本发明构思涉及生产喹啉酸的重组微生物，以及使用该重组微生物生产喹啉酸的方法。
背景技术：
喹啉酸(2,3-吡啶-二羧酸)作为化学品(例如医药和农业化学品、染料等)的前体具有广泛的用途。
喹啉酸可以通过化学或生物合成方法来制备。在化学方式中，喹啉酸通常通过喹啉的氧化来制备。在生物方式中，公开了在大肠杆菌(escherichiacoli(e.coli))菌株中生产喹啉酸的方法，其中在喹啉酸磷酸核糖转移酶(nadc)活性被消除的大肠杆菌中，大肠杆菌菌株的两种酶的表达被增强，即l-天冬氨酸氧化酶(nadb)和喹啉酸合成酶(nada)的表达。
kefa是属于存在于微生物(例如大肠杆菌)中的机械敏感性离子(ms)通道的膜蛋白，并且已知具有以非特异性方式将离子和溶质穿过细胞膜引入细胞中的功能。大肠杆菌中的kefa与kefb和kefc一起构成了钾离子(k+)外排系统，更具体地，已知kefa在渗透压冲击(osmoticdownshock)下对k+的外排具有重要作用(j.bacteriol.(细菌学杂志)169,3743-3749,1987)。此外，已经报道，当在大肠杆菌中使kefa的基因突变时，细胞与野生型细胞相比对k+的浓度和压力变得更敏感(j.membranebiol.(膜生物学杂志)150,143-152)。然而，如上所述，大多数研究主要关注kefa与细胞中钾离子的控制之间的相关性，但还没有发现任何关于kefa与喹啉酸生产之间的相关性的研究。
在这一点上，本发明人对ms通道蛋白的活性修饰与高浓度喹啉酸的生产之间的相关性进行了研究，从而完成了以高产率制备喹啉酸的方法。
技术实现要素：
技术问题
根据本发明构思的一个方面，提供了用于生产喹啉酸的重组微生物，其中序列号1的蛋白质的活性被减弱或消除。
根据本发明构思的另一个方面，提供了通过使用重组微生物来生产喹啉酸的方法。
技术方案
根据本发明构思的一个方面，提供了用于生产喹啉酸的重组微生物，其中kefa的活性被减弱或消除。
本文中所用的术语“kefa”是指属于机械敏感性离子通道的膜蛋白，也称为“msck”。kefa依赖于钾，并且可以具有以非特异性方式将离子和溶质穿过细胞膜引入细胞的活性。具体地，kefa是钾外排蛋白(potassiumeffluxprotein)的一个实例，并且例如可以在细菌受到渗透压冲击时控制钾的外排。
kefa可以衍生自埃希氏菌属的微生物。具体地，kefa可以具有序列号1的氨基酸序列，其非限制性实例包括具有与序列号1的氨基酸序列具有80％、更具体地至少90％同源性的氨基酸序列并且实质上具有kefa的活性的蛋白质。此外，只要氨基酸序列具有上述同源性并且实质上具有与序列号1的蛋白质相同或相应的生物学活性，则本发明构思的范围显然也包括氨基酸序列部分地经历删除、修饰、替换或添加的蛋白质。
此外，kefa基因序列可以包含编码序列号1的氨基酸序列或与序列号1的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列的多核苷酸序列。由于密码子的简并性或考虑到在欲表达蛋白质的生物体中优选的密码子，编码kefa蛋白的多核苷酸可以在编码区中进行各种修饰，只要不改变编码区中表达的蛋白质的氨基酸序列即可。kefa基因中的多核苷酸序列可以从公开的大肠杆菌基因组序列(gi：89107872)或从美国国家生物技术信息中心(ncbi)和日本dna数据库(ddbj)等数据库中获得。例如，kefa基因中的多核苷酸序列可以包含序列号10的核苷酸序列或与序列号10的核苷酸序列具有80％同源性、更具体地具有至少90％同源性的核苷酸序列。然而，实施方式不限于此。
本文使用时，术语“同源性”是指氨基酸序列或多核苷酸序列与给定的氨基酸序列或给定的多核苷酸序列之间一致的程度，并且同源性可以表示为百分数。在本发明构思中，与给定氨基酸序列或给定多核苷酸序列相同或具有相似活性的同源性序列表示为“％同源性”。例如，序列的同源性可以通过使用根据文献中的算法blast[参见karlin和altschul的pro.natl.acad.sci.usa(美国国家科学院院刊),90,5873(1993)]或pearson的fasta[参见methodsenzymol.(酶学方法),183,63(1990)]来确定。基于算法blast已开发出被称为blastn或blastx的程序[参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov]。
本文中使用时，术语“喹啉酸”是指喹啉酸(酯)或其盐。本文中使用时，术语“盐”是指由喹啉酸的阴离子和碱的阳离子制备的化合物，其实例包括喹啉酸钠盐、喹啉酸钾盐、喹啉酸铵盐、喹啉酸钙盐和喹啉酸镁盐。
本文中使用时，术语“重组微生物”是指经天然突变或人工突变或者经基因改造的微生物。基因工程改造的微生物可以是例如根据基因工程方法引入外源核酸的微生物，或其中内源基因的序列或位置改变的微生物。
“生产喹啉酸的重组微生物”是指通过使用培养基中的碳源能够生产和积累喹啉酸的微生物。此外，与未修饰的微生物相比，重组微生物可通过减弱或消除kefa的活性来以高生产能力生产喹啉酸。重组微生物不受限制，只要微生物能够生产和积累喹啉酸即可，其实例包括埃希氏菌(escherichia)属的微生物、肠杆菌(enterbacter)属的微生物、欧文氏菌(erwinia)属的微生物、沙雷氏菌(serratia)属的微生物、普罗威登斯菌(providencia)属微生物、棒状杆菌(corynebacterium)属微生物和短杆菌(brevibacterium)属微生物。具体地，重组微生物可以是埃希氏菌属的微生物。更具体地，重组微生物可以是埃希氏菌属的大肠杆菌，但不限于此。
本文中使用时，酶或多肽的“活性去除”是指所提及的蛋白质在微生物中完全不表达的情况，或所提及的蛋白质在微生物中表达但是没有任何活性的情况。此外，本文中使用时，表述“活性减弱”是指与所提及的蛋白质的内源活性相比，所提及的蛋白质在微生物中的活性减弱或弱化的情况。本文中使用时，术语“内源活性”是指天然状态的蛋白质(即原本包含在微生物中的蛋白质)、不经历任何基因修饰的蛋白质的活性。
