雨生血球藻突变株及其应用的制作方法

本申请涉及微藻工业应用领域，具体而言，涉及高产虾青素的雨生血球藻(haematococcuspluvialis)突变株及其应用。

发明背景

血球藻是一种单细胞的淡水绿藻，隶属于绿藻门(chlorophata)，绿藻纲(chlorophyeeae)，团藻目(volvoeales)，血球藻科(haematoeoeeaceae)，血球藻属(haematocoeeus)。血球藻是少数能够在人工光生物反应器中进行大规模培养的微藻之一。其中雨生血球藻(haematococcuspluvialis)，又称雨生红球藻，已经成功用于商业规模的虾青素生产。

虾青素已经被证实可以提高机体免疫力，防止紫外线(uv-a)对细胞的损伤，抑制癌细胞生长，延滞衰老过程，预防心血管疾病，因此具有巨大的医疗应用前景(hand,liy,huq.astaxanthininmicroalgae:pathways,functionsandbiotechnologicalimplications.algae,2013,28:131-147)。另外，虾青素也是大马哈鱼(salmon)的色素主要成份。对于人工养殖的大马哈鱼等，需要在饲料中添加虾青素以保证鱼肉的鲜红色泽。随着这类经济水产动物养殖业的迅速发展，市场对虾青素的需求量也迅速增长。2013年，虾青素作为鱼饲料添加剂的销售额已达五亿美元。

本领域需要高产虾青素的雨生血球藻。

发明简述

本发明人以雨生血球藻flotownies144为出发藻种，对其进行化学诱变，随后利用本发明所建立的创造性的高通量筛选方法进行筛选，获得了虾青素含量显著提高的雨生血球藻突变株。

在一方面，本发明提供了一种高通量筛选高产虾青素的微藻突变株的方法，所述方法包括：

a)对微藻的野生株或起始株进行诱变处理；

b)在多孔板中培养经诱变处理的野生株或起始株的单克隆藻株；

c)获取经培养的各单克隆藻株的图像；

d)用图像分析软件对各单克隆藻株的颜色进行分析，获得r、g、b值；

e)根据下式计算出各单克隆藻株的redindex值：

f)将redindex值高于野生株或起始株的单克隆藻株鉴定为高产虾青素的突变株。

在另一方面，本发明提供了通过本发明的方法筛选得到的高产虾青素的雨生血球藻突变株。所述高产虾青素的雨生血球藻(haematococcuspluvialis)包括于2015年12月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)保藏号为cgmccno.11806的c86，保藏号为cgmccno.11807的d154。

在另一方面，还提供了本发明的雨生血球藻突变株在制备虾青素中的应用。

在另一方面，还提供了一种组合物，其包含本发明的雨生血球藻突变株的细胞和/或本发明的雨生血球藻突变株的提取物。

附图简述

图1.示出用不同浓度ems处理后雨生血球藻flotownies144的存活百分比。

图2.示出初筛得到的76个突变株的热图及rindex值。

图3.示出野生型和突变株c86、d154在高光胁迫培养不同天数的形态学变化。

图4.示出野生型和突变株c86、d154在低光条件(第0-4天)和高光胁迫下(第5-8天)的生长曲线。

图5.示出野生型和突变株c86、d154在高光胁迫培养4天后的虾青素含量(第8天，mg/mg干重)。

图6.示出野生型和突变株c86、d154在高光胁迫培养不同天数的虾青素产率(mg/l藻液/天)。

发明详述

已有通过诱变并筛选高产虾青素血球藻突变株的报道。然而这些报道是基于类胡萝卜素生物合成抑制剂(cn101173214a)或显微观察(wo2006107736a1)的筛选方法，前者只能筛选出单一代谢途径的突变株，而且必须在选择压力下进行，后者依靠人工筛选，效率不高。

