本发明涉及能够生产O-磷酸丝氨酸的微生物，和利用该微生物生产O-磷酸丝氨酸、半胱氨酸或半胱氨酸衍生物的方法。
背景技术：
：L-半胱氨酸，一种在所有活生物体中的硫代谢中起重要作用的氨基酸，不仅用于诸如毛发角蛋白、谷胱甘肽、生物素、甲硫氨酸及其它含硫代谢物的生物蛋白的合成，而且用作辅酶A的生物合成前体。利用微生物生产L-半胱氨酸的已知方法包括：1)利用微生物将D,L-ATC生物转化为L-半胱氨酸的方法、2)利用大肠杆菌(E.coli)通过直接发酵来生产L-半胱氨酸的方法(EP0885962B；WadaM和TakagiH,Appl.Microbiol.Biochem.,73:48-54,2006)、和3)利用微生物通过发酵生产O-磷酸丝氨酸(下称“OPS”)并在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(下称“OPSS”)的催化作用下通过使OPS与硫化物反应而将OPS转化为L-半胱氨酸的方法(韩国专利号1381048)。具体而言，为了通过方法3)以高产率生产半胱氨酸，应过量生产前体OPS。就此而言，发明人已做出大量努力以发现能够将OPS生产微生物中生成的O-磷酸丝氨酸从细胞中顺利地输出的适当输出因子。公开内容技术问题在这些情况下，发明人发现了两种新型的生产OPS的多肽YhhS和MdtD，并证实可以通过激活这两种多肽而从OPS生产微生物中有效地输出OPS，从而完成本发明。技术方案因此，本发明的一个目的是提供生产OPS的微生物，其中能够输出OPS的多肽的活性相比于其内源活性被增强。本发明的另一目的是提供用于生产OPS的方法，包括：在培养基中培养OPS生产微生物，并从OPS生产微生物或其培养物中分离OPS。本发明的又一目的是提供通过该多肽的OPS生产或输出的用途。本发明的又一目的是提供生产半胱氨酸或其衍生物的方法，包括：a)通过在培养基中培养OPS生产微生物(其中能够输出OPS的多肽的活性相比于其内源活性被增强)而生产OPS；和b)在OPS硫化氢解酶或能够表达其的微生物的存在下，使a)中生产的OPS或含有其的培养物与硫化物反应。发明的有利效果本发明的具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列的新型多肽具有优越的OPS输出能力。因此，当将本发明的新型多肽应用于能够生产OPS的微生物时，其可以导致高产率的OPS生产，并且还可以有效地用于L-半胱氨酸的合成等。附图描述图1显示了示例在从YhhS和MdtD蛋白的功能被增强的本发明的重组微生物的培养物中去除所有输出的OPS后，通过高效液相色谱法(HPLC)得到的OPS胞内水平测量结果的图。最佳方式一方面，本发明提供了OPS生产微生物，其中具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列并且能够输出O-磷酸丝氨酸的多肽的活性相比于其内源活性被增强。如本文所用，术语“O-磷酸丝氨酸”(下称“OPS”)是指丝氨酸和磷酸的酯，其是很多蛋白质的成分。具体而言，OPS是L-半胱氨酸的前体，并且可以在OPS硫化氢解酶(以下称为“OPSS”)的催化作用下通过与硫化物反应而转化成半胱氨酸(韩国专利号1381048)。因此，增加OPS生产是半胱氨酸生产中的重要因素，因此需要研发能够使胞内OPS从OPS生产菌株有效地分泌出来的转运体。如本文所用，术语“具有输出O-磷酸丝氨酸的活性的多肽”是指具有将细胞中的OPS输出到细胞外的活性的膜蛋白，并且具体地可以是源自大肠杆菌的膜蛋白。在存在过量OPS的条件下，从消除了生长抑制的大肠杆菌中鉴定出两种膜蛋白。具体地，由此鉴定的具有OPS输出能力的膜蛋白是具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的YhhSMFS(主要促进子超家族(majorfacilitatorsuperfamily))转运体和具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的YegBMFS转运体。在本发明中，YegBMFS转运体可以与MdtD互换使用。该蛋白的OPS输出能力本发明首次验证之前是未知的。此外，该多肽可以是由SEQIDNO:1或SEQIDNO:2表示的氨基酸序列，并且可非限制地包括与上述序列具有至少70％、具体地至少80％、更具体地至少90％、还更具体地至少95％的序列同源性的膜蛋白，只要其具有与该多肽基本上相同或相当的OPS输出能力。此外，显而易见的是，其中部分序列被删除、修饰、取代或插入的多肽变体应被包括在本发明的范围内，只要其是具有这些同源性和OPS输出能力的氨基酸序列。此外，呈现OPS输出能力的多肽的多核苷酸序列可包括编码由SEQIDNO:1或SEQIDNO:2表示的氨基酸的多核苷酸序列。此外，基于遗传密码简并、考虑到有机体表达多肽所优选的密码子，可以在不改变多肽的氨基酸序列的范围内对编码区进行各种修饰。多核苷酸序列可以是由SEQIDNO:3或SEQIDNO:4表示的氨基酸序列，并且可包括与这些序列具有至少70％的序列同源性的核苷酸序列，但并不限于此。如本文所用，术语“同源性”是指与给定多肽序列或多核苷酸序列的同一性的程度，并且可以以百分比表示。如本文所用，与给定多肽序列或多核苷酸序列具有相同或相似活性的同源序列可以以“％同源性”表示。％同源性可以利用用于计算参数如评分、同一性和相似性的标准软件(即BLAST2.0)或者通过经由southern杂交实验比较序列来确定，并且适当的限定杂交条件可以通过本领域技术人员已知的方法来确定(例如，Sambrook等人，1989，见下文)。在本发明的示例性实施方式中，证实了在能够生产OPS的微生物中的YhhS蛋白(SEQIDNO:1)或MdtD蛋白(SEQIDNO:2)的活性增强时，该微生物显示具有比RhtB蛋白增强的菌株(韩国专利申请公开号10-2012-0041115)(阳性对照)、或MFS转运体EmrD或YcaD的活性增强的菌株(实验组)更优的OPS输出能力。“RhtB”是膜蛋白，由rhtB基因编码，其可以输出高丝氨酸/高丝氨酸内酯。由于已经证实OPS生产菌株中RhtB活性的增强使该菌株中的OPS输出能力增加(韩国专利号138104)，因此将其用作阳性对照。当在OPS生产菌株中分别增强RhtB蛋白以及本发明的YhhS和MdtD蛋白的活性时，RhtB蛋白以及本发明的YhhS和MdtD蛋白呈现相对于RhtB蛋白优越的OPS输出能力。此外，术语“EmrD”和“YcaD”是指大肠杆菌的MFS转运蛋白，并且分别由emrD基因和ycaD基因编码。