10mL的范围，第二次提取滤渣的料液比在1g：1mL—1g：4mL的范围，提取溶剂不变。

优选的，步骤(2)中的萃取剂为乙酸乙酯，萃取次数为2次-6次。

优选的，步骤(3)中大孔树脂为AB-8大孔树脂，其比表面积为480-520m²/g，平均孔径为13-14nm，粒径范围在0.3-1.25mm。

优选的，步骤(4)中酸性甲醇或乙醇溶液含酸0.1％-1％(v/v)，酸为盐酸、甲酸或乙酸。

优选的，步骤(5)中正丁醇：甲基叔丁基醚：乙腈：水：三氟乙酸的体积比为2：2：1：5：0.01。

优选的，步骤(5)中主机转速为650-950r/min。

优选的，步骤(5)中每次进样的样品溶液量，以蓬蘽花色苷冻干粉计为100-400mg范围内。

本发明的优点：首次公开了天竺葵素-3-O-葡萄糖苷是蓬蘽中主要花色苷，并建立了高速逆流色谱从蓬蘽中分离天竺葵素-3-O-葡萄糖苷单体的方法，所发明的方法具有进样量大、连续进样重复性好，并克服了固相载体造成的样品吸附损失等缺点，可大量制备得到高纯度的天竺葵素-3-O-葡萄糖苷，其纯度大于99％；相对于传统的提取分离纯化方法，其纯度和得率均有提升，使之能够实现工业化生产，对于开发利用我国蓬蘽资源提供新的思路。

附图说明

图1为实施例1中蓬蘽花色苷提取物的高效液相色谱图(高速逆流色谱分离前)；

图2为实施例1中蓬蘽花色苷经高速逆流色谱纯化后的高效液相色谱图；

图3为实施例1中蓬蘽花色苷高速逆流色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

(1)将1000g新鲜蓬蘽洗净，按照料液比1g：6mL的比例加入含0.1％(v/v)盐酸的70％的乙醇溶液充分混合，超声提取90min(控制温度在45℃以下，避光)，超声结束后真空抽率，得到的滤渣按上述条件重复提取一次(将料液比改为1g：4mL)，合并滤液，在40℃下真空旋转蒸发除去乙醇，得到花色苷粗提液；

(3)按所述花色苷粗提液：乙酸乙酯的体积比为1：1的比例加入乙酸乙酯萃取，静置分层，萃取四次，收集并合并水相。40℃下真空旋转蒸发除去残留乙酸乙酯，得到花色苷上样液；

(4)将乙醇浸泡24h后的AB-8大孔树脂装入层析柱中，用水洗至无醇味后，分别用4％的盐酸溶液、去离子水、4％的氢氧化钠溶液、去离子水以4BV/h冲洗后，将所述花色苷上样液以1BV/h的流速注入大孔树脂中，先用去离子水以2BV/h的流速冲洗树脂，再用含0.5％(v/v)盐酸的甲醇溶液以1BV/h的流速洗脱，收集红色明显的洗脱液，在40℃下真空旋转蒸发除去甲醇，得到花色苷浸膏，将所述浸膏用少量的去离子水溶解，之后冷冻干燥得到蓬蘽花色苷冻干粉，经计算，1000g的新鲜蓬蘽经上述步骤纯化后可得到2.81g的蓬蘽花色苷提取物冻干粉；

(5)高速逆流色谱制备天竺葵素-3-O-葡萄糖苷

将正丁醇：甲基叔丁基醚：乙腈：水：三氟乙酸按体积比为2：2：1：5：0.01置于分液漏斗中配制两相溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，将上相和下相分离后超声脱气20min。将固定相以30mL/min的流速泵入并充满高速逆流色谱的螺旋管道内，在25℃下，主机正转，转速设为800r/min，待转速稳定后将流动相以2mL/min泵入，至两相溶剂在管道中达到平衡状态后，计算固定相的保留值，使用该流动相体系保留值为48.7％。取100mg的蓬蘽花色苷冻干粉溶于5mL的下相，将新配好样品溶液注入进样管道，在紫外检测器下检测，根据逆流色谱图特征收集第三个波峰到波谷时间段流出的组分即可得到天竺葵素-3-O-葡萄糖苷，100mg蓬蘽花色苷提取物经高速逆流色谱分离收集、冷冻干燥后可得到5.33mg的天竺葵素-3-O-葡萄糖苷，HPLC检测其纯度为99.29％。