详细地，kefa的活性减弱或活性消除可以通过1)消除或删除编码kefa蛋白的基因，2)修饰基因表达的调控序列以减弱编码kefa蛋白的基因的表达，或3)修饰染色体上的基因序列以弱化kefa的活性或用弱启动子替换编码kefa蛋白的基因的内源启动子来执行，或者可以通过以上方法的一种或多种组合来执行。然而，实施方式不限于此。
更详细地，kefa的活性减弱或活性消除可以通过消除或删除编码kefa膜蛋白的基因来执行。本文中使用时，“基因消除或删除”的表述是指为了使基因不表达、基因以少量表达、或基因表达但酶活性不显示或者减弱，基因的一部分或全部、或基因的启动子或基因的终止子区域中的调控因子的一部分或全部经历突变、替换、或删除，或基因中插入至少一个碱基。例如，基因的消除或删除可以通过基因改造(包括同源重组)、突变诱导或分子进化来实现。当细胞包含多个相同的基因或至少两个不同的多肽旁系同源基因时，一个或多个基因可以被消除或删除。
在本发明构思中，在生产喹啉酸的重组微生物中，喹啉酸磷酸核糖基转移酶(nadc)的活性可以进一步被减弱或消除。
本文中使用时，术语“喹啉酸磷酸核糖基转移酶”是指具有将喹啉酸转化为烟酸单核苷酸的活性的酶。当具有喹啉酸磷酸核糖基转移酶活性的基因被消除时，或者当具有喹啉酸磷酸核糖基转移酶活性的基因的表达被弱化时，细胞中的喹啉酸生产可增加。
喹啉酸磷酸核糖基转移酶可以来源于埃希氏菌属的微生物，并且更具体地，可以具有序列号29的氨基酸序列。喹啉酸磷酸核糖基转移酶的非限制性实例包括具有与序列号29的氨基酸序列具有80％同源性、更具体地至少90％同源性的氨基酸序列并且实质上具有喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性的蛋白质。只要氨基酸序列具有上述同源性并且实质上具有与包含序列号29的氨基酸序列的蛋白质相同或相应的生物学活性，则本发明构思的范围显然也包括氨基酸序列部分地经历删除、修饰、替换或添加的蛋白质。
编码喹啉酸磷酸核糖基转移酶的nadc基因序列可以包含编码序列号29的氨基酸序列的多核苷酸序列。nadc基因序列可以从文献中公开的大肠杆菌基因组序列(gi：89106990)或从ncbi和ddbj等数据库中获得。此外，nadc基因可以包含序列号11的核苷酸序列或与序列号11的核苷酸序列具有80％同源性、更具体地具有至少90％同源性的核苷酸序列。通过减弱或消除喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性，可以增加喹啉酸在细胞中的积累。
本文中使用时，喹啉酸磷酸核糖基转移酶的“活性减弱或消除”表述显然可以被本领域普通技术人员以与上述kefa的“活性减弱或消除”表述相同的方式理解。
此外，在生产喹啉酸的重组微生物中，选自l-天冬氨酸氧化酶(nadb)和喹啉酸合成酶(nada)中的至少一种酶的活性可以进一步被增强。结果，可以在细胞中增加α-亚氨基琥珀酸(喹啉酸的前体)的积累和由α-亚氨基琥珀酸生物合成的喹啉酸，从而增加喹啉酸的生产。
本文中使用时，术语“天冬氨酸氧化酶”是指具有氧化l-天冬氨酸的活性的酶，并且可以被称为“l-天冬氨酸氧化酶”。
因此，当l-天冬氨酸氧化酶的活性增强时，在细胞中增加亚氨基琥珀酸(喹啉酸的前体)的积累，从而增加喹啉酸的生产。
天冬氨酸氧化酶可以来源于埃希氏菌属的微生物。具体地，天冬氨酸氧化酶可以具有序列号30的氨基酸序列，并且其非限制性实例包括含有与序列号30具有80％同源性、更具体地至少90％同源性的氨基酸序列并且实质上具有l-天冬氨酸氧化酶的活性的蛋白质。只要氨基酸序列具有上述同源性并且实质上具有与包含序列号30的氨基酸序列的蛋白质相同或相应的生物活性，则本发明构思的范围显然也包括氨基酸序列部分地经历删除、修饰、替换或添加的蛋白质。
编码天冬氨酸氧化酶的nadb基因可以包含编码序列号30的氨基酸序列的多核苷酸序列。nadb序列的序列可以从文献中公开的大肠杆菌的基因组序列(gi：89109380)或从ncbi和ddbj等数据库中获得。此外，nadb基因可以包含序列号18的核苷酸序列或与序列号18的核苷酸序列具有80％同源性、更具体地至少90％同源性的核苷酸序列。然而，实施方式不限于此。
本文中使用时，术语“喹啉合成酶”是指具有从亚氨基琥珀酸合成喹啉酸的活性的酶。
通过喹啉酸合成酶的催化来加速从由于天冬氨酸氧化酶的活性而产生的α-亚氨基琥珀酸合成喹啉酸，从而能够以更高的生产能力(producibility)生产喹啉酸。因此，当编码喹啉酸合成酶的基因的表达或喹啉酸合成酶的活性增强时，可以在细胞中增加喹啉酸的生产。
喹啉酸合成酶可以从埃希氏菌属的微生物获得。具体地，喹啉酸合成酶可以具有序列号31的氨基酸序列，并且其非限制性实例包括具有与序列号31的氨基酸序列具有80％同源性、更具体地具有至少90％同源性的氨基酸序列并且实质上具有喹啉酸合成酶的活性的蛋白质。只要氨基酸序列具有上述同源性并且实质上具有与包含序列号31的氨基酸序列的蛋白质相同或相应的生物学活性，则本发明构思的范围显然也包括氨基酸序列部分地经历删除、修饰、替换或添加的蛋白质。
编码喹啉酸合成酶的nada基因可以包含编码序列号31的氨基酸序列的多核苷酸序列。nada序列的序列可以从文献中公开的大肠杆菌的基因组序列(gi：89107601)或从ncbi和ddbj等数据库中获得。此外，编码喹啉酸合成酶的nada基因可以包含序列号21的核苷酸序列或与序列号21的核苷酸序列的序列具有80％同源性、更具体地至少90％同源性的核苷酸序列。然而，实施方式不限于此。
本文中使用时，表述“活性的增加”是指与所提及的蛋白质的内源活性相比活性“增强”。具体地，活性的增加可以通过如下来实现：增加编码所提及的蛋白质的基因的拷贝数、修饰基因表达的调控序列以增加每个基因的表达，修饰染色体上每个基因序列以增强每种蛋白质的活性、用强启动子替代基因的内源启动子或其任何组合。然而，实施方式不限于此。
