一种可调节的荧光素酶分段融合蛋白、其制备方法及应用与流程

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种可调节的荧光素酶分段融合蛋白、其制备方法及应用。

背景技术：

随着对亚细胞结构和功能、分子生理和病理、细胞间和细胞内信号通路研究的深入，人类对疾病和对生命本质的认识不断追朔到蛋白质、基因水平。而许多生命活动是以蛋白质分子的结合和解离来实现的，细胞的各种重要生理活动，细胞对外界环境及内环境作用的反应等，均是以蛋白质间相互作用为纽带，通过调控、介导细胞的生物学活性，形成信号转导网络系统。因此，对蛋白质相互作用的深入研究是认识和理解各种生命现象的必要前提。

荧光素酶在有氧的条件下通过催化底物氧化而产生荧光，发射波长范围为400-600nm，峰值在450-500nm，且因其灵敏性高，特异性好，反应迅速，无生物性毒害等优势，可实时靶向基因分子事件、细胞生命活动、动物生理病理等生物学过程，是研究生物体内蛋白质动态相互作用的重要基础，目前被广泛应用于生命科学、医学研究及药物研发等相关领域。

传统研究蛋白质相互作用的方法有酵母双杂交、磷酸化抗体、免疫荧光、放射性标记等，但这些方法存在假阳性高，不能获得定量化信息，在实际的生理环境中需要破碎细胞造成机械损伤，无法做到在活细胞生理条件下实时监测细胞内蛋白质相互作用等缺陷。现今最为常见的活细胞蛋白质相互作用模型有2种，一种是cfp和yfp等荧光蛋白质来实现的荧光共振能量转移(fret)。这种技术由于荧光蛋白的量子产率低，供体与受体荧光光谱的差异小等问题，在实际开展中导致检测通道间相互干扰，高背景噪音等现象，要求非常苛刻的校准过程去除干扰降噪，这些都极大地限制了该技术进一步的发展和广泛的应用。另外一种是双分子荧光互补技术用于细胞体内蛋白质相互作用动态研究。cn101620233a公开了一种利用双分子荧光互补技术，基于橙红荧光蛋白和远红荧光蛋白，进行检测蛋白质之间的相互作用。但双荧光互补技术(bifc)实时性较差，其要求两个片段在切开面能互补重新整合形成完整的荧光蛋白恢复荧光蛋白活性，此过程因组装分子荧光互补体系的不同而存在时间上的差异，几分钟甚至到几小时才能顺利检测到荧光互补信号，特别在活细胞体内这样一个复杂的环境，实际情况不得而知，仅仅通过光学信号强度改变来评估蛋白质相互作用在极大程度上可能存在偏差。

技术实现要素：

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种可调节的荧光素酶分段融合蛋白，所述融合蛋白包括荧光素酶n端蛋白、柔性肽段1、mbp蛋白、活性阀门、柔性肽段2和荧光素酶c端蛋白；

其中，所述荧光素酶n端蛋白和荧光素酶c端蛋白共同组成荧光素酶；所述活性阀门为一段4-8个疏水短肽氨基酸。

本发明制备得到的可调节的荧光素酶分段融合蛋白，其基于荧光素酶的高荧光强度，设计在荧光素酶基因的位点之间引入一段4～8个短肽链氨基酸序列作为“活性阀门”，并在该氨基酸序列的两侧引入一段疏水性并具有一定伸展性的柔性肽链以减小“阀门钥匙”作用时造成的空间位阻，同时设计引入male基因表达mbp蛋白促进荧光素酶融合体的可溶性表达。这样可将荧光素酶基因分开形成2个片段，分别为n端和c端的2个多肽链，当荧光素酶基因的n片段、c片段、“活性阀门”和male的融合片段在细胞内共同表达时，融合体蛋白中的2个荧光素酶片段在空间距离上很靠近而产生相互作用可实现荧光互补，会形成完整的具有生物活性的荧光素酶，它能催化相应的底物而产生荧光信号，实现动态相互作用模型的on模式。当向该体系加入“活性阀门”氨基酸序列的“阀门钥匙”即特异性剪切酶时，因其特异性剪切作用，会将荧光素酶的2个片段在空间上切开，加入相应的底物时，会形成2个不产生荧光信号的n片段和c片段，实现动态相互作用模型的off模式。