EmrD和YcaD——如YhhS和MdtD蛋白是属于MFS转运体的蛋白——用作实验组，以检验其它属于MFS转运体的蛋白是否也可以呈现OPS输出能力。结果证实，与YhhS和MdtD蛋白不同，EmrD和YcaD蛋白不呈现OPS输出能力。同时，本发明的多肽具有OPS输出能力，因而当具有OPS生产能力的微生物中该多肽的活性与其内源活性相比被增强时，可以有效地生产OPS。如本文所用，术语“OPS生产”不仅指在菌株内的OPS生产，而且还指将细胞中的OPS至细胞外(例如，至培养基)的输出，和具体地，OPS从细胞内部向外部的输出。如本文所用，术语“内源活性”是指天然状态下(即，在未经修饰的状态下)的微生物中的多肽的活性状态。如本文所用，术语“相比于其内源活性增强”是指微生物中多肽与其天然状态下所具有的活性相比时活性增加，并且其是包括在不具有具体多肽活性的微生物中赋予具体多肽活性的概念。如本文所用，术语“活性增强”不仅指由于多肽本身的活性增加而获取比原有功能更高的效果，而且指由于内源基因活性增加、内源基因通过内部或外部因素扩增、启动子的置换、修饰或突变等而导致的蛋白质活性增加(但不具体限制于此)。具体地，活性增强可以通过诸如下列的方法进行：增加细胞中编码多肽的基因的拷贝数的方法、对编码多肽的基因的调控序列进行修饰的方法、用突变基因取代染色体上编码多肽的基因以增加该多肽的活性的方法、在染色体上的编码多肽的基因中引入修饰以增强该多肽的活性的方法等，但并不限于此。可以以相同的方式参照这些活性增强方法来增强本发明的其它多肽的活性。在上述中，基因拷贝数的增加，尽管不具体限制于此，可以在可操作地连接至载体的状态下或通过插入宿主细胞内的染色体中而进行。具体地，可以通过以下实施该方法：在宿主细胞中引入载体，通过该载体编码本发明的蛋白质的多核苷酸被可操作地连接至宿主细胞，并且可以复制并独立于宿主发挥作用；或者在宿主细胞中引入与多核苷酸可操作地连接、能够将该多核苷酸插入宿主细胞的染色体中的载体。多核苷酸在染色体中的插入可以利用本领域已知的方法进行，例如通过同源重组。由于本发明的载体可以通过同源重组插入染色体中，因此可以进一步包括用于确认在染色体中的插入的选择标记物(selectionmarker)。选择标记物用于选择转化的细胞，即，为了确认靶多核苷酸是否已被插入，并且可以使用能够提供可选表型(如耐药性、营养需求、细胞毒性试剂耐受性以及表面蛋白表达)的标记物，但并不限于此。在处理选择剂的情况下，只有能够表达选择标记物的细胞可以存活或表达其它表型性状，因而转化的细胞可以容易被选出。载体可以是DNA构建体，其包含编码目标蛋白的多核苷酸的多核苷酸序列，可操作地连接至合适的调控序列，使得目标蛋白可以在合适的宿主中表达。调控序列包括能够启动转录的启动子、用于调控转录的无规操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合域的序列、和用于调控转录和翻译的序列。载体在被转化到合适的宿主细胞中后可以独立于宿主基因组复制或发挥作用，或者可被整合到宿主基因组本身中。本发明中所使用的载体可不受具体限制——只要该载体在宿主细胞中是可复制的，且可以使用本领域已知的任何载体。载体的实例可包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可以使用pWE15、M13、λMBL3、λMBL4、λIXII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、Charon4A、Charon21A等；并且作为质粒载体，可以使用基于pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等的那些。具体地，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC载体等。如本文所用，术语“转化”是指将包含编码目标蛋白的多核苷酸的载体引入宿主细胞，从而使该蛋白所编码的多核苷酸能够在宿主细胞中表达的过程。关于转化的多核苷酸，无论是被插入宿主细胞的染色体并且定位于其中还是定位于染色体外都没有关系，只要其可以在宿主细胞中表达。此外，多核苷酸包括编码目标蛋白的DNA和RNA。多核苷酸可以以任何形式插入，只要其可以被引入宿主细胞并在其中表达。例如，可以以表达盒的形式将多核苷酸引入宿主细胞中，所述表达盒是包括自我表达所需的所有必需元素的基因构建体，但并不限于此。表达盒可常规地包括可操作地连接至多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合域和翻译终止信号。表达盒可以是能够自我复制的表达载体的形式。此外，多核苷酸可以被原样引入宿主细胞中，并可操作地连接至其在宿主细胞中表达所必需的序列。此外，如本文所用，术语“可操作地连接”是指启动子序列(其启动和介导编码本发明目标蛋白的多核苷酸的转录)和上述基因序列之间的功能性连接。然后，用于增加多核苷酸表达的表达调控序列的修饰，尽管不具体受限于此，可以通过下列进行：通过删除、插入、保守取代、非保守取代或其组合，在多核苷酸序列中诱导变异，以进一步增强表达调控序列的活性；或将多核苷酸序列用活性更强的多核苷酸序列替代。表达调控序列，尽管不具体受限于此，可包括启动子、操纵子序列、编码核糖体结合域的序列、和用于调控转录和翻译的终止的序列等。强启动子，代替原有启动子，可以被连接至多核苷酸的表达单元的上端，但并不限于此。已知的强启动子的实例可包括cj1启动子(韩国专利号0620092)、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体PR启动子、PL启动子和tet启动子。此外，染色体上多核苷酸序列的修饰，尽管不具体受限于此，可以通过下列进行：通过删除、插入、保守取代、非保守取代或其组合，在多核苷酸序列的表达调控序列上诱导变异，以进一步增强多核苷酸序列的活性；或将多核苷酸序列用活性更强的增强型多核苷酸序列替代。总体上，蛋白质活性的引入和增强可以使相应蛋白质的活性或浓度相对于野生型蛋白质的活性或浓度或在微生物菌株中增加至少1％、10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％至最高1000％或2000％，但并不限于此。如本文所用，术语“OPS生产微生物”是指其中能够生产OPS的原核或真核微生物菌株，并且具体地是指通过基因工程其中能够聚积OPS的微生物。在本发明的示例性实施方式中，微生物并不受具体限制，但可以是SEQIDNO:1或2的多肽的活性增强时可以生产OPS的任何原核或真核微生物，并且具体地是原核微生物。