莱茵衣藻溶血性磷脂酸酰基转移酶及其基因和用途的制作方法

本发明涉及分子生物学和生物技术领域，尤其涉及一种莱茵衣藻溶血性磷脂酸酰基转移酶，本发明还涉及该酶的用途。

背景技术：

当今全球大约80％的能源来自于化石燃料，自19世纪工业革命至今的一百多年中化石燃料逐渐消耗殆尽，作为一种不可再生资源，人类必须找到一种既能替代化石燃料而成为主要能源又不会过于剧烈的改变工业结构与生产力工具的替代品。在众多可替代能源中生物燃料最受关注，这其中就包括生物柴油。

目前，能用于制造生物柴油的生物质主要是高等植物，比如油菜、大豆、棕榈油、向日葵、麻风树等。虽然这些植物本身产油能力很高但却需要大面积的土地进行种植来供应燃料需求，这就势必造成大量森林被砍伐，导致生态失衡，所以这些高等植物并不能满足作为化石燃料替代品的要求。而微藻却具有高等植物所没有的巨大优势，有些产油微藻有着较高的光合效率能够带来巨大的生物质，又不需要占用过多土地资源，所以微藻的产油能力远高于传统农作物，其巨大的产业价值使它成为近年来的研究热点[chisti,yusuf."biodieselfrommicroalgaebeatsbioethanol."trendsinbiotechnology26.3(2008):126-131]。

一般来说，生物柴油是c15-c19的脂肪酸甲酯，若要将生物柴油真正应用到工业生产中，则需要对生物柴油的脂肪酸碳链长度及饱和度提出一定要求。目前，欧盟和美国分别颁布了生物柴油的标准(en14214和astmd6751)，以c16和c18的饱和或单不饱和脂肪酸为 主的生物柴油性能最好。虽然微藻产油可以作为生物柴油的理想来源，但其本身的脂肪酸组成繁杂，很难保证c16或c18的脂肪酸构成细胞总脂肪酸的主要成分。由此可以看出，对微藻脂肪酸组成结构的控制，是目前需要解决的一个难题。

除了作为生物柴油的前体外，含有饱和c16脂肪酸(又称棕榈酸或软脂酸)的甘油三酯在食品等领域也有广泛的用途。例如，如1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(以下简称opo)，就是已经商业化人乳脂肪替代品产品如betapol45^tm及infat^tm中的重要组分，卫生部于2008年13号公告中，明确opo能以营养强化剂添加到婴幼儿乳制品。

脂肪酸在甘油三酯中的位置分布对脂肪酸及矿物质(例如钙)的吸收效果具有显著的影响。freeman等[j.dairysc1.,1965,p.853]报道了人乳脂肪绝大多数的棕榈酸分布在sn-2位，而硬脂酸和油酸分布在sn-1(3)位。filer等[j.nutrition,99,pp.293-298]研究表明棕榈酸分布在三甘酯的sn-2位在婴儿体内比黄油脂肪(黄油脂肪的棕榈酸主要分布在sn-1，3位)能获得更好的吸收。因此，opo被认为是目前已知的接近人乳脂肪组分的重要甘油三酯，而现有opo制备方法，多是采用混合调制不同成分的油脂并引入催化酸解等工艺来实现(us20100104694a1，us20090130728a1)。现有的方法费时费力，故限制了此类产品的开发。

除了甘油三酯外，棕榈酸的其他衍生物也具有多种工业用途。例如，其棕榈酸钠盐或钾盐可作乳液聚合时的乳化剂；棕榈酸的钠盐是肥皂的主要成分之一；棕榈酸铝盐和锌盐等可用于润滑剂、涂料、油墨和增塑剂中。

有上述内容可以看出，寻找新的涉及棕榈酸合成或将其组装为甘油三酯的基因，并利用基因工程的方法对现有的工程微生物、植物、动物进行遗传改造，使之产生富含“棕榈酸的油脂”或“甘油三酯”，或“在甘油骨架特定的位置上含有棕榈酸”的油脂(如opo)，将极大程度地推进相关产业的发展。

