一种木瓜酶制剂的产业化制备方法及其应用与流程

本发明涉一种脂肪酶的产业化制备方法及其应用，具体涉及一种木瓜酶制剂的产业化制备方法及其应用。

背景技术：

木瓜乳中具有木瓜蛋白酶，木瓜肽酶b，木瓜凝乳蛋白酶a，木瓜凝乳蛋白酶b等丰富的酶类，其中木瓜蛋白酶已被广泛的应用于食品、医药、日化等行业。1991年giordani等首先报道了木瓜乳具有水解甘油三脂的功能，并且发现其具有水解功能的主要成份是番木瓜乳中的水不溶的成分即木瓜脂肪酶(caricapapayalipase，cpl)。因为它与木瓜中的水不溶的类似于橡胶的物质以矩阵的形式嵌和，人们称之为“天然固定化酶”。

目前，cpl是木瓜蛋白酶生产的副产物，cpl以固体形式存在降低了木瓜蛋白酶的纯度。cpl不仅存在于木瓜乳中，也存在于番木瓜树的枝和叶中。由于病毒和细菌等疾病，番木瓜树必须在1到2年间翻新种植，造成世界范围类的7百万吨的废弃物，严重的影响环境，因此，对这些废弃物进行深度开发、产业化回收提取木瓜酶制剂，特别是木瓜脂肪酶，并积极拓展其应用，具有重要的经济价值和环保价值。

目前较为常用的cpl的提取方法，主要是通过缓冲液反复洗涤去除木瓜乳中的水溶性蛋白酶类，离心回收cpl，cpl的得率为木瓜乳重量的2.50％左右，脂肪酶酶活为350u/g左右。该方法虽然可以完全去除木瓜乳中的水溶性的酶类，但是需要耗费大量的水电，且处理量小，一般仅适用于实验室及样品试制，难以适应产业化制备的要求。同时，该方法将水溶性蛋白酶类有效成分作为废弃物，造成较大的资源浪费。

奶味香基是具有奶香气的添加剂，是食品工业中使用最为广泛的食用香精之一，主要用于糖果、蜜饯、饮料、冰淇淋及焙烤食品等的增香。此外，奶味香基还可用于饲料工业中。cpl目前已经被报道应用于催化合成人造母乳替代物，结构酯，芳香酯，生物柴油和药物中间体的手性拆分等，但是尚未有将cpl应用于产业化制备奶味香基的报道。

酶法制备奶味香基主要是指以稀奶油、牛奶等为原料，通过脂肪酶的作用将甘油三酯酶解成饱和及不饱和脂肪酸、酮酸和羟酸，形成多种风味成分的前体物质，经过自然的氧化、断裂、内酯化等反应生成一系列风味物质。因此以奶油为原料，通过脂肪酶水解作用得到酶解奶油，再加以适当修饰，即可得到天然奶味香精。脂肪酶已被报道应用于制备奶味香基，尤其是诺维信生产的商品酶palatase20000l。同时，脂肪酶，蛋白酶和其它酶复配的复合酶制剂对提高奶味香基的香气丰度具有重要的作用。

技术实现要素：

本发明是针对现有技术中的不足，而提供一种木瓜酶制剂的产业化制备方法及其应用，实现木瓜脂肪酶的规模化工业生产，生产工艺紧凑、过程易控、综合能耗低，产品质量稳定，可以使用同一批原材料得到的木瓜脂肪酶和木瓜蛋白酶，且大幅提高酶制剂的得率和酶活。

本发明还提供了木瓜脂肪酶应用于天然奶味香基制作的方法，将木瓜脂肪酶应用于天然奶基的制备中，实现具有独特香味的天然香精的制备。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种木瓜酶制剂的产业化制备方法，包括以下步骤：

(1)设置无油空气压缩机、弹簧式安全阀ts、带压力传感器和玻璃转子流量计的储罐、压力表、板框压滤机、80目滤布、回流管、第一喷雾干燥机、与第二喷雾干燥机；所述弹簧式安全阀分别连接无油空气压缩机与板框压滤机，所述压力表分别连接储罐以及板框压滤机，储罐还通过回流管与板框过滤机相连接，所述80目滤布设置于板框压滤机中，所述第一喷雾干燥机与板框压滤机相连接；

