本发明涉及一种快速高效筛选维生素k2(mk-7)高产菌的方法，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：维生素k2是一类脂溶性凝血类维生素，为甲萘醌类系列化合物，根据其分子结构上c-3位异戊二烯侧链的长短不同共有14种形式，以mk-n表示(n指侧链上异戊二烯单位的个数)，甲萘醌-4(mk-4)和甲萘醌-7(mk-7)最为常见，而mk-7由于可快速被肠道吸收，在血液中的半衰期长等优点被广泛研究。维生素k2在骨质疏松症的预防和治疗方面具有显著的效果，被称为“第四代抗骨质疏松产品”。除此之外，维生素k2还可以迅速改善由于维生素k缺乏引起的出血，抗动脉钙化及骨关节炎，抗肿瘤，延缓衰老，修复损伤细胞，治疗帕金森症等，广泛地应用于医药、食品等领域。维生素k2的应用已得到了权威机构的认可。2005年日本批准维生素k2作为抗骨质疏松药物上市。我国国家食品药品监督管理局也将维生素k2列入“营养补充剂申报与审评规定(试行)”的“维生素、矿物质化合物名单”中(国食药监注[2005]202号)，可用做保健食品或营养强化剂的原料。2008年1月，维生素k2通过美国食品药品监督管理局(fda)安全认定。2009年，欧洲议会和欧盟理事会决定在其所有成员国中，维生素k2可用作保健食品或营养强化剂的原料(2009/345/ec)。目前，国内外维生素k2的专利主要涉及三方面内容，一方面是发酵过程调控的优化(ep1803820b1；cn104357355a)；一方面是维生素k2产物的分离提取(cn103898175a；us20060057688a1)；另一方面是菌种筛选，达能日尔维公司(法国)采用杆菌肽或过氧化物使乳酸菌自然变种(us7981657b2)；上海红马饲料有限公司采用紫外和亚硝基胍复合诱变，结合原生质体融合技术筛选维生素k2高产菌株(cn102827798a)。目前，工业化生产维生素k2大多是都以化学合成法生产，由于微生物发酵法生产其产量太低，成本过高，无法作为批量生产的主要途径，需要进行诱变筛选提高产量。菌株筛选的方法一般为化学诱变法，物理诱变法，离子注入诱变法和原生质体诱变法等。其中，常压室温等离子体(artp)诱变不仅可以对微藻、细菌、真菌、酵母等微生物进行快速诱变，而且由于其正突变率高，与传统诱变方式相比，更容易获得遗传稳定性良好的优良突变菌。在大多数革兰氏阳性细菌中，维生素k2(甲基萘醌类)是细胞内唯一的内源性亲脂抗氧化剂，也是呼吸链中不可或缺的电子传递体。其作用效果和coq相似，通过维持线粒体dna和基因的稳定促进细胞的生存，通过调节细胞线粒体通透性转换孔等起到独立的抗凋亡作用。本发明拟采用artp方法对纳豆芽孢杆菌的出发菌株进行诱变，并针对抗反馈突变菌株(结构类似物抗性突变菌)和抗呼吸链抑制剂的菌株的筛选进行了一系列实验，通过对比底物消耗速率、生物量和产量等方面，从而获得高产菌株，为实现维生素k2的微生物发展的工业化奠定基础。技术实现要素：本发明需要解决的技术问题在于，现有技术中菌种选育过程效率过低，无法获取高产菌株；为了解决该问题，本发明提供一种快速高效筛选维生素k2(mk-7)高产菌的方法。具体的，本方案为：一种快速高效筛选维生素k2高产菌的方法，其中，以纳豆芽孢杆菌为出发菌株，经常压室温等离子体(artp)诱变原始菌株，诱变后的菌株用含维生素k2结构类似物的平板选育后，再在含呼吸链抑制剂的平板上进行选育，并经96孔培养板发酵复筛，获取维生素k2高产菌。本发明所述的方法，其中，具体步骤为：(1)将纳豆芽孢杆菌出发菌株在种子培养基中活化；(2)将灭菌的金属载片置于已灭菌的玻璃平板中，将活化后的纳豆菌菌悬液均匀涂布于载片上，分别在artp-ii型诱变机中进行诱变；(3)纳豆菌菌悬液诱变完成后，将其用生理盐水洗脱，并涂布在添加维生素k2结构类似物无菌平板上，挑选出单菌落在96孔培养板中发酵，将维生素k2高产菌株进行保藏；(4)将步骤(3)获得的纳豆芽孢杆菌活化后，均匀涂布在添加呼吸链抑制剂无菌平板上，挑选出单菌落在96孔培养板中发酵，将维生素k2高产菌株进行保藏。