作为优选技术方案，所述活性阀门位于荧光素酶中间靠近n端位置。

本发明中，活性阀门可以插入荧光素酶的任何位置，优选为中间靠近n端的位置，如gaussia荧光素酶的arg93和cys94，renilla荧光素酶的leu110和pro111位点及gly229和lys230都是可行的。

优选地，所述活性阀门的氨基酸序列包括iegr，enlypqg，plgmwsr，plgvr，lvprgs，ddddk，levlfqgp或levlfqgp中的任意一种。

优选地，所述荧光素酶包括gaussia荧光素酶、renilla荧光素酶、cypridina荧光素酶或redfirefly荧光素酶中的任意一种。

优选地，所述柔性肽段1和柔性肽段2分别独立选自gggs，(gggs)2，(gggs)3，(gggs)4，gsgs，(gsgs)2，(gsgs)3，(gsgs)4中的任意一种。

本发明中，所述柔性肽段可减少特异性酶切造成的空间位阻。

第二方面，本发明提供一种dna片段，所述dna片段编码如第一方面所述的融合蛋白。

第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的如第二方面所述的dna片段。

第四方面，本发明提供一种重组的宿主细胞，所述宿主细胞含有第三方面所述的表达载体。

第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的可调节的荧光素酶分段融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1)选取插入位点，采用分段克隆，逐段构建包含荧光素酶n端蛋白、柔性肽段1、mbp蛋白、活性阀门、柔性肽段2和荧光素酶c端蛋白的重组载体；

(2)将重组载体转化到克隆菌种，筛选含有所述融合蛋白基因序列的阳性转化菌；

(3)从所述阳性转化菌中提取所述重组载体，并转化到表达菌中，得到含有所述融合蛋白的基因序列的阳性表达菌，对所述阳性表达菌扩大培养，诱导所述融合蛋白表达；

(4)融合蛋白的表达及纯化。

第六方面，本发明提供一种如第一方面所述的可调节的荧光素酶分段融合蛋白用于蛋白动态相互作用的模型的构建和检测。

优选地，所述检测可用于核酸、蛋白、细菌、病毒或重金属离子的检测。

本发明中的蛋白质动态相互作用模型，不仅可直接对体系中能够影响荧光素酶片段的生物标记物进行定量检测，也可通过在两个片段的柔性肽链末端修饰生物标志物，如dna、rna、核酸类似物、蛋白、抗体、多肽等，利用生物分子诱导荧光素酶片段重建互补on模式，从而实现对多种生物标记物的靶向物质检测。

优选地，所述模型的构建方法包括以下步骤：

(1’)将制备得到的荧光素酶分段融合蛋白与底物进行混合，用酶标仪检测体系中的生物发光强度；

(2’)向步骤(1)的体系中加入剪切酶，孵育，再加入底物，混匀后通过酶标仪检测体系中的生物发光强度。

优选地，所述底物的浓度为0.1-1μg/μl，例如可以是0.1μg/μl、0.2μg/μl、0.3μg/μl、0.4μg/μl、0.5μg/μl、0.6μg/μl、0.7μg/μl、0.8μg/μl、0.9μg/μl或1μg/μl，优选为0.2-0.8μg/μl，进一步优选为0.5μg/μl。

优选地，所述底物为肠腔素、荧光素或海萤荧光素中的任意一种或至少两种的混合。

优选地，所述剪切酶为factorxa因子蛋白酶，烟草蚀纹病毒(tev)蛋白酶，基质金属蛋白酶-9，基质金属蛋白酶-2，凝血酶，肠激酶，prescission蛋白酶或人鼻病毒3c蛋白酶中的任意一种。

本发明中，剪切酶作为“活性阀门”的“阀门钥匙”，能够特异性的剪切“活性阀门”，将荧光素酶的2个片段在空间上切开，加入相应的底物时，会形成2个不产生荧光信号的n片段和c片段，实现动态相互作用模型的off模式。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)针对荧光共振能量的高信噪比和传统双荧光互补的技术时差性等问题，通过构建一种融合蛋白质片段互补模型，实现生物发光；

(2)荧光素酶具有高的荧光强度，良好的酶稳定性和分泌活性，不需要外界光源的激发，无散射、穿透率高、通过生物的自身发光，大大减少可能由发射光源带来的背景干扰并具有极高的信噪比；