对分离得到的化合物用质谱和核磁进行结构鉴定：数据如下

质谱数据：m/z＝433.05(M⁺)，在正离子模式下检测

核磁数据：¹H NMR(600MHz,D2O):δ8.36(s,1H,H-4),7.81(d,J＝8.6Hz,2H,H-3’,H-5’),6.49(d,J＝8.7Hz,2H,H-2’,H-6’),6.30(s,1H,H-8),6.26(d,J＝1.4Hz,1H,H-6),5.03(d,J＝7.6Hz,1H,H-1glc),3.70(dd,J＝12.6,5.7Hz,1H,H-2glc),3.57(dd,J＝15.4,7.4Hz,1H,H-3glc),3.52(dd,J＝11.1,7.2Hz,1H,H-4glc),3.87(d,J＝10.9Hz,1H,H-5glc),4.13(d,J＝7.2Hz,1H,H-6a glc),4.03(d,J＝7.1Hz,1H,H-6b glc).¹³C NMR(151MHz,D2O)δ163.91(C-2),144.78(C-3),140.42(C-4),156.59(C-5),103.52(C-6),168.55(C-7),95.34(C-8),157.51(C-9),119.77(C-10),121.5(C-1’),118.63(C-2’),116.59(C-3’),162.15(C-4’),115.92(C-5’),110.35(C-6’),101.35(C-1glc),75.41(C-2glc),76.92(C-3glc),,71.52(C-4glc),81.61(C-5glc),62.17(C-6glc).

根据以上结果及相关文献报道，证实从蓬蘽中分离得到的花色苷是天竺葵素-3-O-葡萄糖苷。

实施例2

准确称取5kg新鲜蓬蘽，按照料液比1g：8mL的比例加入含0.5％(v/v)甲酸的80％的乙醇溶液充分混合，超声提取240min(控制温度在45℃以下，避光)，超声结束后用三层纱布过滤，得到的滤渣按上述条件重复提取一次(将料液比改为1g：2mL)，合并滤液，在50℃下真空旋转蒸发除去乙醇，得到蓬蘽花色苷粗提液；

按所述花色苷粗提液：乙酸乙酯的体积比为2：1的比例加入乙酸乙酯萃取，静置分层，萃取四次，收集并合并水相。在50℃下真空旋转蒸发除去残留的乙酸乙酯，得到花色苷上样液；

将乙醇浸泡24h后的AB-8大孔树脂装入层析柱中，用水洗至无醇味后，分别用4％的盐酸溶液、去离子水、4％的氢氧化钠溶液、去离子水以4BV/h冲洗后，将所述花色苷上样液以1BV/h的流速注入大孔树脂中，先用去离子水以2BV/h的流速冲洗树脂，再用含0.5％(v/v)甲酸的甲醇溶液以1BV/h的流速洗脱，收集红色明显的洗脱液，在40-50℃下真空旋转蒸发除去甲醇，得到花色苷浸膏，将所述浸膏用少量的去离子水溶解，之后冷冻干燥得到蓬蘽花色苷提取物冻干粉。

高速逆流色谱制备天竺葵素-3-O-葡萄糖苷：将正丁醇：甲基叔丁基醚：乙腈：水：三氟乙酸按体积比为2：2：1：5：0.01置于分液漏斗中配制两相溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，将上相和下相分离后超声脱气20min。将固定相以30mL/min的流速泵入并充满高速逆流色谱的螺旋管道内，在25℃下，主机正转，转速设为900r/min，待转速稳定后将流动相以3mL/min泵入，至两相溶剂在管道中达到平衡状态后，计算固定相的保留值，使用该流动相体系保留值为52.6％。取400mg的花色苷冻干粉溶于20mL的下相，将新配好样品溶液注入进样管道，在紫外检测器下检测，根据逆流色谱图特征收集第三个波峰到波谷时间段流出的组分即可得到天竺葵素-3-O-葡萄糖苷，400mg花色苷粗提物经高速逆流色谱分离收集、冷冻干燥后可得到22.8mg的天竺葵素-3-O-葡萄糖苷，HPLC检测其纯度为99.34％。

实施例3

准确称取10kg蓬蘽鲜果，按照料液比1g：10mL的比例加入含1％(v/v)盐酸的90％的乙醇溶液充分混合，超声提取240min(控制温度在45℃以下，避光)，超声结束后真空抽率，在60℃下真空旋转蒸发除去乙醇，得到蓬蘽花色苷粗提液；