近年来，生物细胞产油(还有其他可以产油细胞，如酵母、高等 植物细胞)作为可再生生物柴油及多种高附加值产品的来源已经引起了广泛的关注。生物细胞内油脂的生物合成是一个相当复杂的过程，其起始于脂肪酸的从头合成。这个步骤发生在质体中，脂肪酸合成酶以丙二酰coa为底物进行连续的聚合反应，这些不断增长的碳链与酰基载体蛋白acp结合，有些酰基载体蛋白acp在酰基coa合成酶的作用下形成酰基-coa，并从质体转运到内质网中，这些不同长度的酰基-coa会在多种酶的作用下进一步修饰，比如脂肪酸的去饱和等[harwood,johnl."recentadvancesinthebiosynthesisofplantfattyacids."biochimicaetbiophysicaacta(bba)-lipidsandlipidmetabolism1301.1(1996):7-56.]。从脂肪酸到甘油三酯tag的合成是通过kennedy途径完成的。首先甘油-3-磷脂(g-3-p)在甘油-3-磷脂酰基转移酶(gpat)的催化下形成溶血性磷脂酸(lpa)，随后在溶血性磷脂酸酰基转移酶(lpaat)的作用下形成磷脂酸(pa)，磷脂酸在磷脂酸磷酸水解酶(pap)的作用下脱磷酸化而形成甘油二脂(dag)，最终在二酰甘油酰基转移酶(dgat)的催化下合成甘油三酯[kennedy,e.p.,&weiss,s.b.(1956).thefunctionofcytidinecoenzymesinthebiosynthesisofphospholipides.journalofbiologicalchemistry,222(1),193-214.]。近年来科学家研究发现不同来源的gpat和dgat对底物酰基-coa的选择性较小，而lpaat却对底物有很强的选择性，它严格控制了tag的sn-2位上脂肪酸链的长度与饱和度。例如高等植物油菜和拟南芥质体的lpaat对16:0-coa的偏好性远远高于18:1-coa，而内质网lpaat却对18:1-coa有着强烈的偏好性[kim,hyunuk,andanthonyhchuang."plastidlysophosphatidylacyltransferaseisessentialforembryodevelopmentinarabidopsis."plantphysiology134.3(2004):1206-1216]，由此可见高等植物的不同细胞器来源的lpaat对底物有偏好性而使脂肪酸的组成呈现多样化。

但是目前研究尚不清楚低等植物藻类中不同细胞器来源的lpaat是否也有类似的偏好性，如果确有类似的偏好性，则能借此来调节和控制生物细胞(特别是藻细胞)中脂肪酸的组成结构，使 c16或c18的脂肪酸构成细胞总脂肪酸的主要成分，将很大程度的解决前文所提的技术难题，使产油生物细胞(特别是微藻)产油真正成为生物柴油的理想来源。

技术实现要素：

本发明根据宿主细胞中质体lpaat对c16:0的底物选择性，在莱茵衣藻中找到了一个新的质体crlpaat1基因，其表达的蛋白酶即莱茵衣藻溶血性磷脂酸酰基转移酶对16:0-coa有强烈的选择性。通过过量表达该基因，显著提高了生物细胞中c16:0脂肪酸在总脂肪酸中的比例。

基于此，本发明的第一个目的在于提供一种莱茵衣藻溶血性磷脂酸酰基转移酶(lpaat)，用以提高产油生物细胞产c16:0的能力；

本发明的第二个目的在于提供所述莱茵衣藻溶血性磷脂酸酰基转移酶的基因(crlpaat1)；

本发明的第三个目的在于提供所述莱茵衣藻溶血性磷脂酸酰基转移酶及其基因的用途。

为了实现本发明的目的，本发明的首先提供一种莱茵衣藻溶血性磷脂酸酰基转移酶，其为:1)由seqidno.1所示的氨基酸组成的蛋白质；或2)在seqidno.1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

进一步地，本发明还提供编码上述蛋白的基因，其具有seqidno.2所示的核苷酸序列。该基因是以jgi莱茵衣藻基因组数据库中的同族基因为参考基因，设计特异引物，并以莱茵衣藻cdna文库为模板，进行pcr扩增获得的。该cdna含有一个大小为999bp的开放阅读框，编码了一个含有332个氨基酸残基的蛋白。初步预测了此蛋白含有酰基转移酶的功能域和两段跨膜域并且在n末端具有叶绿体转导肽，其可能的亚细胞定位是叶绿体。

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在 不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。因此，本发明的莱茵衣藻溶血性磷脂酸酰基转移酶还包括seqidno.1所示氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，具有莱茵衣藻溶血性磷脂酸酰基转移酶同等活性的由所述蛋白衍生得到的蛋白质。