详细地，可以通过使用包含编码上述酶的多核苷酸的重组载体来进行转化以增加天冬氨酸氧化酶或喹啉酸合成酶的活性。如本文所用的术语“转化”是指将基因引入宿主细胞中以在宿主细胞中表达该基因。只要这样的转化基因可以在宿主细胞中表达，插入宿主细胞染色体中或位于宿主细胞染色体外部的基因均可以称为转化的基因。此外，转化的基因可以包括任何类型的基因，只要该基因可以引入宿主细胞后在其中表达即可。例如，可以以表达盒的形式将转化的基因引入宿主细胞，所述表达盒是多核苷酸结构并且包含自行表达所需的所有因子。表达盒包括通常与转化的基因连接并能够起作用的启动子、转录终止信号、核糖体结合区和翻译终止信号。表达盒可以是能够自我复制的表达载体的形式。此外，转化基因本身或多核苷酸结构形式的转化基因可被引入宿主细胞，以与在宿主细胞中表达所需的序列连接成能够起作用。重组载体是通过将dna引入宿主细胞来表达蛋白质的手段，并且其示例包括本领域已知的表达载体，例如质粒载体、黏粒载体和噬菌体载体。使用重组dna技术根据本领域已知的方法制备这样的表达载体对本领域普通技术人员来说是显而易见的，但是实施方式不限于此。
更详细地，可以通过将与基因连接成能够起作用的启动子替换成强启动子来增加上述酶的活性。在本发明构思的一个实施方式中，当与nada基因连接成能够起作用的启动子被替换为更强的启动子pcj1(参见kr10-0620092)而不是启动子pcysk时，证实喹啉酸的生产显着增加(参见表8)。然而，实施方式不限于此。
根据本发明构思的另一方面，提供了一种生产喹啉酸的方法，所述方法包括：培养生产喹啉酸的重组微生物；和从培养产物中回收喹啉酸。
生产喹啉酸的微生物与上文所描述的相同。
重组微生物的培养可以在本领域已知的培养条件下在合适的培养基中进行。这样的培养过程可以根据所选择的微生物而容易地调整。培养方法可包括间歇式培养、连续式培养、补料分批式培养或其任何组合，但实施方式不限于此。
培养基可以包括各种碳源、氮源和微量元素。
例如，碳源可以包括碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；脂质，例如大豆油、向日葵油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇，例如甘油和乙醇；有机酸，例如乙酸，或其任何组合。例如，可以通过使用葡萄糖作为碳源进行培养。
氮源可包括有机氮源，例如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆液(csl)和大豆粉；无机氮源、例如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵；或其任何组合。
培养基可以包括例如磷酸二氢钾、磷酸二钾、与其对应的含钠盐、以及金属盐(如硫酸镁或硫酸铁)作为磷源。此外，培养基可以包括氨基酸、维生素和适当的前体。可以以间歇模式或连续模式将培养基或其单独组分加入培养基中，但是实施方式不限于此。
另外，在培养过程中，可以以适当的方式向培养物中加入化合物，例如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸或硫酸，来调节培养物的ph。另外，在培养过程中可以通过使用消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯防止气泡的产生。为了保持培养物的需氧条件，可以将氧气或含氧气体(例如空气)注入培养物中。培养物的温度可以为20-45℃，例如22-42℃或25-40℃。可以继续培养直至喹啉酸的产量达到所需水平，例如，培养可进行10小时至160小时。
关于从培养产物中回收喹啉酸，所生产的喹啉酸可以通过以间歇模式、连续模式或补料分批模式的使用与培养方法相关的本领域已知的合适方法从培养产物中收集或回收。
发明效果
根据本发明构思的一个方面的重组微生物，其中序列号1的蛋白质的活性被减弱或消除，可以用于生产喹啉酸。
通过使用根据本发明构思的另一方面的一种生产喹啉酸的方法，可以有效地生产喹啉酸。
具体实施方式
下文中，将参考实例更详细地描述本申请。然而，这些实例仅仅用于说明性目的，并且本申请的范围不意图受这些实例限制。
实施例1.生产喹啉酸的菌株的制备
1-1.喹啉酸磷酸核糖基转移酶缺陷的菌株的制备
使用大肠杆菌k12w3110的染色体dna作为模板，通过pcr(聚合酶链反应)获得参与喹啉酸的降解途径的nadc基因。从美国国立卫生研究院(nih)的genbank(基因银行)获得nadc基因的核苷酸序列信息(ncbi登记号“gi：89106990”)，并根据nadc核苷酸序列号11合成了扩增nadc基因的下游区的序列号12和13的引物、扩增nadc的上游和下游区以及loxpcm的序列号14和15的引物，以及扩增nadc的上游区的序列号16和17的引物。
使用大肠杆菌k12w3110的染色体dna作为模板，序列号12和13的寡核苷酸和序列号16和17的寡核苷酸分别作为引物而进行pcr以扩增0.5kb和0.3kb的nadc基因的上游区和下游区。此外，使用包含loxpcm的ploxpcat2质粒载体(genbank编号为aj401047)作为模板并使用序列号14和15的寡核苷酸作为引物进行pcr以扩增1.0kb的在两端具有与nadc基因同源的序列的loxpcm基因。使用pfuultratmdna聚合酶(stratagene公司，美国)作为聚合酶，通过重复循环30次进行pcr，每个循环包括在96℃下变性30秒，在53℃下退火30秒，并在72℃下延伸1分钟。
随后，将从pcr反应获得的nadc-上游片段、nadc-下游片段和loxpcm片段用作模板进行pcr，pcr条件包括重复执行10个循环并在加入序列号12和17的引物后重复执行20个循环，每个循环包括在96℃下变性60秒，在50℃下退火60秒，并在72℃下延伸1分钟。结果，获得含有nadc基因上游区-loxpc-nadc基因下游区的1.8kb的nadc缺陷的盒。