在本发明中，本发明人建立了一种高通量筛选高产虾青素微藻的方法，所述方法能够在全基因组水平上筛选由诱变造成的突变，进行无选择压力下的性状筛选，并不限于具体的代谢途径。

因此，在第一方面，本发明提供了一种高通量筛选高产虾青素的微藻突变株的方法，所述方法包括：

a)对微藻的野生株或起始株进行诱变处理；

b)在多孔板中培养经诱变处理的野生株或起始株的单克隆藻株；

c)获取经培养的各单克隆藻株的图像；

d)用图像分析软件对各单克隆藻株的颜色进行分析，获得r、g、b值；

e)根据下式计算出各单克隆藻株的redindex值：

f)将redindex值高于野生株或起始株的单克隆藻株鉴定为高产虾青素的突变株。

在一个实施方式中，所述微藻是雨生血球藻。在一具体实施方式中，所述雨生血球藻是flotownies144藻株。

雨生血球藻flotownies144是一株广泛应用于基础、应用研究的雨生血球藻株系。flotownies144的特征是在低光、营养充足的条件下，群体中以绿色的游泳细胞为主，当细胞暴露于强光或营养缺陷条件进行环境胁迫诱导时，游泳细胞开始积累虾青素，形成红色的游泳细胞。然而，nies144本身色素含量不高，每单位细胞干重的虾青素含量较低，限制了该藻株在生产中的应用。在一具体的实施方式中，通过利用本发明的高通量筛选方法，本发明人以雨生血球藻flotownies144为出发藻株，筛选到高产虾青素的突变株。

在一些实施方式中，所述方法步骤a)中所述诱变是化学诱变如ems诱变，或是辐射诱变如紫外线诱变。本领域技术人员将理解，其他的诱变方法也可应用于本发明。例如使用mnng、ntg诱变剂进行诱变，或者可以使用根瘤农杆菌或基因枪轰击方法获得经诱变的群体。或者，也可以使用不同诱变方法的组合。

本发明中，经诱变的微藻可以使用自动化高通量挑选仪器例如qpix450(moleculardevice,usa)挑选单克隆藻株。单克隆藻株可以在多孔板中培养。例如，可以在96孔板或384孔板或q-tray板中进行所述单克隆藻株的培养。所述培养可以在液体培养基中或固体培养基上进行，优选在固体培养基上进行。

在一些实施方式中，所述方法步骤b)中所述培养包括将所述单克隆藻株置于胁迫条件下培养以诱导虾青素的积累。能够诱导虾青素积累的胁迫条件包括例如高光照、高盐、高温或营养缺乏。

在一具体实施方式中，使用高光照胁迫条件诱导藻株的虾青素积累。所述高光照胁迫条件例如是100-200μmolm^-2s^-1，优选150μmolm^-2s^-1的光照强度。

在一些实施方式中，在非胁迫条件下培养所述菌株一段时间，例如0、1、2、3、4、5天后，使得藻株充分生长后再进行胁迫培养。所述非胁迫条件例如是5、10、15、20、25μmolm^-2s^-1的光照强度。所述胁迫培养进行例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天。

在一些实施方式中，单克隆藻株的图像使用例如chemidoc^tmmp成像系统(biorad,usa)获得。本领域技术人员将理解，可以使用任何能够获得电子图像如热图的系统。对图像进行颜色分析获得r、g、b值的软件也是本领域可获得的，例如getrgb软件。通过图像颜色分析使得可以容易地进行高通量筛选。

在一些实施方式中，本发明的所述方法还包括，

g)确定所述突变株的虾青素含量。

测定虾青素的方法是本领域已知的，例如通过hplc进行所述测定。虾青素含量高于野生株或起始株的突变株最终确定为高产虾青素突变株。

在另一方面，本发明提供了通过本发明上述方法获得的高产虾青素的雨生血球藻突变株。

在一些实施方式中，根据本发明的方法获得的高产虾青素的雨生血球藻突变株，其虾青素含量相对于野生型提高50-100％。

在一些实施方式中，本发明的高产虾青素的雨生血球藻突变株衍生自雨生血球藻flotownies144。

在具体的实施方式中，根据本发明的方法筛选到2个高产虾青素雨生血球藻突变株，其中藻株c86以保藏号cgmccno.11806，d154以保藏号cgmccno.11807，于2015年12月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)。