微生物的实例可包括属于埃希氏菌属(genusEscherichia)、欧文氏菌属(genusErwinia)、沙雷氏菌属(genusSerratia)、普罗威登斯菌属(genusProvidencia)、棒状杆菌属(genusCorynebacterium)和短杆菌属(genusBrevibacterium)的微生物菌株。具体地，微生物可以是埃希氏菌属微生物。更具体地，其可以是大肠杆菌。具体地，埃希氏菌属或棒状杆菌属微生物可生产OPS和L-丝氨酸，因为其含有SerA、SerC和SerB蛋白——这些是L-丝氨酸的生物合成途径中的酶(AhmedZahoor,ComputationalandStructuralBiotechnologyJournal,vol.3,2012年10月；WendischVF等,CurrOpinMicrobiol.2006年6月；9(3):268-74；Peters-WendischP等,ApplEnvironMicrobiol.2005年11月；71(11):7139-44)。此外，在OPS生产微生物中，磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)的活性可以相比于其内源活性被进一步减弱。SerB具有将OPS转化为L-丝氨酸的活性，因而经修饰以降低SerB活性的微生物具有在其中聚积OPS的性质，因此可用于生产OPS。SerB可以是具有由SEQIDNO:17或SEQIDNO:18表示的氨基酸序列的蛋白质，但并不限于此。此外，SerB可包括具有80％或更高，具体地90％或更高，更具体地95％或更高，甚至更具体地99％或更高的序列同一性的氨基酸序列——只要其显示出SerB活性，但并不限于此。此外，编码SerB的多核苷酸序列可具有编码由SEQIDNO:17或SEQIDNO:18表示的氨基酸的多核苷酸序列。基于遗传密码简并、考虑到生物体表达多肽所优选的密码子，可以在不改变多肽的氨基酸序列的范围内对编码区域进行多核苷酸的各种修饰。多核苷酸序列可以是由SEQIDNO:19或SEQIDNO:20表示的氨基酸序列，并且可包括与这些序列具有80％并且具体地至少90％的序列同源性的核苷酸序列，但并不限于此。如本文所用，术语“相比于其内源活性减弱”是指蛋白质活性与其天然状态下所具有的活性相比时降低，并且还包括其活性被消除时。减弱是指代以下情形的概念：蛋白质的活性由于蛋白质编码基因中的修饰等而相比于微生物原有蛋白质活性降低时的情形、整体蛋白质表达水平由于其编码基因的表达抑制或翻译抑制而低于微生物的天然菌株的水平时的情形、或基因完全不表达时的情形、和基因表达但不呈现活性时的情形。蛋白质活性的减弱或失活可以通过本领域公知的各种方法实现。方法的实例可包括利用突变基因取代染色体上编码蛋白质的基因以使酶活性可以降低的方法(包括消除蛋白质活性时的情形)；对编码蛋白质的基因的表达调控序列进行修饰的方法；将染色体上编码蛋白质的基因的部分或全部删除的方法；引入反义寡核苷酸(如反义RNA)的方法，该反义寡核苷酸通过与染色体上的基因的转录子互补结合来抑制mRNA向蛋白质的翻译；使核糖体不能附接的方法——通过将Shine-Dalgarno(SD)序列及其互补序列人工添加在编码蛋白质的基因的SD序列的前端而形成二级结构；逆转录工程(RTE)方法——添加启动子从而在相应序列的开放阅读框(ORF)的3’端进行逆转录，等等，并且还包括其组合，但并不限于此。具体地，将编码蛋白质的基因的部分或全部删除的方法可以通过如下进行：利用将染色体插入细菌的载体，用具有部分地删除的核酸序列的多核苷酸或标记基因替代染色体内编码内源目标蛋白的多核苷酸。在示例性实施方式中，可以通过同源重组来删除基因。此外，如本文所用，术语“部分”，虽然其可以根据多核苷酸种类而相异，可以具体指代1个核苷酸至300个核苷酸，更具体地1个核苷酸至100个核苷酸，甚至更具体地1个核苷酸至50个核苷酸，但并不限于此。此外，对表达调控序列进行修饰的方法可以通过如下进行：经由删除、插入、保守取代、非保守取代或其组合，在表达调控序列中诱导变异，从而进一步减弱表达调控序列的活性；或将序列用活性较弱的核酸序列替代。表达调控序列包括启动子、操纵子序列、编码核糖体结合域的序列和用于调控转录和翻译的序列。此外，对基因序列进行修饰的方法可以通过如下进行：经由删除、插入、保守取代、非保守取代或其组合，在基因序列中诱导变异，从而进一步减弱蛋白质的活性；或将序列用改良后具有较弱活性的基因序列或改良后完全不具有活性的基因序列替代。此外，OPS生产微生物可以是其中磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)或磷酸丝氨酸转氨酶(SerC)的活性相比于其内源活性进一步增强的微生物。SerA是能够将3-磷酸甘油酸转化为3-磷酸-羟基丙酮酸的蛋白质，并且关于SerA，可以使用野生型、或丝氨酸反馈被消除的变体。此外，SerC是能够将3-磷酸-羟基丙酮酸转化为OPS的蛋白质。因此，SerA和/或SerC活性增强的任何微生物都可以有效地用作OPS生产微生物。SerA可具有选自SEQIDNO:21至26的氨基酸序列，但并不限于此。SEQIDNO:21是野生型SerA的序列，而SEQIDNO:22至26是丝氨酸反馈被消除的变体的序列。此外，可以包括与上述氨基酸具有至少80％，具体地至少90％，更具体地至少95％，甚至更具体地至少99％的序列同一性的那些氨基酸序列，只要其呈现野生型SerA或丝氨酸反馈被消除的SerA变体的活性，但并不限于此。反馈被消除的变体是这样的蛋白质：其中通过插入、取代等，将修饰引入SerA编码基因上，从而能够维持通过丝氨酸或甘氨酸的反馈抑制而带来的活性，或增强其活性，并且反馈被消除的那些变体已经公知(GrantGA等,J.Biol.Chem.,39:5357-5361,1999；GrantGA等,Biochem.,39:7316-7319,2000；GrantGA等,J.Biol.Chem.,276:17844-17850,2001；Peters-WendischP等,Appl.Microbiol.Biotechnol.,60:437-441,2002；欧洲专利号EP0943687B)。此外，编码野生型SerA或丝氨酸反馈被消除的变体的多核苷酸序列可以是编码由SEQIDNO:21至26表示的任一氨基酸序列的多核苷酸序列，但并不限于此。由于遗传密码简并或考虑到生物体表达多肽所优选的密码子，可以在不改变多肽的氨基酸序列的范围内对编码区进行多核苷酸的各种修饰。例如，多核苷酸序列可以是由SEQIDNO:27至32表示的多核苷酸序列中的任一个，并且可具有与该多核苷酸序列具有至少80％，具体地至少90％的同源性的核苷酸序列，但并不限于此。