按所述花色苷粗提液：乙酸乙酯的体积比为1：1的比例加入乙酸乙酯萃取，静置分层，萃取六次，收集并合并水相。在60℃下真空旋转蒸发除去残留的乙酸乙酯，得到花色苷上样液；

将乙醇浸泡24h后的AB-8大孔树脂装入层析柱中，用水洗至无醇味后，分别用4％的HCL溶液、去离子水、4％的盐酸溶液、去离子水以4BV/h冲洗后，将所述花色苷上样液以1BV/h的流速注入大孔树脂中，先用去离子水以2BV/h的流速冲洗树脂，再用含1％(v/v)盐酸的乙醇溶液以1BV/h的流速洗脱，收集红色明显的洗脱液，在60℃下真空旋转蒸发除去甲醇，得到花色苷浸膏，将所述浸膏用少量的去离子水溶解，之后冷冻干燥得到蓬蘽花色苷冻干粉；

高速逆流色谱制备天竺葵素-3-O-葡萄糖苷：将正丁醇：甲基叔丁基醚：乙腈：水：三氟乙酸按体积比为2：2：1：5：0.01置于分液漏斗中配制两相溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，将上相和下相分离后超声脱气20min。将固定相以30mL/min的流速泵入并充满高速逆流色谱的螺旋管道内，在25℃下，主机正转，转速设为700r/min，待转速稳定后将流动相以3mL/min泵入，至两相溶剂在管道中达到平衡状态后，计算固定相的保留值，使用该流动相体系保留值为48.7％。取800mg的花色苷冻干粉溶于20mL的下相，将新配好样品溶液注入进样管道，在紫外检测器下检测，根据逆流色谱图特征收集第二个波峰到波谷时间段流出的组分即可得到天竺葵素-3-O-葡萄糖苷，800mg花色苷粗提物经高速逆流色谱分离收集、冷冻干燥后可得到41.2mg的天竺葵素-3-O-葡萄糖苷，HPLC检测其纯度为99.69％。

实施例4

准确称取1kg蓬蘽鲜果，按照料液比1g：6mL的比例加入含1％(v/v)盐酸的70％的乙醇溶液充分混合，超声提取240min(控制温度在45℃以下，避光)，超声结束后得到的滤渣按上述条件重复提取一次(将料液比改为1g：4mL)，合并滤液，真空抽率，在45℃下真空旋转蒸发除去乙醇，得到蓬蘽花色苷粗提液；

按所述花色苷粗提液：乙酸乙酯的体积比为1：1的比例加入乙酸乙酯萃取，静置分层，萃取四次，收集并合并水相。在45℃下真空旋转蒸发除去残留的乙酸乙酯，得到花色苷上样液；

将乙醇浸泡24h后的AB-8大孔树脂装入层析柱中，用水洗至无醇味后，分别用4％的HCL溶液、去离子水、4％的盐酸溶液、去离子水以4BV/h冲洗后，将所述花色苷上样液以1BV/h的流速注入大孔树脂中，先用去离子水以2BV/h的流速冲洗树脂，再用含1％(v/v)盐酸的乙醇溶液以1BV/h的流速洗脱，收集红色明显的洗脱液，在45℃下真空旋转蒸发除去甲醇，得到花色苷浸膏，将所述浸膏用少量的去离子水溶解，之后冷冻干燥得到蓬蘽花色苷冻干粉；

高速逆流色谱制备天竺葵素-3-O-葡萄糖苷：将正丁醇：甲基叔丁基醚：乙腈：水：三氟乙酸按体积比为2：2：1：5：0.01置于分液漏斗中配制两相溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，将上相和下相分离后超声脱气20min。仪器开机预热30min后，将固定相以30mL/min的流速泵入并充满高速逆流色谱的螺旋管道内，在25℃下，主机正转，转速设为950r/min，待转速稳定后将流动相以3mL/min泵入，至两相溶剂在管道中达到平衡状态后，计算固定相的保留值，使用该流动相体系保留值为51.2％。取2800mg的花色苷冻干粉溶于140mL的下相，将新配好样品溶液注入进样管道，在紫外检测器下检测，根据逆流色谱图特征收集第三个波峰到波谷时间段流出的组分即可得到天竺葵素-3-O-葡萄糖苷，2800mg花色苷粗提物经高速逆流色谱分离收集、冷冻干燥后可得到113.3mg的天竺葵素-3-O-葡萄糖苷，HPLC检测其纯度为99.08％。