(3)通过短肽链氨基酸序列作为“活性阀门”并以特异性剪切酶作为“阀门钥匙”的活性调节方式，实现一种新型的荧光互补蛋白开关模式，可用于评估其他蛋白质动态相互作用如配体与底物的结合作用、能产生新结合位点的相互作用、使蛋白去活化的蛋白-蛋白相互作用、改变蛋白作用底物特异性的蛋白-蛋白相互作用等；

(4)可以用作现今开发的多种荧光素酶双荧光互补体系的正对照；

(5)可以在模型中间设计引入其他模块实现生物传感功能，特别在医药领域，可针对蛋白质靶点的药物设计实现高通量药物筛选。

附图说明

图1为本发明以gaussia荧光素酶为例的表达载体构建示意图；

图2为本发明gaussia荧光素酶的蛋白表达sds-page电泳分析图；

图3为本发明gaussia荧光素酶发射光谱图；

图4为本发明构建的一种荧光素酶分段融合蛋白质动态相互作用模型的示意图；

图5为本发明利用本发明构建的模型，通过免疫夹心法实现荧光互补动态模型用于检测生物标记物的示意图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1gausssia荧光素酶融合片段的制备

(1)选择该荧光素酶融合体基因的表达载体为pet21a，再通过筛选荧光素酶合适的插入位点，最终选择在arg93和cys94之间插入外源片段，即形成n片段ngluc1(1～93aa)和c片段cgluc1(94～185aa)；

(2)以重组载体pet28a-gluc1为模板，设计扩增ngluc1片段时，在引物5’端引入bamhⅰ和ecorⅰ酶切位点，而设计扩增cgluc1片段时，在引物5’端引入hindⅲ和notⅰ酶切位点，并且都设计引入柔性肽链(ggggs)4以减少特异性酶切造成的空间位阻；

设计的引物序列如下：

gluc1上游引物(bamhⅰ)：

5’-cgcggatccatgaagcccaccgagaacaacgaag-3’；

ngluc1下游引物(ecorⅰ)：

5’-ccggaattcgctgccgcctccgccgcttcctccgcctccgcttccgcctccgccgcgtcctgggatgaacttcttc-3’；

cgluc1上游引物(hindⅲ)：

5’-cccaagcttggcggaggcggaagcggaggcggaggaagcggcggaggcggcagctgccacacctacgaaggcg-3’；

gluc1下游引物(notⅰ)：

5’-aaggaaaaaagcggccgcgtcgtcgtctccgtcgtcgtctccttagtcgtcgtctccgtcgtcg-3’。

以载体pmal-c2x为模板，设计引物5’端引入ecorⅰ和hindⅲ酶切位点扩增male基因，并设计引入“活性阀门”的短肽链氨基酸序列factorxacleavagesite(ile-glu-gly-arg)。

设计的引物如下：

male上游引物(ecorⅰ)：

5’-ccggaattcatgaaaatcgaagaaggtaaactggtaatctggattaacggcg-3’；

male下游引物(hindⅲ)：

5’-cccaagcttccttccctcgatcccgaggtt-3’。

(4)在克隆融合体片段时采用分段克隆的方式，首先构建重组载体pet21a-ngluc1，其次构建包含有“活性阀门”factorxacleavagesite的重组载体pet21a-ngluc1-male，最后构建含有“活性阀门”重组载体pet21a-ngluc1-male-cgluc1，构建的载体如图1所示；

(5)利用t4dna连接酶将具有粘性末端的基因片段与具有同样粘性末端的载体在22℃下孵育连接，随后通过42℃热处理转化到大肠杆菌感受态细胞dh5α，经37℃培养复苏并涂布到lb平板(含有100μg/ml氨苄青霉素)筛选，挑取菌落进行菌落pcr和双酶切鉴定阳性克隆；

(6)对菌落进行液体lb培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素)培养并提取质粒，通过基因测序鉴定正确的克隆；

(7)将测序鉴定正确的质粒热处理转化到bl21(de3)大肠杆菌表达菌株，并进行甘油菌保种冻存以备用。

实施例2荧光素酶融合体和gaussia荧光素酶的表达及纯化

(1)菌株活化：将冻存的甘油菌pet21a-ngluc1-male-cgluc1和pet28a-gluc1分别接种到lb液体培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素)中37℃，225rpm培养过夜活化菌株；

(2)菌株发酵：按1:100的比例将活化的菌液接种到新鲜的lb液体培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素)中培养至od600达到0.4～0.6，即为菌种的生长对数期；