SerC可以是具有例如由SEQIDNO:33表示的氨基酸序列的蛋白质，但并不限于此。此外，氨基酸序列，只要其呈现SerC活性，也可包括与上述氨基酸序列具有至少80％，具体地至少90％，更具体地至少95％，甚至更具体地至少99％的序列同一性的氨基酸序列，但并不限于此。此外，编码SerC的多核苷酸序列可以是编码由SEQIDNO:33表示的氨基酸的多核苷酸序列。由于遗传密码简并或考虑到生物体表达多肽所优选的密码子，可以在不改变多肽的氨基酸序列的范围内对编码区进行多核苷酸的各种修饰。例如，多核苷酸序列可以是由SEQIDNO:34表示的多核苷酸序列，并且可具有与该多核苷酸序列具有至少80％，具体地至少90％的同源性的核苷酸序列，但并不限于此。此外，微生物可以是其中将OPS引入或分解到细胞中的能力被进一步减弱的微生物。关于OPS生产微生物的内容，除了上述那些之外，韩国专利号1381048或美国专利申请公开号2012-0190081中的公开内容也可以用作本发明的参考。另一方面，本发明提供生产OPS的方法，包括在培养基中培养能够生产O-磷酸丝氨酸的微生物——其中具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列并且能够输出O-磷酸丝氨酸的多肽的活性被增强；和从能够生产O-磷酸丝氨酸的微生物或其培养基中分离O-磷酸丝氨酸。如本文所用，术语“培养”是指使微生物在适当调节的环境中生长。培养过程可以根据适当的培养基和本领域已知的培养条件来进行。培养过程可以容易被本领域普通技术人员根据所要选择的菌株调整使用。具体地，培养可以是分批培养、连续培养和补料分批培养(fetchculture)，但并不限于此。在培养SerB活性相比于其内源活性降低的重组微生物时，培养基可以进一步含有甘氨酸或丝氨酸，因为重组微生物的丝氨酸需求被诱导。甘氨酸可以以纯化的甘氨酸、含甘氨酸的酵母提取物或胰蛋白胨的形式提供。培养基中的甘氨酸浓度总体上为0.1g/L至10g/L，具体为0.5g/L至3g/L。此外，丝氨酸可以以纯化的丝氨酸、含丝氨酸的酵母提取物或胰蛋白胨的形式提供。培养基中的丝氨酸浓度总体上为0.1g/L至5g/L，具体为0.1g/L至1g/L。培养基中包含的碳源的实例可包括碳水化合物和糖类，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂肪，如大豆油、葵花油，蓖麻油和椰子油；脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇，如甘油和乙醇；和有机酸，如乙酸。这些碳源可以单独使用或组合使用，但并不限于此。培养基中包含的氮源的实例可包括有机氮源，如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆(CSL)和豆粉；和无机氮源，如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可以单独使用或组合使用，但并不限于此。作为磷源，培养基可进一步包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和相应的含钠盐，但并不限于此。培养基可包括金属，如硫酸镁和硫酸铁。此外，可包括氨基酸、维生素和适当的前体。这些培养基或前体可以被添加至以分批培养或连续培养的形式的培养中，但并不限于此。此外，培养物的pH可以通过以适当的方式在培养期间添加诸如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸的化合物来调节。此外，可以利用诸如脂肪酸聚乙二醇酯的消泡剂来防止培养期间气泡形成。此外，可以向培养物中添加氧气或含有氧气的气体以维持培养液中的有氧条件；可不添加空气以维持厌氧条件或微氧条件；或者可以注入氮气、氢气或二氧化碳。培养温度可以为27℃至37℃，具体地30℃至35℃。可以持续进行培养直至可实现期望物质的生产，具体为10小时至100小时。在本发明中，可以进一步分离和纯化培养期间生产的OPS。根据培养方法，如分批培养、连续培养和补料分批培养，可以利用本领域已知的适当方法从培养物中回收目标OPS，但并不限于此。另一方面，本发明提供了通过具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽得到的OPS生产和OPS输出的用途。又一方面，本发明提供了生产半胱氨酸或其衍生物的方法，包括a)通过在培养基中培养微生物来生产O-磷酸丝氨酸(OPS)，该微生物中具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列并且能够输出O-磷酸丝氨酸的多肽的活性相比于其内源活性被增强；和b)在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)或能够表达其的微生物的存在下，使a)中生成的O-磷酸丝氨酸(OPS)或含有其的培养物与硫化物反应。如本文所用，术语“O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶”(下称“OPSS”)是指催化其中向OPS提供巯基(SH)以使OPS转化为半胱氨酸的反应的多肽。此酶在Aeropyrumpernix、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatics)和阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis)中被首先发现(MinoK和IshikawaK,FEBSLetters,551:133-138,2003；BurnsKE等,J.Am.Chem.Soc.,127:11602-11603,2005)。此外，OPSS的范围不仅包括野生型OPSS蛋白，而且包括在编码OPSS的多核苷酸序列部分中包括删除、取代或添加，显示等于或高于野生型OPSS蛋白生物活性的活性的变体，例如，包括韩国专利号1381048和1208267中公开的OPSS蛋白及其变体。本发明中所使用的硫化物可以是任何硫化物——不仅有以本领域常用的固体形式提供的硫化物，而且有因pH、压力和溶解度差异而以液体或气体形式提供的硫化物，因而可以以例如硫化物(S2-)或硫代硫酸盐(S2O32-)的形式转化为巯基(SH)。具体地，本发明中所使用的硫化物可以是Na2S、NaSH、H2S、(NH4)2S或Na2S2O3，其可以为OPS提供巯基。在反应中，一个巯基被供应至一个反应性OPS基团以产生一个半胱氨酸或其衍生物。