在另一个方面，本发明还涵盖本发明的雨生血球藻突变株在制备虾青素中的应用。

在另一个方面，本发明还涵盖一种组合物，其包含本发明的雨生血球藻突变株的细胞和/或本发明的雨生血球藻突变株的提取物。在一些实施方式中，所述雨生血球藻突变株的提取物包含虾青素。在一些实施方式中，所述组合物是药物组合物、食品组合物、营养补充剂或饲料。

实施例

下面将通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所描述的实施例范围中。

实施例1.血球藻的化学诱变

雨生血球藻flotownies144(购自日本国立环境研究所)培养方法如下：将生长在固体basal培养基上的单克隆藻落挑入装有10ml培养基的50ml三角瓶中培养10天，当细胞数达到3×10⁵/ml时，转接至装有100ml培养基的250ml三角瓶中，接种量为3×10⁴/ml，待细胞数生长到3×10⁵/ml时(大约3-4天)达到对数生长期，培养温度为21℃，连续光照强度为15μmolm^-2s^-1。basal培养基配方为14.6mm醋酸钠、2.7mml-天冬酰胺、2g/l酵母提取物、0.985mmmgcl2、0.135mmcacl2、0.036mmfeso4，ph6.8(kobayashi,m.,kakizono,t.&nagai,s.(1991).astaxanthinproductionbyagreenalga,haematococcuspluvialisaccompaniedwithmorphologicalchangesinacetatemedia.j.ferment.bioeng.,71:335–339)。

取一定量对数期的雨生血球藻flotownies144藻液，通过离心收集藻体，得到的藻细胞沉淀用不同浓度的甲磺酸乙酯(ems)溶液处理，ems浓度为：0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％，1.0％，1.2％，1.4％，1.6％，1.8％，2.0％(w/v)，处理时间为一个小时。ems溶液的配制需用0.2m的磷酸缓冲液进行逐级稀释配制。反应结束后加入10％na2s2o3终止反应，再用新鲜培养基将残留的na2s2o3洗去。处理完成后，加入一定量的新鲜培养基避光培养24小时后涂布于固体培养基上，接种量为1×10⁵/平板。待克隆长出计算每个ems浓度下藻细胞的萌发率。萌发率结果如图1所示。通过以上结果得知在不同浓度ems处理下雨生红球藻flotownies144的萌发率并没有明显规律，最终将ems浓度定为1％(w/v)，处理时间为1小时。

实施例2.高产虾青素突变株的筛选

2.1.基于rindex的高通量筛选

取一定量实施例1中用1％(w/v)ems处理1小时的雨生血球藻藻液涂布于固体培养基上，接种量为1×10⁵/平板。待两周后，将长出的单克隆用高通量挑选仪器qpix450(moleculardevice,usa)挑出到96孔板中，培养温度为21℃，连续光照强度为15μmolm^-2s^-1。

将上述96孔板中长出的藻液点阵到装有固体basal培养基的q-tray板上，点样体积为2μl，放入培养温度为21℃，连续光照强度为15μmolm^-2s^-1的培养架上培养两天后，将光照强度调为150μmolm^-2s^-1，胁迫五天。通过chemidoc^tmmpimagingsystem(biorad,usa)得到每个藻落的热图；用getrgb软件对每个藻落的颜色进行分析；根据下式计算出每个藻落的redindex值：