本发明基因包括编码所述蛋白的核苷酸序列，包括但不限于seqidno.2所示的序列，其互补序列，或者是在严格条件下与seqidno.2序列杂交，且编码具有所述莱茵衣藻溶血性磷脂酸酰基转移酶活性的蛋白质的dna序列。所述严格条件是ph＝7-8的tris-hcl缓冲液，95℃变性5分钟后，于37℃下杂交。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。例如，根据密码子的简并性，seqidno.2所示序列的第7-9位碱基cgt亦可为cgc、cga或cgg。编码序列的互补序列可以作为模板链在转录中发挥作用，本领域技术人员亦可以据此设计引物等等进行进一步的应用。

进一步，本发明还提供含有上述基因的载体。所述载体，包括但不限于含有crlpaat1基因的克隆载体或各类表达载体。

进一步，本发明还提供含有上述基因或载体转化的宿主细胞，例如产油生物细胞，包括但不限于微藻或酵母。

通过上述基因工程的手段，可以实现异源表达所述的莱茵衣藻溶血性磷脂酸酰基转移酶，因此该酶可以通过培养上述的宿主细胞，并进行诱导表达获得。

进一步，本发明还提供上述的莱茵衣藻溶血性磷脂酸酰基转移酶、上述的基因或上述的载体在制备产油的宿主细胞中的应用。所述宿主细胞包括但不限于微藻或酵母。转化后宿主细胞中c16脂肪酸占总脂肪酸比例高于转化前的比例。

进一步，本发明还提供上述的莱茵衣藻溶血性磷脂酸酰基转移酶、上述基因或上述的载体在提高生物细胞中c16脂肪酸占总脂肪酸比例中的应用。所述的生物细胞包括但不限于微藻或酵母。

进一步，本发明还提供一种制备生物柴油的方法，该方法是使用上述转化了所述基因的宿主细胞来生产生物柴油。

在本发明中，宿主细胞通常是指能接受基因导入的细胞。导入外源基因的方法不限于各种转化方法，例如点击转化。

在本发明中，载体通常是能将dna片段转移到受体细胞并进行自我复制的dna分子，包括克隆载体及表达载体等等，含有外源基因的载体通常是指外源基因插入到载体的克隆位点。

在本发明中，适于莱茵衣藻溶血性磷脂酸酰基转移酶表达的宿主细胞包括微藻或酵母。但不限于“微藻和酵母”两种异源性细胞中对脂肪酸组成影响的例子，但凡使用可产生c16:coa的生物细胞均可作为宿主细胞。利用crlpaat1基因所表达的蛋白酶(lpaat)对c16:c0a强烈的选择性，在(lpaat)的作用下形成磷脂酸(pa)，接着在磷脂酸磷酸水解酶(pap)的作用下脱磷酸化而形成甘油二脂(dag)，最终经催化下合成c16:0脂肪酸，使c16:0含量提高，甚至成为主要成分。

有益效果

本发明根据宿主细胞中质体lpaat对c16:0的底物选择性，在莱茵衣藻中找到了一个新的质体crlpaat1基因，其表达的蛋白酶即莱茵衣藻溶血性磷脂酸酰基转移酶对16:0-coa有强烈的选择性。通过过量表达该基因，显著提高了生物细胞中c16:0脂肪酸在总脂肪酸中的比例。进而能够应用于获得高品质(燃点低、粘度低)生物柴油及其他相关产品。

附图说明

图1为莱茵衣藻crlpaat1cdna序列扩增结果的凝胶电泳图，其中m为dna分子量标准。模板dna为莱茵衣藻cdna文库。

图2为crlpaat1基因结构示意图。其中，1～46氨基酸片段为生物信息学软件chloropv1.1预测得到的叶绿体转导肽序列；94～116 和180～205氨基酸片段为生物信息学软件tmhmm预测得到的跨膜区段；下划线部分为生物信息学软件interproscan预测得到的酰基转移酶功能域；162～168和235～237氨基酸片段为多序列比对与文献报道的酰基转移酶催化位点与底物结合位点。

图3为lpaat的系统进化树。使用t-coffee进行多序列比对后使用neighbor-joining方法构建了系统进化树，建树软件为mega6.0。

图4为功能互补实验结果。

图4a为构建pqe30-crlpaat1质粒的方法。左图为使用高保真dna聚合酶pfu从cdna文库中克隆得到crlpaat1的片段；右图为重组质粒pqe30-crlpaat1的结构示意图。

