人轮状病毒毒种ZTR-18毒株及其分离，培养及鉴定的制作方法

本发明涉及轮状病毒，尤其是人轮状病毒毒种毒株的分离、培养和鉴定。

背景技术：

灭活轮状病毒疫苗是一种安全有效地预防儿童因感染轮状病毒所引起疾病的疫苗。但至今仍未有灭活轮状病毒疫苗产品上市。目前临床前研究或投放市场的轮状病毒疫苗均为口服减毒活疫苗，减毒活疫苗尽管有一定效果，但在安全性方面存在缺陷，例如引发肠套叠和毒力回复突变及产生新的变异株的风险；以及冷链保存系统要求费用高，因此，研制安全、有效的灭活轮状病毒疫苗不仅在避免减毒活疫苗使用中存在的问题方面具有优势，也为未来研制联合疫苗提供基础。综上所述，研制灭活轮状病毒疫苗具有重要意义及应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种人源性轮状病毒野生型单一纯化毒株，该毒株病毒复制能力强，遗传稳定性好；该毒种可应用于开发人用轮状病毒疫苗的生产毒种，适用包括减毒型轮状病毒口服疫苗及灭活型人轮状病毒注射疫苗；并提供上述毒株的分离、培养和鉴定方法。

本发明公开了一种人轮状病毒毒种毒株，其特征在于为人轮状病毒毒种ztr-18毒株，已于2015年10月16日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc）提交保藏，编号：11288，分类命名：轮状病毒rotavirusa。

本发明所涉及ztr-18毒株的分离方法：

（1）获取病毒样本

收集医院儿科腹泻病患幼儿腹泻排泄物标本，重悬于0.01mpbs，ph7.2溶液中，12000g离心20分钟取上清液，并使用0.22μm滤器除菌过滤，-20℃保存备用；

（2）ztr-18毒株病毒在ma104细胞上的适应

采用0.25%胰酶-edta消化已形成单层的p64代ma104细胞，待细胞经消化形成单个后，以deme-8%bcs重悬细胞，稀释至10^5.0细胞/ml，按2×10^5.0细胞/瓶接种小方瓶，37℃培养3～4天后，将轮状病毒感染的患儿腹泻样本稀释液200μl接种于细胞单层，37℃吸附2小时，随后加入不含小牛血清的dmem细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变，至3～4天出现细胞病变后，收获培养物后继续同法接种ma104细胞传代或冻存备用；

在本发明的轮状病毒分离方法中，通过改良传统轮状病毒分离方法，采用11300×g离心30分钟取上清液，并采用100k超滤膜包浓缩15倍体积，获得较高的病毒回收得率和除杂效果，37℃培养并观察细胞病变，改善了轮状病毒初代培养效率。

本发明所涉及ztr-18毒株的培养方法：

（1）ztr-18毒株病毒在vero细胞上的适应：

采用0.25%胰酶-0.01%edta消化已形成单层的p148代vero细胞，并以dmem-8%bcs重悬细胞，按10^5.0细胞/瓶接种小方瓶，37℃培养3～4天至形成致密细胞单层后，接种原ma104细胞收获的病毒液1ml，接种量约为10^5.0～10^6.0ccid50/ml，37℃吸附2小时，随后加入不含小牛血清的dmem细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变，收获培养物后继续同法接种vero细胞传代或冻存备用；

本发明涉及的轮状病毒培养及制备方法是基于传统病毒型疫苗毒种制备的方法进行适应于新基因型人轮状病毒的改良。

本发明所涉及ztr-18毒种的鉴定方法：

（1）ztr-18毒株病毒滴度测定：

取毒种10倍系列稀释，接种ma104单层细胞进行病毒pfu滴定，按10^5.0细胞/1000μl/孔加入ma104细胞至6孔培养板，37℃培养3～4天细胞生长为致密单层，加入10倍系列稀释的毒种，每个稀释度2个孔，37℃吸附1小时后加入不含小牛血清的dmem细胞维持液，加入1.0%琼脂糖凝胶，37℃培养3天，加入1.0%含0.02mg/ml终浓度的中性红琼脂糖凝胶，37℃继续倒置培养4天，观察结果；

（2）中和鉴别实验：

将分离毒株病毒抗血清按梯度稀释后，100μl/孔接入96孔平底组织培养板，加入梯度稀释的收获病毒，37℃co2孵箱中和1小时后，按104细胞/100μl/孔加入经消化悬浮的vero细胞，37℃co2孵箱中培养8～10天，观察结果；