本发明所述的方法，其中，所述步骤(2)中，常压室温等离子体诱变采用artp-ii型诱变机，以时间为可变参数，功率设定为100w，气流量设定为10slm，调整诱变时间为30～150s。本发明所述的方法，其中，在k2结构类似物无菌平板中添加了2.5～20mg/l维生素k2结构类似物，所述维生素k2类似物为1-羟基-2-萘甲酸、2-甲基-1,4-萘醌、对苯醌、1-萘酚中的一种或几种。本发明所述的方法，其中，所述步骤(4)中，添加呼吸链抑制剂无菌平板中添加了5～200mg/l呼吸链抑制剂，所述呼吸链抑制剂为鱼藤酮和氰化物中的一种或几种。本发明所述的方法，其中，所述步骤(1)中，种子培养基为30g/l葡萄糖，40g/l蛋白胨，5g/lnacl，5g/l牛肉膏，5g/l酵母膏，培养温度37℃，120rpm培养1d。本发明中所述的维生素k2为mk-7型。在一个优选的实施方案中，包括如下步骤：(1)将纳豆芽孢杆菌原始菌株在种子培养基上活化；(2)根据菌浓度计算稀释倍数，利用灭菌后的生理盐水将活化菌液的od600稀释至0.5～2.0之间，取10ul菌液均匀涂于金属载片上，不经风干，将装有样品的金属载片移至artp诱变系统操作仓进行诱变实验。其中，artp诱变时间为30s、45s、60s、90s、120s和150s，优选60s。(3)纳豆菌菌悬液诱变完成后，将其用生理盐水洗脱，并涂布在添加维生素k2结构类似物无菌平板上；对新的菌悬液进行适当稀释、涂布含维生素k2结构类似物的初筛平板，培养计数，挑选生长旺盛的单菌落进行96孔培养板发酵，对维生素k2高产菌株进行保藏；其中，所述的维生素k2结构类似物为1-羟基-2-萘甲酸、2-甲基-1,4-萘醌、对苯醌、1-萘酚中的任意一种或几种的混合物。添加浓度为2.5～20mg/l，优选5mg/l。(4)对步骤3获得的维生素k2高产菌株进行培养后，适当稀释、涂布含呼吸链抑制剂的初筛平板，培养计数，挑选生长旺盛的单菌落进行96孔培养板发酵，对维生素k2高产菌株进行保藏；其中，所述的呼吸链抑制剂为鱼藤酮和氰化物乙腈中的任意一种或几种的混合物。鱼藤酮的添加浓度为20～200mg/l，优选150mg/l；乙腈的添加浓度为5～80mg/l优选20mg/l。(5)将上述高产菌株进行摇瓶培养。按5％接种量接种到装有100ml发酵培养基的带挡板的500ml三角瓶中，发酵培养基为50g/l甘油、30g/l大豆蛋白胨、0.6g/l酵母粉、0.3g/lk2hpo4、0.1g/lcacl2·h2o、0.3g/lmgso4.7h2o，在37℃下200rpm培养3d。本发明的有益效果在于：(1)本发明所采取常压室温等离子体诱变能使微生物细胞壁或细胞膜的结构及通透性发生改变，引起基因损伤，artp富含的高活性能量粒子对菌体的遗传物质造成损伤，并诱发细胞启动sos修复机制。而修复过程中会产生丰富的基因突变位点，并最终稳定遗传进而形成突变株。与传统诱变方式相比，具有正突变率高，操作简介，诱变成本低，适用范围广和易获得遗传稳定性良好的突变菌等优点。(2)本发明所公开的诱变手段再结合结构类似物进行抗性筛选，可以阻碍代谢物的正常生成，定向的改变了反馈抑制的酶的结构(抗反馈抑制)，或者改变了阻遏的酶的生成的系统(抗反馈阻遏)，所以只有对结构类似物并不敏感的突变菌才能继续生长，大大提高了筛选频率。(3)本发明所公开的诱变手段再结合呼吸链抑制剂进行抗性筛选，可以使纳豆芽孢杆菌呼吸链受阻，诱导菌种定向向抗呼吸链抑制剂的方向突变。分离出来的菌株外形大致分为三种，分别为白色褶皱形、全透明水滴形和膜包裹的半透明菌落。全透明水滴形和膜包裹的高粘性透明菌落，有拉丝情况出现，而白色褶皱菌落的mk-7含量较高。附图说明图1实施例6三种典型突变菌体形态对比图。具体实施方式实施例1：本实施例说明本发明的生物材料来源信息本发明中的生物材料为纳豆芽孢杆菌，分离自市场上购买的纳豆产品。