通过电穿孔的方式将nadc缺陷的盒转化至含有pkd46作为lambdared重组酶表达载体的大肠杆菌k12w3110，然后将菌株涂布在含有氯霉素作为选择性标记物的luria-bertani(lb)平板培养基(10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、10g/lnacl和1.5％琼脂)上，并在37℃下温育过夜，从而选择显示出对氯霉素抗性的菌株。
将所选择的菌株直接作为模板并使用序列号13和16的引物在相同条件下进行pcr，然后通过在1.0％琼脂糖凝胶上鉴定野生菌株和nadc缺陷菌株中的基因大小分别为1.6kb和1.3kb，来确认nadc基因的缺失。相应地，所得菌株被命名为w3110-δnadc。
此外，根据上述相同的方法，也从k12mg1655菌株中删除nadc基因，相应地，将所得菌株命名为mg1655-δnadc。
1-2.kefa缺陷的菌株的制备
从nihgenbank获得序列号10的kefa基因的核苷酸序列(ncbi登记号“gi::89107872”)。相应地，合成了扩增kefa基因的下游区的序列号2和3的引物，扩增kefa的上游和下游区以及frt-km的序列号4和5的引物，以及扩增kefa的上游区的序列号6和7的引物。
使用大肠杆菌w3110的染色体dna作为模板，并利用序列号2和3的引物以及序列号6和7的引物进行pcr以分别扩增0.8kb和0.6kb的kefa基因的上游区和下游区。此外，使用包含frt-km的pkd4载体作为模板并使用序列号4和5的寡核苷酸作为引物进行pcr以扩增1.4kb的在两端具有与kefa基因同源的序列的frt-km基因。使用pfuultratmdna聚合酶(stratagene公司)作为聚合酶，并通过重复循环30次进行pcr，每个循环包括在96℃下变性30秒，在53℃下退火30秒，并在72℃下延伸2分钟。随后，将从pcr反应获得的kefa上游片段、kefa下游片段和frt-km片段用作模板进行pcr，pcr条件包括重复执行10个循环并在加入序列号6和7的引物后重复执行20个循环，每个循环包括在96℃下变性60秒，在50℃下退火60秒，并在72℃下延伸2分钟。结果，获得含有kefa的上游区-frt-km-kefa的下游区的2.6kb的kefa缺陷的盒。
通过电穿孔的方式将kefa缺陷的盒转化至含有pkd46作为lambdared重组酶表达载体的大肠杆菌w3110-δnadc，然后将菌株涂布在含有卡那霉素作为选择性标记物的lb平板培养基(10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、10g/lnacl和1.5％琼脂)上，并在37℃下温育过夜，从而选择显示对卡那霉素抗性的菌株。将所选择的菌株直接作为模板，使用序列号8和9的引物在相同条件下进行pcr，然后通过在1.0％琼脂糖凝胶上鉴定野生菌株和kefa缺陷菌株中的基因大小分别为4.2kb和1.5kb，来确认kefa基因的缺失。相应地，所得菌株被命名为w3110-δnadcδkefa。
此外，根据上述相同的方法通过使用kefa缺陷的盒，也从mg1655-δnadc菌株中除去kefa基因，相应地，将所得菌株命名为mg1655-δnadcδkefa。
1-3.在大肠杆菌中表达l-天冬氨酸氧化酶的质粒的制备
在表达载体中克隆来源于大肠杆菌的编码野生型l-天冬氨酸氧化酶的nadb基因，使用大肠杆菌k12w3110株(atcc(美国模式培养物保藏所)保藏号23257)的染色体作为模板。基因序列基于从nihgenbank获得的序列号18的核苷酸序列(ncbi登记号“gi：89109380”)。扩增nadb基因的orf(开放阅读框)区，并合成具有限制酶ndei和bamhi的识别位点的序列号19和20的引物。
使用大肠杆菌k12w3110的染色体dna作为模板，并使用序列号19和20的寡核苷酸作为引物，进行pcr。使用pfuultratmdna聚合酶(stratagene公司，美国)作为聚合酶，通过重复循环30次进行pcr，每个循环包括在96℃下变性30秒，在50℃下退火30秒，并在72℃下延伸2分钟。因此，获得了包含nadborf基因和限制酶ndei和bamhi的识别位点的约1.9kb的扩增基因。
通过pcr方法获得的nadb基因通过琼脂糖凝胶洗脱回收，然后用限制酶ndei和bamhi处理。然后，将nadb基因连接到用限制酶ndei和bamhi处理的pprolar载体(clonetech公司，美国)中，从而在与ppro启动子连接的nadb基因中实现l-天冬氨酸氧化酶的表达。由其制备的载体命名为ppro-nadb。
1-4.表达天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的质粒的制备
(1)ppro-nadb_pcysk-nada载体的制备
首先，使用大肠杆菌w3110的染色体dna作为模板，通过pcr获得编码喹啉酸合成酶的nada基因。使用从nihgenbank获得的序列号21的nada基因的核苷酸序列信息(ncbi登记号“gi：89107601”)。然后，基于序列号21的nada基因，扩增在nada基因中含有atg至taa的orf区，并合成具有限制酶apai和noti的识别位点的序列号22和23的引物。
使用大肠杆菌w3110的染色体dna作为模板并使用序列号22和23的寡核苷酸作为引物，进行pcr。使用pfuultratmdna聚合酶(stratagene公司，美国)作为聚合酶，并通过重复循环30次进行pcr，每个循环包括在96℃下变性30秒，在50℃下退火30秒，并在72℃下延伸2分钟。因此，获得了包含nada基因和限制酶apai和noti的识别位点的约1.0kb的扩增基因。
此外，使用大肠杆菌w3110的染色体dna作为模板，通过pcr方法获得cysk启动子。从nihgenbank获得位于cysk基因的上游0.3kb内的启动子的核苷酸序列信息(序列号24)，据此合成具有限制酶bamhi和apai的识别位点的序列号25和26的引物，以便将cysk启动子与扩增的nada基因连接。