(2)新鲜木瓜乳乳液倒入储罐中，加压通入板框压滤机中；

(3)无油空气压缩机对板框过滤机加压，木瓜乳通过板框过滤机，固体成分留在板框过滤机中，逐渐形成滤饼，滤液通过回流管回收至储罐中，所述滤饼即为木瓜脂肪酶；

(4)重复步骤(3)，直至滤液变为不含乳白色固形物的浅黄色液体，收集滤液；

(5)将滤液加入第一喷雾干燥机中，出料温度控制在68℃至72℃之间，直接对滤液进行喷雾干燥，得到的固体粉末即为木瓜蛋白酶；

(6)将滤饼与等体积的水混合，加入第二喷雾干燥机中干燥，得到的固体粉末即为木瓜脂肪酶。

作为本发明的进一步改进，所述步骤(2)中新鲜木瓜乳乳液是由-20℃冷冻木瓜乳溶解而得的。

作为本发明的进一步改进，所述步骤(2)与(3)中新鲜木瓜乳乳液进入板框过滤机的压力分为若干阶段，第一阶段采用低压，进料压力为0.12mpa，运行时间2-3h，第二阶段采用中压，进料压力为0.18mpa，运行时间3-4h。

作为本发明的进一步改进，所述步骤(5)中滤液的入口温度为115℃-135℃，优选为135℃。

一种将采用上述方法制备的木瓜脂肪酶应用于天然奶味香基制作的方法，包括以下步骤：

(1)将一定比例的稀奶油与pbs缓冲液混合，加入单硬脂酸甘油酯，加热至60-80℃搅拌，充分乳化后形成第一混合液；

(2)降温至30℃-60℃，往步骤(1)制得的第一混合液中添加一定量的木瓜脂肪酶，在空气浴恒温摇床中恒温反应4-16h；

(3)将步骤(2)所得产物升温至85-90℃灭酶30min，均质乳化，所得即为木瓜脂肪酶制备的天然奶味香基。

作为本发明的进一步改进，所述木瓜脂肪酶的添加量为稀奶油质量的0.5％-10％；

作为本发明的进一步改进，所述稀奶油与pbs缓冲液的质量比例为1:1-3:1，所述pbs缓冲液的ph值为8.0-9.0。

作为本发明的进一步改进，所述稀奶油与单硬脂酸甘油酯之间的质量比例为150:1-250:1。

本发明的优点在于：

(1)本发明提供的木瓜酶制剂制备方法，通过板框过滤与喷雾干燥两步法，分别分离制备木瓜脂肪酶和木瓜蛋白酶，生产工艺紧凑、过程易控、综合能耗低，产品质量稳定，可以使用同一批原材料得到的木瓜脂肪酶和木瓜蛋白酶，且大幅提高酶制剂的得率和酶活；与通过缓冲液反复洗涤去除木瓜乳中的水溶性蛋白酶类的木瓜脂肪酶制备方法相比，产率高，酶活力回收率高，且可以同时制备木瓜脂肪酶和木瓜蛋白酶，水电消耗大大减小，非常适合工业产业化制备；

(2)采用木瓜脂肪酶制得的天然奶味香基，具有独特的香气，与现有常用的palatase20000l相比，酸味更加突出，可以用于调制独特风味的奶味产品。

下面结合附图与具体实施方式，对本发明进一步详细说明。

附图说明

图1为本发明的工艺流程示意图；

图2为本发明采用实施例1制得的木瓜脂肪酶与palatase20000分别制得的奶味香基的香味评价图；

图3为本发明实施例1制得的木瓜脂肪酶酶解奶味香基、palatase20000l酶解奶味香基、与稀奶油原料的固相微萃取总离子图。

其中，无油空气压缩机1、弹簧式安全阀2、压力传感器31、转子流量计32、储罐3、压力表4、板框压滤机5、回流管6、第一喷雾干燥机7、第二喷雾干燥机8。

具体实施方式

实施例1

请参照图1，本实施例提供一种木瓜酶制剂的产业化制备方法，包括以下步骤：

(1)设置vw-0.42/7无油空气压缩机1(排气压力0.7mpa，容积流量0.42m3/min)、a27w-10t弹簧式安全阀(ts)2、带3251.072.090压力传感器31和lzj玻璃转子流量计32的50l储罐3、压力表4、bms0.5/290-ub增强聚丙烯板框压滤机5(过滤面积0.5m²，滤室总容积7.5l)、80目滤布、回流管6、第一喷雾干燥机7、与第二喷雾干燥机8；所述弹簧式安全阀2分别连接无油空气压缩机1与板框压滤机5，所述压力表4分别连接储罐3以及板框压滤机5，储罐3还通过回流管6与板框过滤机5相连接，所述80目滤布设置于板框压滤机中，所述第一喷雾干燥机7与板框压滤机5相连接；