(3)诱导表达：加入诱导剂异丙基-β-d-1-硫代半乳糖苷iptg(终浓度为1mm)在28℃下诱导荧光素酶融合体的高速表达，4℃下11000rpm离心10min收集菌体，弃去上清lb培养基，加入一定量的结合缓冲液(20mmna3po4,0.5mnacl,40mmimidazole,ph7.4)悬浮菌体；

(4)超声破碎细胞：利用超声波破碎菌体，超声3sec，间隔4sec，超声时间30min后4℃离心高速分离去除不溶性蛋白，获得上清可溶性蛋白；

(5)亲和层析纯化蛋白：利用ni柱中的填料硫酸镍与表达载体上的组氨酸标签融合蛋白能特异性结合的原理去除杂蛋白，再用咪唑洗脱液(20mmna3po4,0.5mnacl,150mmimidazole,ph7.4)的竞争性结合到ni柱填料，将组氨酸融合蛋白从柱子上洗脱下来，得到的蛋白经透析去除咪唑得到荧光素酶融合体目的蛋白，纯化后的蛋白电泳图如图2所示。

实施例3荧光素酶融合体蛋白动态相互作用模型的构建

(1)实现蛋白质动态相互作用的on模式

在96孔白色的酶标板中加入1×pbs(ph7.4)缓冲液，分别加入已用缓冲液稀释到一定浓度的荧光素酶融合体蛋白，迅速加入终浓度为0.5μg/μl的肠腔素(coelenterazine)底物，保证该体系的总体积为200μl，充分混匀后，立即使用酶标仪检测体系中的生物发光强度(荧光素面的发射光谱图如图3所示，检测波长在480-500nm)，实现蛋白质动态相互作用模型的on模式。并以gaussia荧光素酶作为对照组评估该模型；

(2)实现蛋白质动态相互作用的off模式

向反应体系中加入一定浓度的剪切酶factorxaprotease，混匀并孵育一段时间后，迅速加入终浓度为0.5μg/μl的肠腔素底物，充分混匀后立即通过酶标仪检测体系中的生物发光强度，实现蛋白质动态相互作用模型的off模式；

并通过2种模式的比较评估该荧光素酶融合体蛋白动态相互作用模型，模型示意图如图4所示。

(3)剪切酶factorxaprotease的工作曲线

将底物肠腔素与一定浓度的factorxaprotease加入该反应体系，反应一段时间，观察荧光信号的变化，通过对荧光强度的测量，绘制检测factorxaprotease浓度工作曲线，分析剪切酶factorxaprotease调节模型动态相互作用情况。

(4)检测剪切酶factorxaprotease的浓度

将底物肠腔素与待测样品加入体系，反应一段时间，观察荧光信号的变化，通过对荧光强度的测量，结合工作曲线，计算得到目标factorxaprotease的浓度。

实施例4海肾荧光素酶融合片段的制备

(1)选择该荧光素酶融合体基因的表达载体为pet21a，再通过筛选荧光素酶合适的插入位点，最终选择在leu110和pro111之间插入外源片段，即形成n片段nrluc8(1～110aa)和c片段crluc8(111～311aa)。

(2)以重组载体pbad-rluc8为模板，设计扩增ngluc1片段时，在引物5’端引入bamhⅰ和ecorⅰ酶切位点，而设计扩增cgluc1片段时，在引物5’端引入hindⅲ和notⅰ酶切位点，并且都设计引入柔性肽链(ggggs)4以减少特异性酶切造成的空间位阻。

设计的引物序列如下：

rluc8上游引物(bamhⅰ)：

5’-cgcggatccatgtccaaggtgtacgaccccgag-3’，

nrluc8下游引物(ecorⅰ)：

5’-ccggaattcgctgccgcctccgccgcttcctccgcctccgcttccgcctccgccaaggttcagcagctcgaaccaag-3’；

crluc8上游引物(hindⅲ)：

5’-cccaagcttggcggaggcggaagcggaggcggaggaagcggcggaggcggcagcccaaagaaaatcatctttgtgggccac-3’，

rluc8下游引物(notⅰ)：

5’-aaggaaaaaagcggccgcgtcgtcgtctccgtcgtcgtctccctgctcgttcttcagcacgc-3’；

以载体pmal-c2x为模板，设计引物5’端引入ecorⅰ和hindⅲ酶切位点扩增male基因，并设计引入“活性阀门”的短肽链氨基酸序列factorxacleavagesite(ile-glu-gly-arg)。