图4b为sm2-1lpaat缺陷型大肠杆菌体内功能互补实验的结果。pqe30为转化了pqe30空质粒的对照组，crlpaat1为转化了pqe30-crlpaat1质粒的实验组，菌液经过5个梯度的稀释后分别涂在含有或不含有iptg诱导剂的lb平板上，再将平板置于30℃和42℃下培养。

图4c为转化了crlpaat1基因或转化空载体的sm2-1菌株表达crlpaat1蛋白的westernblot检测结果。m：bio-radprecisionplusproteinstandards。泳道1：转化了crlpaat1基因的实验组；泳道2：转化了pqe30空载体的对照组。

图5显示的是crlpaat1对不同酰基-coa作为酰基供体的选择性。

图5a为分别使用14:0-coa、16:0-coa、18:0-coa、20:0-coa、22:0-coa、24:0-coa6种饱和脂肪酸作为酰基供体。sm2-1+lpaat1/heat：转化了pqe30-crlpaat1质粒的sm2-1，高温加热使粗酶失活作为阴性对照；sm2-1+lpaat1：转化了pqe30-crlpaat1质粒的sm2-1作为实验组。pa：磷脂酸标样；lpa：溶血性磷脂酸标样。

图5b为分别使用16:1-coa、17:1-coa、18:1n7-coa、18:1n9-coa、 18:1n12-coa、18:2-coa、18:3n3-coa、18:3n6-coa、20:4-coa、20:5-coa、22:6-coa、24:1-coa12种不饱和脂肪酸作为酰基供体。sm2-1+lpaat1/heat：转化了pqe30-crlpaat1质粒的sm2-1，高温加热使粗酶失活作为阴性对照；sm2-1+lpaat1：转化了pqe30-crlpaat1质粒的sm2-1作为实验组。

图6显示的是crlpaat1对不同lpa作为酰基受体的选择性。分别使用14:0-lpa、16:0-lpa、17:0-lpa、18:1-lpa、20:4-lpa作为酰基受体，固定使用16:0-coa作为酰基供体进行酶活实验。sm2-1+empty：转化了pqe30空质粒的sm2-1作为对照组；sm2-1+lpaat1：转化了pqe30-crlpaat1质粒的sm2-1作为实验组；eh：高温加热使粗酶失活的对照组，使用18:1-lpa作为酰基受体；lh：高温加热使粗酶失活的实验组，使用18:1-lpa作为酰基受体。

图7a为过量表达crlpaat1对野生型酿酒酵母invsc1脂肪组成的影响；图7b过量表达crlpaat1对野生型酿酒酵母invsc1tag中脂肪酸组成的影响；图7c过量表达crlpaat1对野生型酿酒酵母invsc1总油脂含量的影响；图7d过量表达crlpaat1对野生型酿酒酵母invsc1总tag含量的影响。其中empty：转化了pyes2/ct空质粒的invsc1酵母菌作为对照组；lpaat1：转化了pyes2/ct-crlpaat1质粒的invsc1酵母菌作为实验组。结果进行了t检验。

图8过量表达crlpaat1对莱茵衣藻cw15总脂肪酸含量的影响。其中cw15为对照组，r16-1为过表达crlpaat1的突变株。

图9过量表达crlpaat1对莱茵衣藻cw15总脂中各脂肪酸含量的影响。其中cw15为对照组，r16-1为过表达crlpaat1的突变株。

图10过量表达crlpaat1对莱茵衣藻cw15tag占细胞干重的变化。其中cw15为对照组，r16-1为过表达crlpaat1的突变株。

图11过量表达crlpaat1对莱茵衣藻cw15tag中各脂肪酸 含量的影响。其中cw15为对照组，r16-1为过表达crlpaat1的突变株。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。例如，对于基因操作、表达、分析以及蛋白互作等等可参考《分子克隆实验指南》第三版中的相关方法。

实施例1基因克隆及序列特征分析

本发明所提供的crlpaat1基因是以jgi莱茵衣藻基因组数据库(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)公布的cre09.g398289.t1.1基因为参考基因，设计特异引物(正向引物，如seqidno.3所示，5'-atggcgcgtaaaagcagtttggctc-3'，反向引物，如seqidno.4所示，5'-ctgctcatccggcgccatctctgt-3')，以莱茵衣藻cdna文库(cdna文库的构建按照《分子克隆实验指南》按常规方法制备保存)为模板，进行pcr扩增获得cdna序列，如图1所示。pcr的反应体系为：2μl模板dna，10μl2×gotaqdnapolymerasemix(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司)，1μl正向引物(10μm)，1μl反向引物(10μm)，最后补充去离子水，使总体积为20μl。pcr反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性0.5min，58℃退火0.5min，72℃延伸1.5min，30个循环；最后72℃延伸10min。