在反应中，具体地，硫化物的添加量为0.1mol至3mol，具体地1mol至2mol——每1molOPS。此外，本发明的方法进一步包括将步骤b)的反应中生成的半胱氨酸分离和纯化。在此，可以通过本领域已知的适当反应从反应溶液中分离和纯化半胱氨酸来回收期望的半胱氨酸。此外，本发明涉及通过增强OPS生产微生物中SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的多肽的活性而实现的高产率OPS生产，然后使由此生产的OPS与OPSS反应，从而有效地生产半胱氨酸。由此制备的半胱氨酸可以通过本领域已知的化学合成反应来合成各种半胱氨酸衍生物——通过修饰氢原子或具体的原子基团。如本文所用，术语“衍生物”是指通过化学修饰任何化合物的一部分而获得的类似化合物。通常，该术语是指其中氢原子或原子基团被另一氢原子或原子基团取代的化合物。如本文所用，术语“半胱氨酸衍生物”是指其中半胱氨酸的氢原子或原子基团被另一个原子或原子基团取代的化合物。例如，半胱氨酸衍生物可具有如下形式：其中半胱氨酸中的胺基(-NH2)的氮原子或巯基(-SH)的硫原子附接有另一原子或原子基团。半胱氨酸衍生物的实例包括N-乙酰基半胱氨酸(NAC)、S-羧甲基半胱氨酸(SCMC)、Boc-Cys(Me)-OH、(R)-S-(2-氨基-2-羧乙基)-L-高半胱氨酸、(R)-2-氨基-3-磺基丙酸、D-2-氨基-4-(乙基硫)丁酸、3-亚磺基-L-丙氨酸、Fmoc-Cys(Boc-甲基)-OH、硒-L-半胱氨酸、S-(2-噻唑基)-L-半胱氨酸、S-(2-噻吩基)-L-半胱氨酸、S-(4-甲苯基)-L-半胱氨酸，但并不限于此。半胱氨酸通过与乙酰化试剂反应可容易合成N-乙酰基半胱氨酸(NAC)，并且在碱性条件下，其可通过与卤代乙酸反应合成S-羧甲基半胱氨酸(SCMC)。这些半胱氨酸衍生物主要用作镇咳剂、止咳剂和支气管炎、支气管哮喘、喉咽炎治疗剂等的药用材料。发明方式下文将参考以下实施例对本发明进行更详细地描述。然而，这些实施例仅以示例为目的，并不意图本发明受限于这些实施例。实施例1：YhhSMFS转运体和YegBMFS转运体的鉴定为了鉴定OPS输出涉及的大肠杆菌膜蛋白，对大肠杆菌K12_W3110(ATCC27325)的基因组DNA文库进行筛选。具体地，为建立OPS抑制大肠杆菌生长的条件，构建了生产OPS的平台菌株(platformstrain)。用于筛选的平台菌株是经修饰降低野生型大肠杆菌菌株W3110的内源磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)的活性的重组微生物，并被命名为“KCCM11212P”(也称为“CA07-0012”；韩国专利号10-1381048；美国专利申请公开号2012-0190081)。利用该OPS生产菌株KCCM11212P，通过在含有OPS的培养基中培养作为OPS生产菌株的KCCM11212P，建立显示出生长抑制的最佳筛选条件。然后，通过电穿孔(vanderRest等.1999)将W3110的基因组文库质粒转化到CA07-0012中，并选择在含有过量OPS的培养基条件下显示出生长抑制消除的菌落。从选择的菌落获得质粒，并通过测序技术分析其核苷酸序列。结果是，鉴定出在含有过量OPS的培养基条件下消除生长抑制所涉及的两种大肠杆菌膜蛋白。这两种大肠杆菌膜蛋白被鉴定为yhhS和mdtD，其分别编码YhhS主要促进子超家族(MFS)转运体(SEQIDNO:1的氨基酸序列和SEQIDNO:3的核苷酸序列)和YegBMFS转运体(SEQIDNO:2的氨基酸序列和SEQIDNO:4的核苷酸序列)(PaoSS,PaulsenIT,SaierMH(1998).“Majorfacilitatorsuperfamily.”MicrobiolMolBiolRev1998；62(1)；1-34.PMID:9529885)。实施例2：yhhS-和mdtD-过表达载体的构建为了检验当YhhSMFS转运体和YegBMFS转运体(其在消除OPS造成的生长抑制中被涉及)在OPS生产菌株中被增强时OPS输出能力是否增强，构建了过表达各基因的载体。此外，由于发明人已经证实当高丝氨酸/高丝氨酸内酯转运体RhtB在OPS生产菌株中被增强时OPS的浓度会增加(韩国专利号138104)，因此将RhtB增强型菌株作为阳性对照。此外，还评价了多药物排出物(multidrugefflux)转运体EmrD和YcaDMFS，其属于MacB所属的主要促进子超家族(MFS)。以与YhhS和MdtD中相同的方式，对多药物排出物转运体EmrD和YcaDMFS转运体(其是属于主要促进子超家族(MFS)的大肠杆菌膜蛋白)也进行了评价。在此实施例中，利用W3110的基因组DNA作为模板，通过PCR获得了编码YhhSMFS转运体的基因yhhS(SEQIDNO:3，登录号：b3473)的片段和编码YegBMFS转运体的基因mdtD(SEQIDNO:4，登录号：b2077)的片段。用于构建各膜蛋白基因的过表达载体的引物序列显示在下表1中。[表1]具体地，使用SEQIDNO:5和6的引物进行yhhS的PCR反应，并使用SEQIDNO:7和8的引物进行mdtD的PCR反应。基于保藏于NIHGenBank的K12W3110基因(GenBank登录号AP00347)和周围核苷酸序列的信息构建PCR反应中所使用的引物。此外，使用下表1所示的各引物对，通过PCT反应扩增rhtB、emrD和ycaD基因的片段。将各扩增基因片段用限制酶EcoRV和HindIII进行处理，并克隆到pCL-PrhtB载体的EcoRV和HindIII限制酶位点——该pCL-PrhtB载体包括插入到pCL1920载体(GenBank编号AB236930)中的大肠杆菌rhtB基因的启动子(PrhtB)，从而分别构建出pCL-PrhtB-rhtB、pCL-PrhtB-yhhS、pCL-PrhtB-mdtD、pCL-PrhtB-emrD和pCL-PrhtB-ycaD。实施例3：构建YhhSMFS转运体和YegBMFS转运体增强的菌株和评价OPS生产能力<实施例3-1：利用CA07-0012构建YhhSMFS转运体和YegBMFS转运体增强的菌株和评价OPS生产能力>将实施例2中构建的5种质粒中的每一种引入OPS生产菌株CA07-0012中，然后对所得菌株的OPS生产能力进行评价。具体地，将每种菌株铺平在LB固体培养基上，并在培养箱中于33℃培养过夜。将在LB固体培养基上培养过夜的每种菌株接种到下表2所示的25mL效价培养基(titermedium)中，然后在培养箱中于34.5℃和200rpm培育40小时。结果显示在表3中。