实施例2：本实施例子说明artp诱变的过程将纳豆芽孢杆菌在固体平板上活化培养，活化培养后的菌体用生理盐水悬浮。用生理盐水将菌体适当稀释成od600值在0.5～2.0之间，于超净台将金属载片置于酒精灯外焰灼烧30s，冷却后放到已灭菌的玻璃平板中，取10ul菌悬液均匀涂于载片，不经风干，进行诱变。artp诱变系统操作仓先开紫外灭菌30min，再用无菌镊子将载片放至artp诱变系统操作仓，调节载台下方旋钮，使载片处于气流端口2mm处。设置仪器功率为100w、气流量参数为10slm，以诱变时间为可变参数，诱变时间为30s、45s、60s、90s、120s、150s。样品处理完毕，将载片放至装有490ul生理盐水的ep管中，震荡5min，把纳豆芽孢杆菌洗脱到液体中，形成新的菌悬液。结果表明，经等离子体射流处理30s、45s、60s、90s、120s和150s，其致死率分别为19.89％、37.63％、58.18％、90.91％、98.18％和100％。实施例3：本实施例说明结构类似物浓度临界值确定的过程将活化培养后的菌体用生理盐水稀释至10-1～10-7之间，取100ul稀释液涂布平板。其中，固体平板的配方为：30g/l葡萄糖，40g/l蛋白胨，5g/lnacl，5g/l牛肉膏，5g/l酵母膏，20g/l琼脂，2.5～20mg/l1,4-二羟基-2-萘甲酸、对苯醌、2-甲基-1,4-萘醌或1-萘酚。结构类似物由于与代谢产物结构相似，能与阻遏物及变构酶相结合，使酶的催化作用不可逆地被抑制。以不同种类维生素k2结构类似物作为预筛选来确定纳豆芽孢杆菌的敏感性临界值，选育抗性突变株，一系列浓度的类似物添加到平板上。表1维生素k2结构类似物抗性浓度试验浓度(mg/l)2.557.51015201-羟基-2-萘甲酸+++±±－对苯醌+++±±－2-甲基-1,4-萘醌++±±－－1-萘酚++++±±note：“+”good；“±”bad；“－”nd由上述试验结果得出，当1-羟基-2-萘甲酸的浓度低于10mg/l时，b.natto生长良好；当其浓度高于20mg/l时，b.natto不生长。当2-甲基-1,4-萘醌和1-萘酚的浓度分别低于7.5mg/l和15mg/l时，b.natto生长良好。实施例4：本实施例说明基于维生素k2结构类似物筛选菌株的过程在此基础上，将artp诱变与结构类似物结合，分别对处理30s、60s和90s的菌悬液涂布在含5mg/l、10mg/l或20mg/l的预筛平板上。挑取长出的单菌落接入装有0.5～1ml的96孔培养板上发酵。其中，发酵培养基配方为：50g/l甘油、30g/l大豆蛋白胨、0.6g/l酵母粉、0.3g/lk2hpo4、0.1g/lcacl2·h2o、0.3g/lmgso4.7h2o。在37℃的摇床中，以200rpm的转速，培养72h，经高效液相色谱法检测。hplc方法：色谱柱：c18柱，柱温：50℃，流动相：甲醇，流速：1ml/min，紫外检测波长270nm，进样量：30ul，检测时间：35min。表2artp与结构类似物结合的诱变效果表中结果为各条件下筛选出的最高mk-7产量，由上述试验结果，最终将诱变60s的菌体涂布于含5mg/l1-羟基-2-萘甲酸的平板上作为最适条件。获得的突变菌b.nattoa1-1的mk-7产量为15.19mg/l，比原始菌提高了83.90％。实施例5：本实施例说明呼吸链抑制剂浓度临界值确定的过程将活化培养后的菌体用生理盐水稀释至10-1～10-7之间，取100ul稀释液涂布平板。其中，固体平板的配方为：30g/l葡萄糖，40g/l蛋白胨，5g/lnacl，5g/l牛肉膏，5g/l酵母膏，20g/l琼脂，20～200mg/l鱼藤酮或5～80mg/l乙腈。以不同种类呼吸链抑制剂作为预筛选来确定纳豆芽孢杆菌的敏感性临界值，选育抗性突变株，一系列浓度的类似物添加到平板上。