该cdna含有一个大小为999bp的开放阅读框(seqidno.2)，编码了一个含有332个氨基酸残基的蛋白(seqidno.1)。用生物信息学相关软件初步预测了此蛋白的功能与亚细胞定位，结果显示crlpaat1含有酰基转移酶的功能域和两段跨膜域并且在n末端具有叶绿体转导肽，其可能的亚细胞定位是叶绿体(图2)；其中，1～46氨基酸片段为生物信息学软件chloropv1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/chlorop/)预测得到的叶绿体转导肽 序列；94～116和180～205氨基酸片段为生物信息学软件tmhmm(http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm/)预测得到的跨膜区段；下划线部分为生物信息学软件interproscan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)预测得到的酰基转移酶功能域；162～168和235～237氨基酸片段为多序列比对与文献报道的酰基转移酶催化位点与底物结合位点。

使用t-coffee进行多序列比对后使用neighbor-joining方法构建了系统进化树，建树软件为mega6.0。与已证实的其它物种叶绿体lpaat基因有很高的同源性(图3)。

实施例2功能验证

以莱因衣藻cdna为模板，利用分别包含bamhi、hindiii限制性酶切位点的引物(正向引物，如seqidno.5所示，5'-tgacggatccatggcgcgtaaaagcagtttggctc-3'，反向引物，如seqidno.6所示，5'-actgaagctttcactgctcatccggcgccatctctgt-3')和高保真聚合酶pfu进行pcr扩增，获得5'和3'含有相应酶切位点的开放阅读框dna片段。利用t4dna连接酶将该片段与经双酶切的表达载体pqe30连接，获得重组质粒。利用热击法将该重组质粒转入lpaat缺失的温度敏感型大肠杆菌sm2-1(plsc-)(sm2-1来自耶鲁大学大肠杆菌资源中心cgsc)感受态细胞中。与对照组(含有pqe30空载体)相比，转化了crlpaat1基因的sm2-1菌株经iptg诱导重组蛋白后，可以在42℃下生存，而对照组无法正常生长(图4)。图4a为构建pqe30-crlpaat1质粒的方法。左图为使用高保真dna聚合酶pfu从cdna文库中克隆得到crlpaat1的片段；右图为重组质粒pqe30-crlpaat1的结构示意图。图4b为sm2-1lpaat缺陷型大肠杆菌体内功能互补实验的结果。pqe30为转化了pqe30空质粒的对照组，crlpaat1为转化了pqe30-crlpaat1质粒的实验组，菌液经过5个梯度的稀释后分别涂 在含有或不含有iptg诱导剂的lb平板上，再将平板置于30℃和42℃下培养。

图4c为转化了crlpaat1基因或转化空载体的sm2-1菌株表达crlpaat1蛋白的westernblot检测结果。m：bio-radprecisionplusproteinstandards。泳道1：转化了crlpaat1基因的实验组；泳道2：转化了pqe30空载体的对照组。这说明crlpaat1在功能上回补了大肠杆菌plsc基因缺失所造成的无法在较高温度如42℃下生存的表型。此实验证明了crlpaat1基因在体内具有溶血性磷脂酸酰基转移酶的活性。

实施例3体外酶活性测试

本发明中将转化了crlpaat1基因的sm2-1大肠杆菌与转化了pqe30空质粒的sm2-1大肠杆菌在30℃培养并加入0.5mmiptg诱导蛋白质表达6小时后，离心收集细胞。经机械破碎及梯度离心的方法提取其膜组分并作为粗酶进行了体外酶活实验。实验中选用多种不同碳链长短与饱和度不同的酰基-coa做为酰基供体，通过观察产物磷脂酸(phosphatidicacid,pa)的积累量，以确定最适底物。酶反应的条件为：在200μl100mm的磷酸钾缓冲液(ph7.4)中含有250μm溶血性磷脂酸(lpa)，200μm脂酰辅酶a(acyl-coa)，1mmmgcl2与20μg粗酶。在加入粗酶后于30℃下振荡反应30min。后加入160μl5％冰醋酸终止反应，再用blighanddyer方法提取总油脂，提取方法为：于反应混合物中加入500μl氯仿甲醇(1:1，v/v)混合液，vortex振荡10min，3000×g离心5min，将下层的氯仿层转移至新的1.5ml离心管中，使用真空浓缩仪吹干后加入30μl氯仿溶解。以氯仿甲醇水(65:25:4，v/v/v)的混合液为展开剂，利用薄层层析(tlc)的方法检测产物的积累。