[表2]组成浓度(每1L)葡萄糖50gKH2PO46g(NH4)2SO417gMgSO4·7H2O1gFeSO4·7H2O5mgMnSO4·4H2O10mgL-甘氨酸2.5g酵母提取物3g碳酸钙30gpH6.8[表3]如上表3所示，在大肠杆菌膜蛋白基因分别被进一步引入大肠杆菌CA07-0012菌株的情况之中，具有增强的rhtB、emrD或ycaD的菌株相比于CA07-0012菌株显示OPS生产显著增加，并且具体地，具有增强的YhhS和MdtD的菌株显示OPS浓度至少150％的增加。相反，用作实验组的具有增强的EmrD和YcaD的菌株未显示出任何OPS浓度增加。称为“CA07-0012/pCL-PrhtB-yhhS”的菌株被命名为“大肠杆菌CA07-0266(CA07-0266)”，并于2013年12月9日被保藏于根据布达佩斯条约认定为国际保藏机构的韩国微生物培养中心(KoreanCultureCenterofMicroorganisms)，登录号为KCCM11495P。此外，称为“CA07-0012/pCL-PrhtB-mdtD”的菌株被命名为“大肠杆菌CA07-0267(CA07-0267)”，并于2013年12月9日被保藏于根据布达佩斯条约认定为国际保藏机构的韩国微生物培养中心，登录号为KCCM11496P。<实施例3-2：利用SerA和SerC增强的菌株构建YhhSMFS转运体和YegBMFS转运体增强的菌株和评价OPS生产能力>此外，利用OPS生产菌株，CA07-0022/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC(韩国专利申请公开号10-2012-004111)，检验大肠杆菌膜蛋白基因的效果，该菌株中作为OPS生物合成途径的D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)和3-磷酸丝氨酸转氨酶(SerC)的活性被增强。结果显示在下表4中。[表4]如上述表4所示，再次确认了在大肠杆菌膜蛋白基因被进一步引CA07-0022/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC菌株的菌株中，本发明的具有增强的YhhS和MdtD的菌株和具有增强的RhtB的菌株(阳性对照)相比于源自大肠杆菌的CA07-0012菌株显示出OPS生产增加。具体地，本发明的具有增强的YhhS和MdtD的菌株显示出OPS浓度至少145％的增加，类似于上述表3所示的结果。相反，具有增强的ErmD和YcaD的菌株相对于对照组显示出OPS浓度降低。<实施例3-3：根据启动子强度构建YhhSMFS转运体和YegBMFS转运体增强的菌株和评价OPS生产能力>此外，为了检验启动子强度的增强是否可以增加输出能力，将具有OPS浓度增加的膜蛋白YhhS和MdtD与对照组进行比较——通过利用trc启动子(Ptrc)(一种比rhtB启动子(PrhtB)更强的启动子)进一步将yhhS和mdtD基因引入CA07-0022/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC中。将yhhS和mdtD基因的片段中的每一个用限制酶EcoRV和HindIII处理，并克隆到pCL-Ptrc-GFP载体的EcoRV和HindIII限制酶位点——该pCL-Ptrc-GFP载体包括插入到pCL1920载体中的trc启动子，从而分别构建pCL-Ptrc-yhhS和pCL-Ptrc-mdtD。然后，利用各质粒作为模板连同SEQIDNO:15和SEQIDNO:16的引物对进行PCR反应，并将所得物用HindIII处理，然后克隆到pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC的HindIII限制位点。[表5]结果是，如上表5所示，当通过增强启动子来增加大肠杆菌膜蛋白的表达时，产量相比于对照组有至少150％的增加，并且相比于使用rhtB启动子时有至少120％的增加。<实施例3-4：根据染色体上的启动子强度构建YhhSMFS转运体和YegBMFS转运体增强的菌株和评价OPS生产能力>此外，为了检验在染色体上利用更强的启动子替代yhhS和mdtD基因的启动子是否可以增强输出能力，通过构建其中cj1启动子(韩国专利号0620092)替代自身启动子的菌株来评价OPS生产能力。cj1启动子在大肠杆菌染色体中的引入通过下述常规方法进行。关于染色体上yhhS和mdtD自身启动子的替代，将构建的重组载体转化到OPS生产菌株CA07-0022/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC(韩国专利号138104)中，并通过同源重组置换载体上的上述启动子序列和自身启动子序列，从而将cj1启动子序列插入到染色体中。将各菌株铺平在LB固体培养基上，并在培养箱中于33℃培养过夜。将在LB固体培养基上培养过夜的各菌株接种到上表2所示的25mL效价培养基中，然后在培养箱中于34.5℃和200rpm下培育40小时。结果显示在下表6中。[表6]如上表6所示，当染色体上各膜蛋白的表达增加时，产量相对于对照组增加上至130％。实施例4：确认YhhSMFS转运体和YegBMFS转运体的OPS输出功能在实施例3中确认OPS生产的烧瓶样品之中，在利用CA07-0022/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC(膜蛋白未增强的阴性对照)和样品CA07-0022/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC-Ptrc-yhhS和CA07-0022/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC-Ptrc-mdtD(其中膜蛋白YhhS和MdtD被增强)去除培养基中输出的全部OPS后，仅收集细胞，并将细胞破碎。通过高效液相色谱法(HPLC)测量细胞内的OPS浓度，结果显示在图1中。结果是，如图1所示，本发明的具有增强的YhhS和MdtD的菌株相比于对照组显示出胞内OPS浓度降低30％至40％，从而确认Yhhs和MdtD蛋白在输出OPS至细胞外中具有重要作用。因此，确认Yhhs和MdtD蛋白的增强可顺利地将细胞中的OPS输出到外部，从而提高OPS产生能力。根据前述，本发明所属领域技术人员将能够理解，在不改变本发明的技术思路或本质特征的情况下，本发明可以以其它具体形式实施。在这方面，本文公开的示例性实施方式仅以示例为目的，并且不应被解释为限制本发明的范围。