表3呼吸链抑制剂抗性浓度试验浓度(mg/l)205080100150200鱼藤酮+++±±－浓度(mg/l)51020406080乙腈++±±－－note：“+”good；“±”bad；“－”nd。由上述试验结果，当鱼藤酮的浓度低于100mg/l时，b.natto生长良好；当其浓度高于200mg/l时，b.natto不生长。当乙腈的浓度低于20mg/l时，b.natto生长良好；当其浓度高于60mg/l时，b.natto不生长。鱼藤酮阻断电子由nadh向coq的传递，氰化物阻断电子由细胞色素aa3到氧的传递。而在菌体中，维生素k2的产量与菌种的发育和生理状态有关，依赖于编码相关基因的表达的活性高低。维生素k2在b.natto的呼吸链中起着主要的电子转移作用，如果要提高维生素k2的产量，在培养基中添加呼吸链抑制剂，由于使呼吸链受阻，所以诱导菌种定向向抗呼吸链抑制剂的方向突变。实施例6：本实施例说明基于呼吸链抑制剂筛选菌株的过程将实施例4中获得的纳豆芽孢杆菌经活化后，稀释涂布在含80mg/l、150mg/l鱼藤酮和10mg/l、20mg/l乙腈的预筛平板上。挑取长出的单菌落接入装有0.5～1ml的96孔培养板上发酵。其中，发酵培养基配方为：50g/l甘油、30g/l大豆蛋白胨、0.6g/l酵母粉、0.3g/lk2hpo4、0.1g/lcacl2·h2o、0.3g/lmgso4.7h2o。在37℃的摇床中，以200rpm的转速，培养72h，经高效液相色谱法检测。表4呼吸链抑制剂的诱变效果由上述试验结果，最终将诱变60s的菌体涂布于含20mg/l乙腈的平板上作为最适条件。获得的突变菌b.nattoa5-1的mk-7产量为23.61mg/l，比原始菌提高了185.84％；b.nattoa13-12的mk-7产量为25.51mg/l，比原始菌提高了208.84％。本发明所公开的诱变手段分离出来的菌株外形大致分为三种，依次标为a、b、c三大类，分别为白色褶皱形a类、全透明水滴形b类和膜包裹的半透明菌落c类，如附图1所示。全透明水滴形和膜包裹的高粘性透明菌落，有拉丝情况出现，而白色褶皱菌落的mk-7含量较高。实施例7：菌株发酵性能考察将-80℃保藏的高产菌接种至装有100ml种子培养基的带挡板的500ml三角瓶中，在37℃下，120rpm振荡培养1d。将活化两代的种子液按5％接种量接种到装有100ml发酵培养基的带挡板的500ml三角瓶中，在37℃下200rpm培养。种子培养基：胰蛋白胨10g/l、牛肉浸膏5g/l、酵母膏5g/l、葡萄糖30g/l、nacl5g/l，ph7.0，121℃，20min。发酵培养基：50g/l甘油、30g/l大豆蛋白胨、0.6g/l酵母粉、0.3g/lk2hpo4、0.1g/lcacl2·h2o、0.3g/lmgso4.7h2o，ph7.0，121℃，20min。结果如表6所示。表6不同菌株发酵性能比较表菌体形态甘油消耗速率(g/l/h)最大od600mk-7(mg/l)对照(d)白色褶皱状0.8930.658.26b.nattoa1-1透明水滴状1.4730.2215.19b.nattoa5-1白色褶皱状1.0038.2123.61b.nattoa13-12白色褶皱状0.9442.1725.51由上述试验结果，同时对b.nattoa1-1、a5-1和a13-12三株菌进行发酵性能考察。与原始菌相比，突变菌a1-1的甘油消耗速率在24h内达到1.47g/l/h，但其生物量较低，最大od600为30.22，mk-7产量为15.19mg/l。突变菌a1-1为透明水滴状，发酵液颜色较深且较为粘稠，菌液有拉丝，其消耗的甘油大多用于γ-聚谷氨酸等其他物质的合成，导致mk-7产量较低。突变菌a5-1mk-7产量为23.61mg/l，甘油消耗速率与突变菌a13-12相似，较a1-1慢，在24h时，其甘油消耗速率仅为1.00g/l/h，后续其甘油消耗速率加快，72h时基本消耗完全。a13-12mk-7产量最高，为25.51mg/l。a13-12生物量较大，最大od600达到42.17。当前第1页12