图5a为分别使用14:0-coa、16:0-coa、18:0-coa、20:0-coa、22:0-coa、24:0-coa6种饱和脂肪酸作为酰基供体。sm2-1+lpaat1/heat：转化了pqe30-crlpaat1质粒的sm2-1，高 温加热使粗酶失活作为阴性对照；sm2-1+lpaat1：转化了pqe30-crlpaat1质粒的sm2-1作为实验组。pa：磷脂酸标样；lpa：溶血性磷脂酸标样。图5b为分别使用16:1-coa、17:1-coa、18:1n7-coa、18:1n9-coa、18:1n12-coa、18:2-coa、18:3n3-coa、18:3n6-coa、20:4-coa、20:5-coa、22:6-coa、24:1-coa12种不饱和脂肪酸作为酰基供体。sm2-1+lpaat1/heat：转化了pqe30-crlpaat1质粒的sm2-1，高温加热使粗酶失活作为阴性对照；sm2-1+lpaat1：转化了pqe30-crlpaat1质粒的sm2-1作为实验组。实验结果发现crlpaat1对16:0-coa具有强烈的偏好性(图5)。

另外，还选用多种溶血性磷脂酸(lysophosphatidicacid,lpa)作为酰基受体进行了酶活性测试。分别使用14:0-lpa、16:0-lpa、17:0-lpa、18:1-lpa、20:4-lpa作为酰基受体，固定使用16:0-coa作为酰基供体进行酶活实验。sm2-1+empty：转化了pqe30空质粒的sm2-1作为对照组；sm2-1+lpaat1：转化了pqe30-crlpaat1质粒的sm2-1作为实验组；eh：高温加热使粗酶失活的对照组，使用18:1-lpa作为酰基受体；lh：高温加热使粗酶失活的实验组，使用18:1-lpa作为酰基受体。结果表明crlpaat1对18:1-lpa具有很强的偏好性(图6)。

实施例4在异源系统中表达重组lpaat及其对宿主系统脂肪酸组成的改变(以酿酒酵母为例)。

以莱茵衣藻cdna为模板，利用分别包含hindiii、xbai限制性酶切位点的引物：(正向引物，如seqidno.7所示，5'-tgacaagcttatggcgcgtaaaagcagtttggctc-3'，反向引物，5'-actgtctagatcactgctcatccggcgccatctctgt-3'，如seqidno.8所示)和高保真聚合酶pfu进行pcr扩增，获得5'和3'含有相应酶切位点的开放阅读框dna片段。利用t4dna连接酶将该片段与经双酶切的表达载体pyes2/ct连接，获得重组质粒。利用化学方法将该重组质粒转入野生型酿酒酵母invsc1感受态细 胞中。挑选的单菌落在sc-uglucose生长培养基中培养至指数生长期后离心收集菌体，弃掉上清后菌体重悬于sc-ugalactose诱导培养基中表达重组蛋白。诱导表达crlpaat124小时后，收获酵母细胞，利用修改后的blighanddyer方法提取了细胞内总脂肪，过程为：将离心收集后的菌体重悬于160μl去离子水中，加入600μl氯仿甲醇(1:2，v/v)混合液与200μl玻璃珠，高速振荡1min，加入200μl氯仿于室温下混合均匀，加入200μl去离子水并混合均匀，在室温下3000×g离心5min，将所有液相部分转移至新的离心管中，再向固相部分加入320μl氯仿，再次高速振荡1min，于室温下3000×g离心5min，将液相部分与第一次收集到的液相部分混合于同一个离心管中，于室温下3000×g离心5min，将下部的氯仿层转移至新的离心管中，使用真空浓缩仪吹干，加入50μl氯仿溶解提取到的总脂肪。总脂肪进行了转甲酯化反应，具体步骤为：在氯仿溶解的总脂肪中加入200μl氯仿甲醇(2:1，v/v)混合液，再加入300μl盐酸甲醇(5:95，v/v)混合液，于85℃静置1h，加入1ml正己烷，充分振荡混匀后于室温静置3h，取200μl转移至gc上样瓶中并加入5μl十五烷用于定量。利用agilent7890bgc气相色谱系统(火焰电离检测器fid和hp-88柱(60m*0.25mm，0.2μm厚))定量分析了重组酵母细胞与对照(含有pyes2/ct空载体)的脂肪酸组成。气相色谱条件：运载气体(氮气)流速2mlmin^-1；不分流；注射器和fid温度为250℃和280℃；柱箱温度先50℃保持2min，然后以每分钟增加25℃的速度至175℃，保持5min，继续以每分钟7℃速度增温至210℃，保持2min，再以每分钟2℃的速度升温至230℃。