使用大肠杆菌w3110的染色体dna作为模板，序列号25和26的寡核苷酸作为引物，进行pcr。使用pfuultratmdna聚合酶(stratagene公司)作为聚合酶，通过重复循环30次进行pcr，每个循环包括在96℃下变性30秒，在50℃下退火30秒，并在72℃下延伸2分钟。结果，获得了包含cysk启动子和限制酶bamhi和apai的约0.3kb的扩增基因。
通过pcr方法获得的nada基因用限制酶apai和noti处理，扩增的cysk启动子片段用apai和bamhi处理。通过连接，将用限制酶处理的nada和cysk启动子片段克隆到用限制酶noti和bamhi处理的实施例1-2的ppro-nadb载体中，从而制备5.9kb的ppro-nadb_pcysk-nada载体，其中克隆了nadb基因和nada基因，其中作为组成型启动子的ppro启动子控制nadb基因的表达，并且cysk基因的启动子控制nada基因的表达。
(2)ppro-nadb_pcj1-nada载体的制备
为了在喹啉酸的生物合成过程中进一步增强编码喹啉酸合成酶的nada基因的表达，使用k12w3110中的活性更强的启动子，即pcj1启动子，而不使用pcysk启动子。根据kr2006-0068505a，使用包含pcj1启动子的质粒的dna作为模板通过pcr获得pcj1启动子。为了将pcj1启动子与扩增的nada基因连接，合成具有限制酶bamhi和apai的识别位点的序列号27和28的引物。
使用大肠杆菌w3110的染色体dna作为模板和序列号27和28的寡核苷酸作为引物进行pcr。使用pfuultratmdna聚合酶(stratagene公司)作为聚合酶，并通过重复循环30次进行pcr，每个循环包括在96℃下变性30秒，在50℃下退火30秒，并在72℃下延伸1分钟。结果，获得了约0.3kb的扩增基因，其含有pcj1启动子和限制酶bamhi和apai。
用限制酶apai和noti处理通过pcr方法获得的nada基因，并且用apai和bamhi处理扩增的pcj1启动子片段。通过连接，将用上述限制酶处理的nada和pcj1启动子片段克隆到用限制酶noti和bamhi处理的实施例1-2的ppro-nadb载体中，从而制备5.9kb的ppro-nadb_pcj1-nada重组载体，其中克隆了nadb基因和nada基因，其中作为组成型启动子的ppro启动子控制nadb基因的表达，并且pcj1基因的启动子控制nada基因的表达。
实施例2.生产喹啉酸的菌株的生产能力的评价
2-1.基于效价确认比较生产喹啉酸的菌株的生产能力
为了评价喹啉酸的生产能力，将包含增强的nadb和nada的质粒引入到w3110-δnadc和mg1655-δnadc菌株中的每一个。关于引入方法，通过cacl2方法转化菌株，涂抹在lb-km平板培养基(10g/l酵母提取物、5g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、1.5％琼脂和50ug/l卡那霉素)上，然后在37℃下温育过夜。随后，收集单个卡那霉素抗性菌落，分别以1白金耳接种在25ml喹啉酸效价(titer)培养基中，然后在33℃下以250rpm温育24-72小时。下表1示出了喹啉酸的生产培养基的组成。
[表1]
在喹啉酸烧瓶中的效价培养基的组成
通过hplc(高效液相色谱法)分析培养液中的喹啉酸，结果示于下表2中。也就是说，结果表明了菌株生产喹啉酸的能力。如表2中所示，根据喹啉酸系菌株的表达程度和nadba的表达程度，观察到喹啉酸的生产能力的差异。具体地，当通过使用具有比pcysk启动子表达强度更强的pcj1启动子增强nada基因的表达时，证实了在野生型大肠杆菌k12菌株w3110-δnadc和mg1655-δnadc中，喹啉酸的生产显着增加。
[表2]
2-1.kefa缺陷菌株的喹啉酸生产能力的评价
为了比较kefa缺陷菌株的喹啉酸生产能力，使用ppro-nadb_pcj1-nada质粒通过cacl2方法分别转化实施例1-4的w3110-δnadcδkefa和mg1655-δnadcδkefa菌株。将每个转化的菌株涂抹在37℃的lb-km平板培养基(10g/l酵母提取物、5g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、1.5％琼脂和50ug/l卡那霉素)上，然后温育过夜。随后，收集单个卡那霉素抗性菌落，分别以1白金耳接种在25ml喹啉酸效价培养基(参见表1)中，然后在33℃下以250rpm温育24-72小时。
通过hplc分析培养液中的喹啉酸，结果示于下表3中。如表3所示，与对照菌株相比，在kefa缺陷的菌株中喹啉酸的浓度增加。具体地，证实了在野生型菌株中删除kefa时喹啉酸的浓度增加至少15％。
[表3]
2-3.确认kefa的活性减弱的效果
(1)替换kefa起始密码子的质粒的制备
为了证实在生产喹啉酸的菌株中kefa弱化的效果，制备了具有弱化的kefa的质粒。使用从nihgenbank获得的序列号10的基因的核苷酸序列(ncbi登记号“gi::89107872”)作为基因序列。通过将kefa的起始密码子从atg修饰到ttg，扩增kefa基因的orf区，并且合成具有限制酶blunt和bamhi的识别位点的序列号32和33的引物。此外，扩增kefa基因的自身启动子区，并且合成具有限制酶saci和blunt的识别位点的序列号34和35的引物。
使用大肠杆菌k12w3110菌株(atcc保藏号23257)的染色体dna作为模板，序列号32和33的寡核苷酸作为引物，进行pcr。使用pfuultratmdna聚合酶(stratagene公司)作为聚合酶，并通过重复循环30次进行pcr，每个循环包括在96℃下变性30秒，在50℃下退火30秒，和在72℃下延伸30秒。通过pcr，获得约0.15kb的扩增基因，其含有kefa的orf区和限制酶bamhi的识别位点。
此外，使用k12w3110的染色体dna作为模板并使用序列号34和35的寡核苷酸作为引物，进行pcr。使用pfuultratmdna聚合酶(stratagene公司)作为聚合酶，并通过重复循环30次进行pcr，每个循环包括在96℃下变性30秒，在50℃下退火30秒，和在72℃下延伸30秒。通过pcr，获得约0.15kb的扩增基因，其含有kefa的自身启动子区和限制酶sacii的识别位点。
