本发明涉及生物技术领域，具体是涉及基于磁性纳米粒子的革兰氏阴性病原菌分离方法。
背景技术：
败血症是严重的全身性感染疾病,病情复杂多变,病死率高。败血症患者血液中的病原菌主要包括革兰氏阴性病原菌和革兰氏阴病原菌。在治疗过程中，革兰氏阴性病原菌和革兰氏阴性病原菌细胞壁结构差别较大，选用药物也有一定差别。传统的鉴别败血症患者血液中病原菌种类的方法主要是血平板培养法，但该方法周期长，大概需要5-7天，在这一过程中很可能会使病人的病情进一步加重。另外，如若不对血液中病原菌进行分类，就只能使用广谱的抗菌素。近年来，随着人类广谱和超广谱抗生素的大量生产和应用，导致多重耐药菌、条件病原菌引起的各类感染增加，抗生素的选择范围缩小。目前全球细菌耐药形势空前严峻，细菌耐药已被列为威胁人类健康的三大难题之一。同时，广谱和超广谱抗菌素还会对肠道中的益生菌产生抑制作用，从而对健康产生一定的危害。因此，为了提高对败血症患者的治疗效果,在治疗前对患者血液中的病原菌种类进行鉴别，能够指导临床更加科学合理使用抗菌药物。因此，建立一种高效、快速检测革兰氏阴性病原菌的新方法显得尤为迫切。鉴于需要建立一种高效，快速的检测方法，基于功能化的磁性纳米粒子的分离技术在病原菌监测中得到了迅速发展。
临床上应用的传统鉴别革兰氏阴性病原菌和革兰氏阴性病原菌的方法，主要是血平板培养法。该方法不但周期长，而且耗费大量的人力物力。
技术实现要素：
针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种低梯度磁场下，简便、快捷，高效的磁富集分离患者血液中的革兰氏阴性病原菌的方法。
革兰氏阴性病原菌的快速分离方法，包括以下步骤：(1)吸取2ml的磁性纳米粒子(10mg/ml)，加入到8mlph＝7.4的无菌的pbs溶液中，然后在外加磁场的作用下，对磁性纳米粒子进行洗涤，重复3次，将洗涤后的磁性纳米粒子重悬于10ml无菌的pbs溶液中；(2)5.8mgedc，溶于290μl无菌的pbs中，6.5mgnhss，溶于325μl无菌的pbs中，然后将溶解后的edc和nhss加入到洗涤过的磁性纳米粒子溶液中，活化1h；(3)将活化后磁性纳米粒子用无菌的pbs洗涤3次，重悬于8ml无菌的pbs溶液中；(4)称取链霉亲和素0.5mg，溶解到100μl灭菌的pbs溶液中，然后加入到活化后的磁珠溶液中，反应2h，然后用灭菌的pbs洗涤3次，重悬于8ml灭菌的pbs溶液中得到链霉亲和素修饰的磁珠；(5)称取10mg刀豆蛋白a，溶于400μl灭菌的pbs溶液中，1mg长链生物素，溶于100μl灭菌的pbs溶液中，然后将溶解后的长链生物素加入到溶解的刀豆蛋白a中，孵育2h，用30kda的超滤管在8℃、3000rpm条件下冷冻离心，用10个体积灭菌的pbs不断清洗，得到生物素化的刀豆蛋白a；(6)将生物素化的刀豆蛋白a加入到链霉亲和素修饰的磁珠中，孵育45min；(7)反应完毕后，用无菌的pbs洗涤3次，重悬于10ml无菌的pbs溶液中，得到终浓度为2mg/ml的刀豆蛋白a-磁性纳米粒子复合物，用于富集革兰氏阴性病原菌。(8)取10ml待测样品溶液，加入1mg刀豆蛋白a-磁性纳米粒子复合物，置于培养箱上，以200rpm的转速37℃孵育45min；插入磁力架分离6min；(9)磁分离后，无菌pbs溶液清洗后，用无菌的pbs缓冲液重悬即得富集有革兰氏阴性病原菌-刀豆蛋白a-磁性纳米粒子复合物。
所述半刀豆球蛋白，其分子量为102000da。
所述纳米磁性纳米粒子粒径为180nm，表面羧基。
刀豆蛋白a通过氨基与长链生物素的活泼酯反应脱去n-羟基琥珀酰亚胺，使二者相连，然后长链生物素的另一端生物素与磁珠表面的链霉亲和素相连，刀豆蛋白a与革兰氏阴性病原菌表面甘露型的糖结合时，通过天冬氨酸的两个氧原子作为受体与糖的6-oh和4-oh形成氢键、天冬酰胺的氮原子作为供体与糖的3-oh形成氧键、甘氨酸的主链和单糖的3-oh形成氢键。
具体原理见图1。