实验结果表明，与对照组相比，crlpaat1重组酵母中16:0脂肪酸占总脂肪酸的比例显著提高(p<0.05,t-test)，相比对照组提高了10.48％，而其他脂肪酸则没有明显变化(图7)。此实验证实在异源真核系统中，过量表达crlpaat1具有提高16:0脂肪酸含量的能力。

实验结果表明，与对照组相比，crlpaat1重组酵母中16:0脂肪酸占总脂肪酸的比例显著提高(p<0.05,t-test)，相比对照组提高了62.2％，另外一种饱和脂肪酸18:0的含量提高了16.3％(p<0.05,t-test),而其他不饱和脂肪酸的含量略有下降，如图7a所示。与对照组相比，重组酵母tag(甘油三酯)中16:0脂肪酸的比例也有显著提高，相比对照组提高了65.2％，如图7b所示。此实验证实在异源真核系统中，过量表达crlpaat1具有提高16:0脂肪酸含量的能力。另外,crlpaat1重组酵母的总脂肪酸含量与总tag(甘油三酯)含量较对照分别提高了16.1％(如图7c所示)与53.04％(如图7d所示)，说明在酵母系统中过量表达crlpaat1能显著提高油脂的含量。

实施例5在衣藻中表达lpaat及其对宿主系统脂肪酸组成的改变

以莱茵衣藻cdna为模板，利用分别包含ecori、xbai限制性酶切位点的引物：(正向引物，seqidno.9所示，5'-ggaattcatggcgcgtaaaagcag-3'；反向引物，如seqidno.10所示，5'-gctctagactactgctcatccggc-3')和高保真聚合酶pfu进行pcr扩增，获得5'和3'含有相应酶切位点的开放阅读框dna片段。利用ecori和xbai进行双酶切并将其与同样经过ecori和xbai双酶切的表达质粒pchlamy_4中，获得重组质粒。利用化学方法将该重组质粒转入大肠杆菌感受态dh5α中。挑选可以在amp⁺的琼脂平板上生长的阳性单菌落在lb液体培养基中培养至指数生长期后离心收集菌体。提取质粒并利用scai对重组质粒进行酶切，使环状质粒变为线性质粒。

在正常tap培养基中培养野生型莱茵衣藻cw15至对数中期(约1-2×10⁶细胞ml^-1)，通过4000g离心5分钟收集藻细胞，弃去上清并用新鲜的tap重悬沉淀至2×10⁸细胞ml^-1。将线性化后的质粒通过玻璃珠法转入细胞壁部分缺陷型莱茵衣藻cw15中。转化系统：重悬藻液300μl，无菌玻璃珠(直径为0.4mm)0.3g，线性化质粒 1μg，添加20％无菌聚乙二醇(peg)100μl维持细胞渗透压。转化系统在vortexgenie-2涡旋震荡器上剧烈震荡15s后转入15ml无菌螺帽离心管中，并加入10mltap培养基。将该离心管置于100rpm摇床孵育18h后离心收集藻细胞，沉淀的藻细胞重悬至1mltap培养基中。取100μl重悬细胞涂布在zeocin⁺的tap琼脂平板上，在光照培养箱中倒置培养5-7天，获得单藻落的转化株。

从平板中挑取单藻落进行液体培养，对挑取的转化株进行pcr验证。具体操作如下：取1ml藻液离心去上清，加入100mmedta混匀，100℃加热5min，剧烈震荡后瞬时离心，取1.5μl上清作为模板加入到pcr反应体系中。pcr反应体系包括1.5μl模板，10μl2×gotaqdnapolymerasemix,1μl正向引物(10μm)，1μl反向引物(10μm)，2μl100％dmso，最后补充去离子水至20μl。pcr反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性0.5min，58℃退火0.5min，72℃延伸1.5min，30个循环；最后72℃延伸10min。其中验证插入引物为：正向引物，如seqidno.3所示，5'-atggcgcgtaaaagcagtttggctc-3'；反向引物，如seqidno.4，5'-ctgctcatccggcgccatctctgt-3'。