通过琼脂糖凝胶洗脱回收将通过pcr获得的kefa的orf区和pkefa启动子，然后分别用限制酶bamhi和saci处理。随后，连接到用限制酶bamhi和saci处理的psg76c载体(j.bacteriol.179(13),4426-4428(1997)，ncbi基因库y09892)。
因此，制备具有自身启动子和kefa的orf区的载体，其中起始密码子atg被ttg替换，然后命名为psg76c_kefa*(atg->ttg)载体。
(2)具有替换的kefa起始密码子的菌株的制备和喹啉酸的生产能力的评价
通过电穿孔的方式将实施例2-3(1)的psg76c_kefa*(atg->ttg)载体转化至大肠杆菌w3110-δnadc，然后将菌株涂抹在含有氯霉素作为选择性标记物的lb平板培养基(10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、10g/lnacl和1.5％琼脂)，并在37℃的温度下温育过夜，从而选择显示对氯霉素抗性的菌株。将所选择的菌株直接作为模板使用序列号33和34的引物在相同条件下进行pcr，然后从1.0％琼脂糖凝胶中获得具有0.30kb大小的pcr产物。通过进行测序，最终选择用ttg替换kefa的起始密码子atg的菌株。最终选择的菌株命名为w3110-δnadc_kefa*(atg->ttg)。
此外，在相同条件下用psg76c_kefa*(atg->ttg)载体转化mg1655-δnadc，然后确认kefa的起始密码子的替换。由此获得的菌株命名为mg1655-δnadc_kefa*(atg->ttg)。
为了比较每个转化菌株的喹啉酸生产能力，从下表4的菌株中收集单个氯霉素抗性菌落，分别以1白金耳接种在25ml喹啉酸效价培养基(参见表1)中，然后在33℃下以250rpm温育24至72小时。通过hplc分析培养液中的喹啉酸，结果示于下表4中。结果，与对照组相比，具有弱化的kefa的菌株(即具有替换的kefa起始密码子的菌株)生产的喹啉酸浓度水平增加10％。
[表4]
实施例3.kefa缺陷菌株或kefa增强菌株对喹啉酸的敏感性的评价
3-1.生产喹啉酸的菌株对喹啉酸的敏感性的评价
基于上述喹啉酸生产能力的评价结果，预测kefa的消除将弱化外部喹啉酸再次进入细胞，从而增加喹啉酸的生产能力。基于这样的预测，对kefa缺陷菌株和kefa增强菌株进行对喹啉酸的敏感度的评价。
首先，确认了13g/l的喹啉酸(为减弱生产菌株的生长和发育而用koh滴定至7.0ph)的添加与否所带来的影响。即，将生产喹啉酸的菌株的单个菌落分别以1白金耳接种在25mllb+1％葡萄糖液体培养基(10g/l酵母提取物、5g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、50ug/l的卡那霉素和10g/l的葡萄糖)，然后在33℃下以250rpm温育16至24小时。然后，测量菌株的od600、葡萄糖消耗和残余喹啉酸。
[表5]
如表5中所示，当向培养基中额外加入喹啉酸时，证实喹啉酸被引入到细胞中，从而使生长和发育以及葡萄糖消耗速度降低40％。
在这一点上，将经改造的、w3110δnadcδkefa中引入ppro-nadb_pcj1-nada质粒而得到的菌株根据布达佩斯条约于2013年11月7日保藏在韩国微生物保藏中心(kccm)，其中nadc缺失并且nadba增强，保藏号为kccm11470p。
3.2.kefa缺陷菌株和kefa增强菌株对喹啉酸的敏感性的评价
(1)kefa蛋白的过表达载体的制备
为了制备能过表达由大肠杆菌获得的kefa基因的载体，使用大肠杆菌k12w3110菌株(atcc保藏号23257)的染色体作为模板。此外，使用从nihgenbank获得的序列号10的基因的核苷酸序列(ncbi登记号“gi::89107872”)作为基因序列。扩增kefa基因的orf区，合成具有限制酶ecorv和hindiii的识别位点的序列号36和37的引物。
使用大肠杆菌k12w3110菌株的染色体dna作为模板，并使用序列号36和37的寡核苷酸作为引物，进行pcr。使用pfuultratmdna聚合酶(stratagene公司)作为聚合酶，并通过重复循环30次进行pcr，每个循环包括在96℃下变性30秒，在50℃下退火30秒，并在72℃下延伸2分钟。通过pcr，获得约3.3kb的扩增基因，其含有kefaorf基因和限制酶ecorv和hindiii的识别位点。
将通过pcr获得的kefa基因通过琼脂糖凝胶洗脱回收，然后用限制酶ecorv和hindiii处理。随后，将kefa基因连接到用限制酶ecorv和hindiii处理的pcl1920_prhtb载体中，导致连接到prhtb启动子的kefa基因的表达。由其制备的载体命名为pcl_prhtb-kefa载体。
(2)kefa缺陷菌株和kefa增强菌株的喹啉酸的敏感度的评价
为了确定kefa膜蛋白是否影响喹啉酸的引入，按照与实施例2-4(1)相同的方法，对kefa基因缺陷菌株和kefa基因增强菌株进行喹啉酸的敏感度评价。
[表6]
如上表6中所示，当在lb液体培养基中kefa基因也被增强时，在w3110-δnadc中，与其中nadba基因被增强的对照菌株相比，生产喹啉酸的菌株的生长和发育和葡萄糖消耗速度显着降低约40％。还证实了，根本没有发现喹啉酸的生产。此外，在向培养基中额外加入喹啉酸的条件下，与对照菌株相比，kefa缺陷菌株的生长和发育和葡萄糖消耗速度提高至高达110％，而与对照菌株相比kefa增强菌株的生长和发育和葡萄糖消耗速度降低至50％。
基于上述结果可以确定，kefa膜蛋白影响喹啉酸向细胞中的引入。此外，证实了，消除kefa可以减弱生产喹啉酸的菌株对喹啉酸的敏感性，并且可以进一步使得喹啉酸的生产增加。
序列表
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<120>用于生产喹啉酸的重组微生物和使用其生产喹啉酸的方法