(2)将-20℃冷冻木瓜乳溶解，得到新鲜木瓜乳乳液，将其倒入储罐3中，加压通入板框压滤机5中；

(3)无油空气压缩机1对板框过滤机5加压，木瓜乳通过板框过滤机5，第一阶段采用低压，进料压力为0.12mpa，运行时间3h，第二阶段采用中压，进料压力为0.18mpa，运行时间3h，6h共处理30kg的木瓜乳，固体成分留在板框过滤机5中，逐渐形成滤饼，滤液通过回流管回收至储罐3中，所述滤饼即为木瓜脂肪酶；

(4)重复步骤(3)，直至滤液变为不含乳白色固形物的浅黄色液体，收集滤液；

(5)将滤液加入第一喷雾干燥机中，入口温度为135℃，出料温度控制在68℃至72℃之间，直接对滤液进行喷雾干燥，得到的固体粉末即为木瓜蛋白酶；

(6)将滤饼与等体积的水混合，加入第二喷雾干燥机中干燥，得到的固体粉末即为木瓜脂肪酶。

本实施例还提供一种将采用上述方法制备的木瓜脂肪酶应用于天然奶味香基制作的方法，包括以下步骤：

(1)将50g稀奶油与ph值为9.0的pbs缓冲液混合，稀奶油与pbs缓冲液比例为2:1，加入250mg的单硬脂酸甘油酯，加热至60℃搅拌，充分乳化后形成第一混合液；

(2)降温至45℃，往步骤(1)制得的第一混合液中添加稀奶油质量的1.5％的木瓜脂肪酶，在空气浴恒温摇床中恒温反应6h；

(3)将步骤(2)所得产物升温至85℃灭酶30min，均质乳化，所得即为木瓜脂肪酶制备的天然奶味香基。

实施例2

本实施例与实施例1基本相同，其区别在于：所述木瓜酶制剂的产业化制备方法步骤(5)中的入口温度为125℃，其他步骤与实施例1相同，在此不再赘述。

实施例3

本实施例与实施例1基本相同，其区别在于：所述木瓜酶制剂的产业化制备方法步骤(5)中的入口温度为115℃，其他步骤与实施例1相同，在此不再赘述。

将实施例1-3制得的木瓜脂肪酶进行对比，比较不同的物料入口温度对木瓜脂肪酶制备的影响，计算得率、比酶活、脂肪酶回收率与含水量，其中，得率(％)＝喷干木瓜脂肪酶重量/木瓜乳的重量×100％，酶活回收率(％)＝(喷干木瓜脂肪酶重量*比酶活)/(木瓜乳的重量*比酶活)×100％，将结果列表如下：

由上表可见，物料入口温度越高，cpl的得率越高，脂肪酶的总回收率也越高。入口温度越高，料液在喷雾干燥时雾化的液滴与热空气充分接触后，雾滴干燥速度越快，水分蒸发速度越快，水分含量越低，越不易黏壁，所以得率就会越高。同时，入口温度越高蒸干的时间就越短，高温对cpl的酶活力影响就越小，总脂肪酶回收率就越高，最优的物料入口温度条件为135℃。在最优物料入口温度条件下，木瓜脂肪酶的得率为木瓜乳总重的4.12％，木瓜脂肪酶的比酶活为167.60u/g，木瓜脂肪酶的酶活力回收率为88.53％，同时测得喷干的木瓜脂肪酶中有蛋白酶酶活，为1.59×10⁶u/g，蛋白酶酶活力回收率为27.52％。同样的工艺喷雾干燥滤液，木瓜蛋白酶的得率为木瓜乳总重量的8.02％。木瓜蛋白酶的比酶活为2.01×10⁶u/g，蛋白酶酶活力回收率为54.34％。