设计的引物如下：

male上游引物(ecorⅰ)：

5’-ccggaattcatgaaaatcgaagaaggtaaactggtaatctggattaacggcg-3’，

male下游引物(hindⅲ)：

5’-cccaagcttccttccctcgatcccgaggtt-3’；

(4)在克隆融合体片段时采用分段克隆的方式，首先构建重组载体pet21a-nrluc8，其次构建包含有“活性阀门”factorxacleavagesite的重组载体pet21a-nrluc8-male，最后构建含有“活性阀门”重组载体pet21a-nrluc8-male-crluc8；

(5)利用t4dna连接酶将具有粘性末端的基因片段与具有同样粘性末端的载体在22℃下孵育连接，随后通过42℃热处理转化到大肠杆菌感受态细胞dh5α，经37℃培养复苏并涂布到lb平板(含有100μg/ml氨苄青霉素)筛选，挑取菌落进行菌落pcr和双酶切鉴定阳性克隆；

(6)对菌落进行液体lb培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素)培养并提取质粒，通过基因测序鉴定正确的克隆；

(7)将测序鉴定正确的质粒热处理转化到bl21(de3)大肠杆菌表达菌株，并进行甘油菌保种冻存以备用。

实施例5荧光素酶融合体和海肾荧光素酶的表达及纯化

(1)菌株活化：将冻存的甘油菌pet21a-nrluc8-male-crluc8和pet28a-rluc8分别接种到lb液体培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素)中37℃，225rpm培养过夜活化菌株；

(2)菌株发酵：按1:100的比例将活化的菌液接种到新鲜的lb液体培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素)中培养至od600达到0.4～0.6，即为菌种的生长对数期。

(3)诱导表达：加入诱导剂异丙基-β-d-1-硫代半乳糖苷iptg(终浓度为1mm)在30℃下诱导荧光素酶融合体的高速表达。4℃下11000rpm离心10min收集菌体，弃去上清lb培养基，加入一定量的结合缓冲液(20mmna3po4,0.5mnacl,40mmimidazole,ph7.4)悬浮菌体；

(4)超声破碎细胞：利用超声波破碎菌体，超声3sec，间隔4sec，超声时间30min后4℃离心高速分离去除不溶性蛋白，获得上清可溶性蛋白；

(5)亲和层析纯化蛋白：利用ni柱中的填料硫酸镍与表达载体上的组氨酸标签融合蛋白能特异性结合的原理去除杂蛋白，再用咪唑洗脱液(20mmna3po4,0.5mnacl,100mmimidazole,ph7.4)的竞争性结合到ni柱填料，将组氨酸融合蛋白从柱子上洗脱下来，得到的蛋白经透析去除咪唑得到荧光素酶融合体目的蛋白。

实施例6荧光素酶融合体蛋白动态相互作用模型的构建

(1)实现蛋白质动态相互作用的on模式

在96孔白色的酶标板中加入1×pbs(ph7.4)缓冲液，分别加入已用缓冲液稀释到一定浓度的荧光素酶融合体蛋白，迅速加入终浓度为0.5μg/μl的肠腔素(coelenterazine)底物，保证该体系的总体积为200μl，充分混匀后，立即使用酶标仪检测体系中的生物发光强度，实现蛋白质动态相互作用模型的on模式。并以gaussia荧光素酶作为对照组评估该模型。

(2)实现蛋白质动态相互作用的off模式

向反应体系中加入一定浓度的剪切酶factorxaprotease，混匀并孵育一段时间后，迅速加入终浓度为0.5μg/μl的肠腔素底物，充分混匀后立即通过酶标仪检测体系中的生物发光强度，实现蛋白质动态相互作用模型的off模式。并通过2种模式的比较评估该荧光素酶融合体蛋白动态相互作用模型。

(3)单克隆抗体夹心诱导荧光素酶片段互补体系的构建

分别在nrluc8和crluc8的柔性肽链末端修饰上单抗a和单抗b，使得两种单抗在对应抗原(生物标记物)存在的情况下，形成免疫夹心，诱导nrluc8和crluc8靠近重建荧光素酶互补体系on模式，加入肠腔素底物，充分混匀后立即通过酶标仪检测体系中的荧光强度变化。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。