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gaacagatgcgcgaagccgtcaaacgcaccaacggcaaggcgctactggaagtgtctggc780
aacgtcactgacaaaacactgcgtgaatttgccgaaacgggcgtggactttatctccgtc840
ggtgcgctaactaaacacgtacaagcactcgacctttcaatgcgttttcgctaa894
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<211>42
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增nadc的下游区的引物
<400>12
cattatacgaacggtacccccagttgaataaacacctcttca42
<210>13
<211>18
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增nadc的下游区的引物
<400>13
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<210>14
<211>41
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增loxpcm的引物
<400>14
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<210>15
<211>42
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增loxpcm的引物
<400>15
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<210>16
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增nadc的上游区的引物
<400>16
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<210>17
<211>41
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增nadc的上游区的引物
<400>17
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<210>18
<211>1551
<212>dna
<213>大肠杆菌
<400>18
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<210>20
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<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增nadb的orf区的引物
<400>20
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<211>1044
<212>dna
<213>大肠杆菌
<400>21
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<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增nada的orf区的引物
<400>23
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<210>24
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<212>dna
<213>大肠杆菌
<400>24
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gcgcgacggcgatgtgggtcgattgctatcgcgataaacacgcgatgtggcggtaacaat120
ctaccggttattttgtaaaccgtttgtgtgaaacaggggtggcttatgccgccccttatt180
ccatcttgcatgtcattatttcccttctgtatatagatatgctaaatccttacttccgca240
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<211>25
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<213>人工序列
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<223>用于扩增cysk启动子的引物
<400>26
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<211>34
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<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增pcj1启动子的引物
<400>28
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<210>29
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<212>prt
<213>大肠杆菌
<400>29
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<212>prt
<213>大肠杆菌
<400>30