初步筛选出76个突变株。76个突变株热图及rindex值(如图2所示)。

2.2.基于分光光度法的筛选

将以上的到的76株突变体以相同的细胞数接种于250ml三角瓶中进行培养，先于低光条件下培养四天，培养温度为21℃，连续光照强度为15μmolm^-2s^-1，再于光照强度为150μmolm^-2s^-1的高光条件下胁迫培养三天，从第四天起，每天通过分光光度计法测定其色素含量。

分光光度计法测色素：每天取样1ml，离心收集后加入1mldmso混匀，静置30min后离心收集上清。反复4-5次直至沉淀变为乳白色，通过分光光度计测定上清在665nm、649nm以及480nm处的吸光度。

用以上得到的吸光度计算出每突变株的单细胞总类胡萝卜素含量，计算方法为：ca＝12.19a665－3.45a649，cb＝21.99a649－5.32a665，cx+c＝(1000a480－2.14ca－70.16cb)/220(μg/ml)；单细胞总类胡萝卜素含量为cx+c/细胞数(ca：叶绿素a；cb：叶绿素b；cx+c：总类胡萝卜素)。以此方法筛选出2株单细胞色素含量明显高于野生型的突变株：c86、d154。

所筛选到的雨生血球藻藻株c86以保藏号cgmccno.11806，d154以保藏号cgmccno.11807于2015年12月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)。

本发明的上述方法可用于高通量筛选高产虾青素的微藻突变株。

实施例3.高产虾青素突变株的培养及虾青素含量测定

将实施例2得到的2个突变株以相同的细胞数接种于250ml三角瓶中进行培养。先于低光条件下培养4天，培养温度为21℃，连续光照强度为15μmolm^-2s^-1，再于光照强度为150μmolm^-2s^-1的高光条件下胁迫培养4天。每天取10ml藻液进行真空膜过滤(glassmicrofibrefilter,696,vwr)，再用相同体积的碳酸氢铵(0.5moll^-1)溶液冲洗膜两次。随后把膜放入烘箱100℃烘干至恒重，滤膜的增量即为细胞干重。从第四天起每天观察细胞形态。再将第4天、第6天及第8天的藻样，通过hplc进行虾青素含量测定。色素提取的具体方法如下：

1.取60ml藻液用磷酸缓冲液离心去盐，收集细胞沉淀，用液氮速冻后放入冷冻干燥机中过夜干燥成藻粉。

2.称取5mg上述得到的藻粉，在预冷的研钵中用液氮研磨，加入提取液甲醇:二氯甲烷(3:1)将研钵中的色素溶出，离心收集上清，反复数次直至沉淀变为乳白色。

3.将上述得到的色素上清通过氮气吹干后，复溶到相同体积的提取液中，用hplc进行虾青素的测定。hplc测定条件如下：

alliance^tm高效液相色谱仪，配光电二极管阵列检测器(hplc-pda，waters公司)。色谱柱：symmetryc18(4.6mm×150mm，5μm)。流动相：a相为二氯甲烷:甲醇:乙腈:水(5:85:5.5:4.5，v/v)，b相为二氯甲烷:甲醇:乙腈:水(25:28:42.5:4.5，v/v)。梯度洗脱程序：0.0-8.0min，0％b；8.0-14.0min，0％–100％b；14.0-28.0min，100％b；28.0-30.0min，100％-0b；30.0-35.0min，0％b。流速：1.0ml/min。进样量：10μl。柱温：35℃。检测波长：250-700nm，以480nm为类胡萝卜素的检测波长。

两个突变株c86、d154及野生型在第4、6和第8天的形态图像见图3。从图中可见两个突变体c86、d154在第6天(高光胁迫后的第2天)即全部转化为红色厚壁孢子(呈圆形)，而野生型大多数细胞仍然为游动细胞。

两个突变体c86、d154及野生型干重增长曲线见图4。图中可见突变体d154的生长速率与野生型基本相同。

两个突变株c86、d154的虾青素含量参见图5，产率参见图6。从图中可见，本发明所获得的2个雨生血球藻突变株的虾青素含量显著高于野生型。