（3）ztr-18毒株病毒基因组核酸及逆转录、cdna质粒构建：

病毒基因组的核酸提取按takaraminibest病毒基因组rna提取试剂盒操作手册进行，病毒基因rna逆转录使用takaraonesteprt-pcr试剂盒，按操作手册进行，并根据a组轮状病毒g3型基因型全基因序列设计合成针对11个rna片段的11对引物，并分段以rt-pcr方法获得11个cdna基因片段，克隆入pmd19-t载体中，逐一进行测序；

本发明涉及的轮状病毒毒种鉴定方法是基于传统病毒型疫苗毒种制备的方法进行适应于人轮状病毒的改良。其中病毒滴度的检测方法改良pfu检测方法。

附图说明

图1电子显微镜下的轮状病毒形态。

图2部分腹泻病例排泄物轮状病毒基因组page电泳检测。

图3分离毒株ztr-18在ma104细胞上传代培养情况。

图4正常ma104细胞及分离毒株ztr-18在细胞上的病变情况，图中a:正常ma104细胞，b:ztr-18毒株在ma104细胞上的病变。

图5分离毒株ztr-18传代page基因组电泳图。

图6ztr-18毒株传代rt-pcr扩增轮状病毒特异性vp7基因电泳图。

具体实施方式

实施例1、如图1-6所示

1、ztr-18毒株的分离方法：

（1）获取病毒样本

收集医院儿科腹泻病患幼儿腹泻排泄物标本，重悬于0.01mpbs，ph7.2溶液中，12000g离心20分钟取上清液，并使用0.22μm滤器除菌过滤，-20℃保存备用；

（2）ztr-18毒株病毒在ma104细胞上的适应

采用0.25%胰酶-edta消化已形成单层的p64代ma104细胞，待细胞经消化形成单个后，以deme-8%bcs重悬细胞，稀释至10^5.0细胞/ml，按2×10^5.0细胞/瓶接种小方瓶，37℃培养3～4天后，将轮状病毒感染的患儿腹泻样本稀释液200μl接种于细胞单层，37℃吸附2小时，随后加入不含小牛血清的dmem细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变，至3～4天出现细胞病变后，收获培养物后继续同法接种ma104细胞传代或冻存备用；

在本发明的轮状病毒分离方法中，通过改良传统轮状病毒分离方法，采用11300×g离心30分钟取上清液，并采用100k超滤膜包浓缩15倍体积，获得较高的病毒回收得率和除杂效果，37℃培养并观察细胞病变，改善了轮状病毒初代培养效率。

2、ztr-18毒株的培养方法：

（1）ztr-18毒株病毒在vero细胞上的适应：

采用0.25%胰酶-0.01%edta消化已形成单层的p148代vero细胞，并以dmem-8%bcs重悬细胞，按10^5.0细胞/瓶接种小方瓶，37℃培养3～4天至形成致密细胞单层后，接种原ma104细胞收获的病毒液1ml，接种量约为10^5.0～10^6.0ccid50/ml，37℃吸附2小时，随后加入不含小牛血清的dmem细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变，收获培养物后继续同法接种vero细胞传代或冻存备用；

本发明涉及的轮状病毒培养及制备方法是基于传统病毒型疫苗毒种制备的方法进行适应于新基因型人轮状病毒的改良。

3、ztr-18毒种的鉴定方法：

（1）ztr-18毒株病毒滴度测定：

取毒种10倍系列稀释，接种ma104单层细胞进行病毒pfu滴定，按10^5.0细胞/1000μl/孔加入ma104细胞至6孔培养板，37℃培养3～4天细胞生长为致密单层，加入10倍系列稀释的毒种，每个稀释度2个孔，37℃吸附1小时后加入不含小牛血清的dmem细胞维持液，加入1.0%琼脂糖凝胶，37℃培养3天，加入1.0%含0.02mg/ml终浓度的中性红琼脂糖凝胶，37℃继续倒置培养4天，观察结果；

（2）中和鉴别实验：

将分离毒株病毒抗血清按梯度稀释后，100μl/孔接入96孔平底组织培养板，加入梯度稀释的收获病毒，37℃co2孵箱中和1小时后，按104细胞/100μl/孔加入经消化悬浮的vero细胞，37℃co2孵箱中培养8～10天，观察结果；