metasnthrleuprogluhissercysaspvalleuileileglyser
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202530
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130135140
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180185190
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ileargglnhispheprometiletyrglulysleuleuglyleugly
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asnargmetalaserasnserleuleuglucysleuvaltyrglytrp
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<212>prt
<213>大肠杆菌
<400>31
metservalmetpheaspproaspthralailetyrprophepropro
151015
lysprothrproleuserileaspglulysalatyrtyrargglulys
202530
ilelysargleuleulysgluargasnalavalmetvalalahistyr
354045
tyrthraspprogluileglnglnleualaglugluthrglyglycys
505560
ileseraspserleuglumetalaargpheglyalalyshisproala
65707580
serthrleuleuvalalaglyvalargphemetglygluthralalys
859095
ileleuserproglulysthrileleumetprothrleuglnalaglu
100105110
cysserleuaspleuglycysprovalgluglupheasnalaphecys
115120125
aspalahisproaspargthrvalvalvaltyralaasnthrserala
130135140
alavallysalaargalaasptrpvalvalthrserserilealaval
145150155160
gluleuileasphisleuaspserleuglyglulysileiletrpala
165170175
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180185190
ileleucystrpglnglyalacysilevalhisaspgluphelysthr
195200205
glnalaleuthrargleuglngluglutyrproaspalaalaileleu
210215220
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225230235240
glyserthrserglnleuilealaalaalalysthrleuprohisgln
245250255
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260265270
alavalproasplysgluleuleuglualaprothralaglyglugly
275280285
alathrcysargsercysalahiscysprotrpmetalametasngly
290295300
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305310315320
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325330335
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340345
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<212>dna
<213>人工序列
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<223>用于扩增具有ttg的kefaorf的引物
<400>32
ttgactatgttccagtattac21
<210>33
<211>26
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增具有ttg的kefaorf的引物
<400>33
cgcggatccgtgagtcaagttgcgcc26
<210>34
<211>29
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增kefa的自身启动子的引物
<400>34
cgcgagctcccctgaatctgactccagga29
<210>35
<211>29
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增kefa的自身启动子的引物
<400>35
cgcgagctcccctgaatctgactccagga29
<210>36
<211>29
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于prhtbkefa的引物
<400>36
ccgatatcatgactatgttccagtattac29
<210>37
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于prhtbkefa的引物
<400>37
cccaagcttttaccctaccgctggcgtcgg30