本方法适用于富集分离复杂复杂基质中分离革兰氏阴性病原菌，如裂解血，血清，以及全血样品。
采用本发明技术方案具有如下有益效果：
1、本发明采用的是180nm的磁性纳米粒子，主要用于血液中目标菌的快速富集，而采用30nm或者50nm纳米磁珠结合树状分子的富集方法是用于磁信号的放大。
2、本发明采用的刀豆蛋白a是传统的商业药物，相比于抗体，具有稳定好，成本低，质量可控等优点。基于上述优点，在单次分离过程中，本发明构建的分离刀豆蛋白a-磁性纳米粒子复合物在成本上比免疫磁分离陈本降低了151倍；在材料保存方面比免疫磁珠保质期也更长。
3、在败血症患者血液中，是多种致病菌共存的环境。本发明采用的刀豆蛋白a是广谱的识别革兰氏阴性菌的分子识别剂，用于分离基质中的革兰氏阴性菌是一种通用的分离策略，可以将基质中的大多数革兰氏阴性菌都分离出来，然后通过聚合酶链式反应(pcr)或者选择性培养进行鉴别。相比之下，抗体因其只能专一的识别，从而分离出对应的目标菌，其他存在于血液中的致病菌无法鉴别。
4、本发明借助了链霉亲和素和长链生物素作为介导，具有很好的灵活性，有利于刀豆蛋白a分子与革兰氏阴性病原菌表面的甘露糖复合物分子相连。相比于直接偶联的方法，该方法分离革兰氏阴性病原菌能力更强，特别适用于分离全血样本中革兰氏阴性病原菌的分离。
5、本方案为将链霉亲和素先偶联在磁性纳米粒子表面，然后再将生物素化的刀豆蛋白a分子偶联于链霉亲和素包被的磁性纳米粒子上，避免了常规方法中将刀豆蛋白a分子偶联于磁珠表面或者直接将刀豆蛋白a分子直接接在磁性纳米粒子表面，导致刀豆蛋白a分子活性降低和空间位阻大的缺点。
6、本发明在分离过程中，引入了链霉亲和素和长链生物素作为介导，增加了刀豆蛋白a分子与磁性纳米粒子接触的机会，使得磁性纳米粒子表面可以偶联更多的刀豆蛋白a分子，从而大大增加了革兰氏阴性病原菌表面结合的磁性纳米粒子的数量，实现了在低磁场下快速分离所捕获的革兰氏阴性病原菌。与传统的磁分离方法相比，该方法更适用于复杂基质革兰氏阴性病原菌的分离，提高了复杂基质样品中革兰氏阴性病原菌分离效率。
7、磁性纳米粒子偶联刀豆蛋白a时，一般采用疏水吸附或化学偶联方式将具有活性的刀豆蛋白a联接在磁性纳米粒子表面。刀豆蛋白a与磁性纳米粒子表面距离太近，磁性纳米粒子本身性质及其表面残留的疏水或强亲水基团容易引起刀豆蛋白a空间构象发生改变，导致刀豆蛋白a生物活性下降。然而本实验方案在偶联过程中引入链霉亲和素和长链生物素作为介导，其具有一定的空间长度，从而使刀豆蛋白a分子远离磁性纳米粒子和磁性纳米粒子表面，避免了磁性纳米粒子本身性质及表面对刀豆蛋白a分子的影响。同时，引入聚乙二醇却不会影响刀豆蛋白a分子的空间构象，从而起到了保护刀豆蛋白a分子生物活性的作用。
附图说明
图1本发明所涉及的磁分离技术的操作流程图；
具体实施方式
为了使本发明更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
磁性纳米粒子(180nm)购买于美国上海奥润有限公司。
长链生物素(sulfo-nhs-lc-biotin)，购买于赛默飞世尔科技公司。
刀豆蛋白a分子购买于上海源叶生物科技有限公司。
n-羟基丁二酰亚胺nhss,乙基3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐edc等均为常规试剂，不再赘述。
0.01mpbs配制方法：8.0gnacl、0.2gkcl、0.24gkh2po4、1.44gna2hpo4溶解于800ml蒸馏水中，用5mnaoh调整ph至7.4，再定容至1000ml即得0.01mpbs。
实施例1
1.刀豆蛋白a-磁性纳米粒子复合物合成，按照如下步骤制备:
(1)吸取2ml的磁性纳米粒子(10mg/ml)，加入到8mlph＝7.4的无菌的pbs溶液中，然后在外加磁场的作用下，对磁性纳米粒子进行洗涤，重复3次，将洗涤后的磁性纳米粒子重悬于10ml无菌的pbs溶液中；(2)5.8mgedc，溶于290μl无菌的pbs中，6.5mgnhss，溶于325μl无菌的pbs中，然后将溶解后的edc和nhss加入到洗涤过的磁性纳米粒子溶液中，活化1h；(3)将活化后磁性纳米粒子用无菌的pbs洗涤3次，重悬于8ml无菌的pbs溶液中；(4)称取链酶亲和素0.5mg，溶解到100μl灭菌的pbs溶液中，然后加入到活化后的磁珠溶液中，反应2h，然后用灭菌的pbs洗涤3次，重悬于8ml灭菌的pbs溶液中，加入0.3％bsa封闭45min，然后用灭菌的pbs洗涤3次，重悬于8ml灭菌的pbs溶液中，得到链酶亲和素修饰的磁珠；(5)称取10mg刀豆蛋白a，溶于400μl灭菌的pbs溶液中，1mg长链生物素，溶于100μl灭菌的pbs溶液中，然后将溶解后的长链生物素加入到溶解的刀豆蛋白a中，孵育2h，用30kda的超滤管在8℃、3000rpm条件下冷冻离心，用10个体积灭菌的pbs不断清洗，得到生物素化的刀豆蛋白a；(6)将生物素化的刀豆蛋白a加入到链酶亲和素修饰的磁珠中，孵育45min；(7)反应完毕后，用无菌的pbs洗涤3次，重悬于10ml无菌的pbs溶液中，得到终浓度为2mg/ml的刀豆蛋白a-磁性纳米粒子复合物，用于富集革兰氏阴性病原菌。
2.富集捕获：取待测样品溶液10ml，加入1mg刀豆蛋白a-磁性纳米粒子复合物，置于混匀仪上，以200rpm的转速室温孵育45min形成革兰氏阴性病原菌-刀豆蛋白a-磁性纳米粒子复合物；将离心管插入常规磁力架分离6min；
3.去离子水轻轻清洗后，用pbs缓冲液重悬即得革兰氏阴性病原菌-刀豆蛋白a-磁性纳米粒子复合物。
实施例2富集效果实验
(1)取1ml浓度为105cfu/ml的革兰氏阴性病原菌于1.5ml无菌离心管中，12000rpm离心5min，弃上清，用等体积无菌pbs溶液重悬。
(2)富集捕获：取待测样品溶液10ml，加入1mg刀豆蛋白a-磁性纳米粒子复合物，置于混匀仪上，以200rpm的转速室温孵育45min形成革兰氏阴性病原菌-刀豆蛋白a-磁性纳米粒子复合物；将离心管插入常规磁力架分离6min；
(3)磁分离后，将上清液转入无菌离心管中，而分离得到的革兰氏阴性病原菌-刀豆蛋白a-磁性纳米粒子复合物则用pbs清洗两次，混合均匀，并用1ml无菌pbs溶液重悬革兰氏阴性病原菌-刀豆蛋白a-磁性纳米粒子复合物。
(4)捕获率计算：将各组富集的革兰氏阴性病原菌重悬液进行梯度稀释后，用平板对每个梯度计数，通过捕获效率公式计算革兰氏阴性病原菌的捕获效率，每次实验重复三次。各组捕获效率的计算公式如下：[被富集吸附的菌落总数/(上清液中菌落总数+被富集吸附的菌落总数)]×100％。
捕获率如下：
实验结果表明，刀豆蛋白a-磁性纳米粒子复合物的捕获革兰氏阴性病原菌效率达到90.2％，这说明刀豆蛋白a分子可以很好的与革兰氏阴性病原菌在短时间内就能分离富集较多的革兰氏阴性病原菌。
实施例3
待测样品为无菌裂解血，加入革兰氏阴性病原菌调节菌落浓度至105cfu/ml备用。
将制备好刀豆蛋白a-磁性纳米粒子复合物(1mg)分别加入到样品溶液(10ml)中，置于混匀仪上，以200rpm的转速室温孵育45min。然后常规磁力架分离6min。磁分离后，将上清液转入无菌离心管中，而分离得到的革兰氏阴性病原菌-刀豆蛋白a-磁性纳米粒子复合物则用无菌pbs清洗两次，混合均匀，并用1ml无菌pbs溶液重悬革兰氏阴性病原菌-刀豆蛋白a-磁性纳米粒子复合物。捕获效率如实施例2方法获得，其余同实施例2。结果见表1，表明本方案能高效富集分离样品中的革兰氏阴性病原菌。
实施例4
待测样品为无菌血清，加入革兰氏阴性病原菌调节菌落浓度至105cfu/ml。其余同实施例3。
实施例5
待测样品为无菌全血，加入革兰氏阴性病原菌调节菌落浓度至105cfu/ml。其余同实施例3。
表1不同实际样品中革兰氏阴性病原菌分离效果的比较
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。