实施例4

本实施例提供一种木瓜酶制剂的产业化制备方法，包括以下步骤：

(1)设置vw-0.42/7无油空气压缩机(排气压力0.7mpa，容积流量0.42m3/min)、a27w-10t弹簧式安全阀(ts)、带3251.072.090压力传感器31和lzj玻璃转子流量计32的50l储罐、压力表、bms0.5/290-ub增强聚丙烯板框压滤机(过滤面积0.5m²，滤室总容积7.5l)、80目滤布、回流管、第一喷雾干燥机、与第二喷雾干燥机；所述弹簧式安全阀分别连接无油空气压缩机与板框压滤机，所述压力表分别连接储罐以及板框压滤机，储罐还通过回流管与板框过滤机相连接，所述80目滤布设置于板框压滤机中，所述第一喷雾干燥机与板框压滤机相连接；所述第二喷雾干燥机与第一喷雾干燥机相连接；

(2)将-20℃冷冻木瓜乳溶解，得到新鲜木瓜乳乳液，将其倒入储罐中，加压通入板框压滤机中；

(3)无油空气压缩机1对板框过滤机加压，木瓜乳通过板框过滤机，第一阶段采用低压，进料压力为0.12mpa，运行时间2h，第二阶段采用中压，进料压力为0.18mpa，运行时间4h，6h共处理30kg的木瓜乳，固体成分留在板框过滤机中，逐渐形成滤饼，滤液通过回流管回收至储罐中，所述滤饼即为木瓜脂肪酶；

(4)重复步骤(3)，直至滤液变为不含乳白色固形物的浅黄色液体，收集滤液；

(5)将滤液加入第一喷雾干燥机中，入口温度为135℃，出料温度控制在68℃至72℃之间，直接对滤液进行喷雾干燥，得到的固体粉末即为木瓜蛋白酶；

(6)将滤饼与等体积的水混合，加入第二喷雾干燥机中干燥，得到的固体粉末即为木瓜脂肪酶。

本实施例还提供一种将采用上述方法制备的木瓜脂肪酶应用于天然奶味香基制作的方法，包括以下步骤：

(1)将50g稀奶油与ph值为8.0的pbs缓冲液混合，稀奶油与pbs缓冲液比例为1:1，加入330mg的单硬脂酸甘油酯，加热至80℃搅拌，充分乳化后形成第一混合液；

(2)降温至60℃，往步骤(1)制得的第一混合液中添加稀奶油质量的0.5％的木瓜脂肪酶，在空气浴恒温摇床中恒温反应4h；

(3)将步骤(2)所得产物升温至90℃灭酶30min，均质乳化，所得即为木瓜脂肪酶制备的天然奶味香基。

实施例5

本实施例提供一种木瓜酶制剂的产业化制备方法，包括以下步骤：

(1)设置vw-0.42/7无油空气压缩机(排气压力0.7mpa，容积流量0.42m3/min)、a27w-10t弹簧式安全阀(ts)、带3251.072.090压力传感器31和lzj玻璃转子流量计32的50l储罐、压力表、bms0.5/290-ub增强聚丙烯板框压滤机(过滤面积0.5m²，滤室总容积7.5l)、80目滤布、回流管、第一喷雾干燥机、与第二喷雾干燥机；所述弹簧式安全阀分别连接无油空气压缩机与板框压滤机，所述压力表分别连接储罐以及板框压滤机，储罐还通过回流管与板框过滤机相连接，所述80目滤布设置于板框压滤机中，所述第一喷雾干燥机与板框压滤机相连接；所述第二喷雾干燥机与第一喷雾干燥机相连接；

(2)将-20℃冷冻木瓜乳溶解，得到新鲜木瓜乳乳液，将其倒入储罐中，加压通入板框压滤机中；

(3)无油空气压缩机1对板框过滤机加压，木瓜乳通过板框过滤机，第一阶段采用低压，进料压力为0.12mpa，运行时间3h，第二阶段采用中压，进料压力为0.18mpa，运行时间4h，固体成分留在板框过滤机中，逐渐形成滤饼，滤液通过回流管回收至储罐中，所述滤饼即为木瓜脂肪酶；

(4)重复步骤(3)，直至滤液变为不含乳白色固形物的浅黄色液体，收集滤液；

(5)将滤液加入第一喷雾干燥机中，入口温度为135℃，出料温度控制在68℃至72℃之间，直接对滤液进行喷雾干燥，得到滤渣；

(6)将滤渣与等体积的水混合，加入第二喷雾干燥机中干燥，得到的固体粉末即为木瓜脂肪酶。

本实施例还提供一种将采用上述方法制备的木瓜脂肪酶应用于天然奶味香基制作的方法，包括以下步骤：

(1)将50g稀奶油与ph值为8.0的pbs缓冲液混合，稀奶油与pbs缓冲液比例为3:1，加入200mg的单硬脂酸甘油酯，加热至60℃搅拌，充分乳化后形成第一混合液；