对经过验证的转化子进行qpcr筛选crlpaat基因过表达的转化子。以rack1基因为内参基因设计引物正向引物，如seqidno.11所示，5'-aggatgtgctgtccgtggctt-3'；反向引物，如seqidno.12所示，5'-acctgggccttcttgctggtgatgt-3'，目的基因正向引物如seqidno.13所示，5'-ccaactcagactccgctcctca-3'；反向引物，如seqidno.14所示，5'-agcctgtccccagcagtgtgat-3'。rtq-pcr反应体系为：2×sybrmastermix10μl，正向引物(10μm)1μl，反向引物(10μm)1μl，cdna(50ngμl^-1)1μl，补充depc水至20μl。pcr反应程序为：95℃预变性10min，95℃变性10s，61℃退火 30s，72℃延长30s，40个循环，熔解曲线：65℃至95℃，每0.05s增加0.5℃。

对于经过qpcr验证crlpaat基因在rna水平显著提高的转化子进行液体培养，将培养至第三天的对数期细胞离心并用缺氮tap液体培养基洗涤一次后接种到缺氮tap液体培养基中进行油脂积累诱导。在缺氮培养基中培养3天后离心收获藻细胞，冷冻干燥获得冻干藻粉。利用修改后的blighanddyer方法提取了细胞内总脂肪，过程为：称取10mg冻干藻粉，加入6ml提取液1(甲醇:氯仿:88％甲酸＝20:10:1，v:v:v)，震荡器上剧烈震荡15-20min，加入3ml提取液2(0.2m磷酸，1m氯化钾)，充分混匀后1000g离心5min，用巴斯德吸管吸取下层氯仿层至新的玻璃管中，氮气吹干后加200μl氯仿复溶油脂。对提取的油脂进行总脂肪酸分析和三酰甘油酯成分和含量分析。其中，总脂肪酸含量分析首先进行转甲酯化反应，具体步骤为：在氯仿溶解的总脂肪中加入200μl氯仿甲醇(2:1,v/v)混合液，再加入300μl盐酸甲醇(5:95,v/v)混合液，于85℃静置1h，加入1ml正己烷，充分振荡混匀后于室温静置3h，取200μl转移至gc上样瓶中并加入5μl十五烷用于定量。利用agilent7890bgc气相色谱系统(火焰电离检测器fid和hp-88柱(60m×0.25mm，0.2μm厚))定量分析了过表达藻株r16-1与对照(野生型cw15)的脂肪酸组成。气相色谱条件：运载气体(氮气)流速2mlmin^-1；不分流；注射器和fid温度为250℃和280℃；柱箱温度先50℃保持2min，然后以每分钟增加25℃的速度至175℃，保持5min，继续以每分钟7℃速度增温至210℃，保持2min，再以每分钟2℃的速度升温至230℃。分析三酰基甘油酯(triacylglyerol,tag)成分及含量首先要对提取的油脂进行薄层层析(thinlayerchromatography,tlc)以分离tag，tlc操作如下：取10μl氯仿溶解的总脂依次在tlc板上点样，待样品点干燥后置于层析槽中， 展层剂配方如下：石油醚70ml，乙醚30ml，乙酸1ml。展层结束后用固体碘进行可逆染色，将tag点从tlc板上刮取下来，转入安捷伦甲酯化反应瓶种，加入200μl上述氯仿甲醇溶剂后涡旋震荡20min后加入300μl上述盐酸甲醇进行甲酯化和gc-ms分析，后续操作与上述总脂肪酸分析一致。

实验结果表明，crlpaat过表达的衣藻转化子r16-1的脂肪酸总含量比对照组提高了34.75％(图8)。其中16:0脂肪酸占总脂肪酸的比例提高5％，c16:1的比例提高23.96％，18:1脂肪酸含量提高9.8％，18:0脂肪酸含量提高6.09％，其他脂肪酸含量略有下降(图9)。过表达藻种r16-1中tag含量较野生型提高了15.99％(图10)，tag中各脂肪酸各组分含量也有变化：16:0脂肪酸的含量提高了7.51％,16:1脂肪酸含量提高了13.30％，18:0脂肪酸含量提高了19.35％，c18:1,18:2及18:3脂肪酸的含量略有降低。此实验证实在微藻表达系统中，过量表达crlpaat1具有提高总脂、tag、以及改变脂肪酸组成的能力(图11)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。