（3）ztr-18毒株病毒基因组核酸及逆转录、cdna质粒构建：

病毒基因组的核酸提取按takaraminibest病毒基因组rna提取试剂盒操作手册进行，病毒基因rna逆转录使用takaraonesteprt-pcr试剂盒，按操作手册进行，并根据a组轮状病毒g3型基因型全基因序列设计合成针对11个rna片段的11对引物，并分段以rt-pcr方法获得11个cdna基因片段，克隆入pmd19-t载体中，逐一进行测序；

4、ztr-18毒种的免疫效力评价方法：

（1）轮状病毒疫苗样品免疫原性分析

为了解轮状病毒疫苗样品免疫原性的变化情况，选取第5代病毒收获液，经纯化灭活制备为免疫用疫苗样品后，以40e.u./100μl、80e.u./100μl、160e.u./100μl（rotaviruselisaunit）三个剂量，每个剂量肌内注射6只小鼠（balb/c品系，体重约16g，年龄约3个月，公母个半），阴性对照6只注射pbs100μl。免疫后2、4、6、8周取血分离血清进行血清抗体elisa效价分析。

（2）轮状病毒疫苗样品免疫效力分析

为了解轮状病毒疫苗样品免疫原性的变化情况，选取第5代病毒收获液，经纯化灭活制备为免疫用疫苗样品后，以40e.u./100μl、80e.u./100μl、160e.u./100μl（rotaviruselisaunit）三个剂量，每个剂量肌内注射6只小鼠（balb/c品系，体重约16g，年龄约3个月，公母个半），阴性对照6只注射pbs100μl。免疫后2、4、6、8周取血分离血清进行中和抗体效价测定。免疫后4、8周取血进行基于流式细胞技术的细胞免疫分析。

（3）免疫血清特异性轮状病毒抗体elisa效价评价实验

将羊抗轮状病毒免疫多克隆抗体（millipore公司）用碳酸盐缓冲液(ph值9.6)按1：1000稀释，每孔100μl在96孔elisa板4℃包被过夜；之后去除包被液，用含0.5%tween-20的pbs溶液（pbst溶液）洗板3次，每次3min；用含有3%牛血清白蛋白的pbst溶液，100μl/孔，37℃封闭2小时；去除，pbst洗板，将纯化轮状病毒抗原每孔500ffa(ccid50)/100μl加入elisa板，37℃温育1h；洗板后，2倍梯度稀释待测小鼠免疫血清，100μl/孔加入elisa板，37℃结合1h；pbst洗板，加入用pbst缓冲液1：5000稀释的hrp标记的山羊抗小鼠抗体（millipore公司），100μl/孔，37℃结合1h；pbst洗板，用tmb，100μl/孔，在室温显色15min，再用2mh2so4终止显色；用酶标仪在450nm检测光密度值。当待测血清的光密度值是阴性血清的2.1倍时，认为该待测血清为阳性，血清抗体的滴度用血清稀释度的倒数表示。

检测体系采用经纯化的灭活轮状病毒免疫豚鼠血清作为阳性参考品，无轮状病毒pbs免疫豚鼠血清作为阴性参考品，pbst缓冲液1：5000稀释的hrp标记的山羊抗豚鼠抗体（millipore公司）作为酶标二抗标定检测系统的有效性。

（4）免疫血清轮状病毒中和抗体效价评价实验

将免疫血清按2被梯度稀释后，按100μl/孔加入96孔平底组织培养板，每孔按100ccid50/100μl/孔加入稀释后的收获病毒液，37℃co2孵箱中和2小时后，加入已用不含小牛血清的dmem维持溶液37℃co2处理1小时的培养成致密单层的96孔平底组织培养板，37℃co2孵箱培养24小时，吸出溶液，加入不含小牛血清的dmem维持溶液37℃co2培养16小时后，用50%（v/v）甲醛溶液4℃固定细胞板2小时，除净甲醛，随后加入含1：500稀释抗轮状病毒豚鼠血清（中国医学科学院医学生物学研究所制备）的5%bsa-pbsph7.2溶液，37℃培养1小时，洗板后加入含1：2000稀释的羊抗豚鼠fitc标记抗体(millipore公司)的5%bsa-pbsph7.2溶液，37℃培养1小时，洗板后在荧光显微镜下判定结果。记录无荧光信号标记细胞的最高血清稀释度，血清中和抗体的滴度用血清稀释度的倒数表示。