(2)降温至30℃，往步骤(1)制得的第一混合液中添加稀奶油质量的10％的木瓜脂肪酶，在空气浴恒温摇床中恒温反应16h；

(3)将步骤(2)所得产物升温至85℃灭酶30min，均质乳化，所得即为木瓜脂肪酶制备的天然奶味香基。

实施例6

本实施例提供一种测定实施例1制得的木瓜脂肪酶酸价方法，包括以下步骤：

(1)将乙醚与95％乙醇溶剂按体积比1:1混合，使用前每100ml混合溶剂中，加入0.3ml酚酞指示剂，用氢氧化钾乙醇标准溶液中和；

(2)取实施例1制得的木瓜脂肪酶0.5g，用50～150ml步骤(1)所得乙醚-乙醇混合液溶解；

(3)用0.1mol/l氢氧化钾溶液进行滴定，直至指示剂到达终点，

测得木瓜脂肪酶的酸价为29.36±1.17mgkoh/g，采用相同方法测量palatase20000，酸价为17.86±0.83mgkoh/g。

实施例7

本实施例提供一种对实施例1制得的木瓜脂肪酶进行香气评价的方法，包括以下步骤：酶解样品室温放置24h平衡香气，之后称取10.0g的样品于50ml样品瓶中，在40℃水浴锅中放置15min使其溶解进行感官评价。评价小组由10人组成，男性5人，女性5人，采用6分法即1-6分从气味由弱到强的方法对酶解奶油的奶味、干酪味、酸味、酸败味分别进行感官评价。以没有添加酶的原材料为阴性对照，palatase20000l酶解制备的奶味香基为对照，并将得到的结果进行风味剖面分析。

如图2所示，木瓜脂肪酶酶解制备的奶味香基具有独特的香气，其中酸味，干酪味较重。而palatase20000l酶解制备的奶味香基酸味不突出，奶味中有香甜味。

实施例8

本实施例提供一种对实施例1制得的木瓜脂肪酶进行挥发性成分分析的方法，包括以下步骤：以原材料稀奶油作为对照样品a，商品酶palatase20000l酶解制备的奶味香基为对照样品b。cpl酶解制备的样品c，全部样品室温放置3天平衡香气后分析其挥发性成份。

如图3所示，a为稀奶油原料、b为cpl酶解奶味香基、c为palatase20000l酶解奶味香基，相对于原材料稀奶油，cpl酶解制备的奶味香基和palatase20000l酶解制备的奶味香基，其挥发性成份的强度都有很大的提升。酶解奶味香基中，偶数碳的脂肪酸对香气贡献较大，尤其是丁酸。

请参见下表，下表为cpl和palatase20000l酶解制备奶味香基的主要挥发性成份对比。

由上表可见，cpl酶解产物挥发性成份中酸的含量较高，占总挥发性物质的73.28％，其中丁酸含量占总挥发性物质的23.52％，己酸含量占36.73％。palatase20000l酶解产物挥发性成份中酸的含量较少，仅为总挥发性物质的20.0％，酯的含量较高，为总挥发性物质的18.48％且种类更加丰富。己酸乙酯的含量达到了14.42％，更有癸酸乙酯，辛酸乙酯，庚酸乙酯，戊酸乙酯等cpl酶解奶油中未检测出的酯类。这与cpl的酶解奶油酸味较重，palatase20000l酶解奶油奶味中有香甜味的香气感官评价相符。

本发明的重点在于，通过板框过滤与喷雾干燥两步法分离制备木瓜脂肪酶和木瓜蛋白酶，工艺简单易行，与通过缓冲液反复洗涤去除木瓜乳中的水溶性蛋白酶类的木瓜脂肪酶制备方法相比，产率高，酶活力回收率高，且可以同时制备木瓜脂肪酶和木瓜蛋白酶，水电消耗大大减小，非常适合工业产业化制备。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术范围作任何限制，故采用与本发明上述实施例相同或近似的技术特征，均在本发明的保护范围之内。