相反，本发明旨在不仅包括示例性实施方式，而且包括可被包括在根据所附权利要求限定的本发明的精神和范围内的各种替代形式、改动、等同形式和其它实施方式。<110>CJ第一制糖株式会社<120>生产O-磷酸丝氨酸的微生物和利用其生产O-磷酸丝氨酸或L-半胱氨酸的方法<130>OPA15193<150>KR10-2014-0104670<151>2014-08-12<160>34<170>KopatentIn2.0<210>1<211>405<212>PRT<213>大肠杆菌<220><221>肽<222>(1)..(405)<223>YhhSMFS转运体,YhhS<400>1MetProGluProValAlaGluProAlaLeuAsnGlyLeuArgLeuAsn151015LeuArgIleValSerIleValMetPheAsnPheAlaSerTyrLeuThr202530IleGlyLeuProLeuAlaValLeuProGlyTyrValHisAspValMet354045GlyPheSerAlaPheTrpAlaGlyLeuValIleSerLeuGlnTyrPhe505560AlaThrLeuLeuSerArgProHisAlaGlyArgTyrAlaAspSerLeu65707580GlyProLysLysIleValValPheGlyLeuCysGlyCysPheLeuSer859095GlyLeuGlyTyrLeuThrAlaGlyLeuThrAlaSerLeuProValIle100105110SerLeuLeuLeuLeuCysLeuGlyArgValIleLeuGlyIleGlyGln115120125SerPheAlaGlyThrGlySerThrLeuTrpGlyValGlyValValGly130135140SerLeuHisIleGlyArgValIleSerTrpAsnGlyIleValThrTyr145150155160GlyAlaMetAlaMetGlyAlaProLeuGlyValValPheTyrHisTrp165170175GlyGlyLeuGlnAlaLeuAlaLeuIleIleMetGlyValAlaLeuVal180185190AlaIleLeuLeuAlaIleProArgProThrValLysAlaSerLysGly195200205LysProLeuProPheArgAlaValLeuGlyArgValTrpLeuTyrGly210215220MetAlaLeuAlaLeuAlaSerAlaGlyPheGlyValIleAlaThrPhe225230235240IleThrLeuPheTyrAspAlaLysGlyTrpAspGlyAlaAlaPheAla245250255LeuThrLeuPheSerCysAlaPheValGlyThrArgLeuLeuPhePro260265270AsnGlyIleAsnArgIleGlyGlyLeuAsnValAlaMetIleCysPhe275280285SerValGluIleIleGlyLeuLeuLeuValGlyValAlaThrMetPro290295300TrpMetAlaLysIleGlyValLeuLeuAlaGlyAlaGlyPheSerLeu305310315320ValPheProAlaLeuGlyValValAlaValLysAlaValProGlnGln325330335AsnGlnGlyAlaAlaLeuAlaThrTyrThrValPheMetAspLeuSer340345350LeuGlyValThrGlyProLeuAlaGlyLeuValMetSerTrpAlaGly355360365ValProValIleTyrLeuAlaAlaAlaGlyLeuValAlaIleAlaLeu370375380LeuLeuThrTrpArgLeuLysLysArgProProGluHisValProGlu385390395400AlaAlaSerSerSer405<210>2<211>471<212>PRT<213>大肠杆菌<220><221>肽<222>(1)..(471)<223>YegBMFS转运体,MdtD<400>2MetThrAspLeuProAspSerThrArgTrpGlnLeuTrpIleValAla151015PheGlyPhePheMetGlnSerLeuAspThrThrIleValAsnThrAla202530LeuProSerMetAlaGlnSerLeuGlyGluSerProLeuHisMetHis354045MetValIleValSerTyrValLeuThrValAlaValMetLeuProAla505560SerGlyTrpLeuAlaAspLysValGlyValArgAsnIlePhePheThr65707580AlaIleValLeuPheThrLeuGlySerLeuPheCysAlaLeuSerGly859095ThrLeuAsnGluLeuLeuLeuAlaArgAlaLeuGlnGlyValGlyGly100105110AlaMetMetValProValGlyArgLeuThrValMetLysIleValPro115120125ArgGluGlnTyrMetAlaAlaMetThrPheValThrLeuProGlyGln130135140ValGlyProLeuLeuGlyProAlaLeuGlyGlyLeuLeuValGluTyr145150155160AlaSerTrpHisTrpIlePheLeuIleAsnIleProValGlyIleIle165170175GlyAlaIleAlaThrLeuLeuLeuMetProAsnTyrThrMetGlnThr180185190ArgArgPheAspLeuSerGlyPheLeuLeuLeuAlaValGlyMetAla195200205ValLeuThrLeuAlaLeuAspGlySerLysGlyThrGlyLeuSerPro210215220LeuThrIleAlaGlyLeuValAlaValGlyValValAlaLeuValLeu225230235240TyrLeuLeuHisAlaArgAsnAsnAsnArgAlaLeuPheSerLeuLys245250255LeuPheArgThrArgThrPheSerLeuGlyLeuAlaGlySerPheAla260265270GlyArgIleGlySerGlyMetLeuProPheMetThrProValPheLeu275280285GlnIleGlyLeuGlyPheSerProPheHisAlaGlyLeuMetMetIle290295300ProMetValLeuGlySerMetGlyMetLysArgIleValValGlnVal305310315320ValAsnArgPheGlyTyrArgArgValLeuValAlaThrThrLeuGly325330335LeuSerLeuValThrLeuLeuPheMetThrThrAlaLeuLeuGlyTrp340345350TyrTyrValLeuProPheValLeuPheLeuGlnGlyMetValAsnSer355360365ThrArgPheSerSerMetAsnThrLeuThrLeuLysAspLeuProAsp370375380AsnLeuAlaSerSerGlyAsnSerLeuLeuSerMetIleMetGlnLeu385390395400SerMetSerIleGlyValThrIleAlaGlyLeuLeuLeuGlyLeuPhe405410415GlySerGlnHisValSerValAspSerGlyThrThrGlnThrValPhe420425430MetTyrThrTrpLeuSerMetAlaLeuIleIleAlaLeuProAlaPhe435440445IlePheAlaArgValProAsnAspThrHisGlnAsnValAlaIleSer450455460ArgArgLysArgSerAlaGln465470<210>3<211>1218<212>DNA<213>大肠杆菌<220><221>基因<222>(1)..(1218)<223>yhhS<400>3atgcccgaacccgtagccgaacccgcgctaaacggattgcgcctgaatttgcgcattgtc60tctatagtcatgtttaacttcgccagctacctcaccatcgggttgccgctcgctgtatta120ccgggctatgtccatgatgtgatgggctttagcgccttctgggcaggattggttatcagc180ctgcaatatttcgccaccttgctgagccgccctcatgccggacgttacgccgattcgctg240ggacccaaaaagattgtcgtcttcggtttatgcggctgctttttgagcggtctggggtat300ctgacggcaggattaaccgccagtctgcctgtcatcagcctgttattactttgcctgggg360cgcgtcatccttgggattgggcaaagttttgccggaacgggatcgaccctatggggcgtt420ggcgtggttggctcgctgcatatcgggcgggtgatttcgtggaacggcattgtcacttac480ggggcgatggcgatgggtgcgccgttaggcgtcgtgttttatcactggggcggcttgcag540gcgttagcgttaatcattatgggcgtggcgctggtggccattttgttggcgatcccgcgt600ccgacggtaaaagccagtaaaggcaaaccgctgccgtttcgcgcggtgcttgggcgcgtc660tggctgtacggtatggcgctggcactggcttccgccggatttggcgtcatcgccaccttt720atcacgctgttttatgacgctaaaggttgggacggtgcggctttcgcgctgacgctgttt780agctgtgcgtttgtcggtacgcgtttgttattccctaacggcattaaccgtatcggtggc840ttaaacgtagcgatgatttgctttagcgttgagataatcggcctgctactggttggcgtg900gcgactatgccgtggatggcgaaaatcggcgtcttactggcgggggccgggttttcgctg960gtgttcccggcattgggtgtagtggcggtaaaagcggttccgcagcaaaatcagggggcg1020gcgctggcaacttacaccgtatttatggatttatcgcttggcgtgactggaccactggct1080gggctggtgatgagctgggcgggcgtaccggtgatttatctggcggcggcgggactggtc1140gcaatcgcgttattactgacgtggcgattaaaaaaacggcctccggaacacgtccctgag1200gccgcctcatcatcttaa1218<210>4<211>1416<212>DNA<213>大肠杆菌<220><221>基因<222>(1)..(1416)<223>mdtD<400>4atgacagatcttcccgacagcacccgttggcaattgtggattgtggctttcggcttcttt60atgcagtcgctggacaccaccatcgtaaacaccgcccttccctcaatggcgcaaagcctc120ggggaaagtccgttgcatatgcacatggtcattgtctcttatgtgctgaccgtggcggtg180atgctgcccgccagcggctggctggcggacaaagtcggcgtgcgcaatattttctttacc240gccatcgtgctgtttactctcggttcactgttttgcgcgctttccggcacgctgaacgaa300ctgttgctggcacgcgcgttacagggcgttggcggcgcgatgatggtgccggtcggcaga360ttgacggtgatgaaaatcgtaccgcgcgagcaatatatggcggcgatgacctttgtcacg420ttacccggtcaggtcggtccgctgctcggtccggcgctcggcggtctgctggtggagtac480gcatcgtggcactggatctttttgatcaacattccggtggggattatcggtgcgatcgcc540acattgctgttaatgccgaactacaccatgcagacgcggcgctttgatctctccggattt600ttattgctggcggttggcatggcggtattaaccctggcgctggacggcagtaaaggtaca660ggtttatcgccgctgacgattgcaggcctggtcgcagttggcgtggtggcactggtgctt720tatctgctgcacgccagaaataacaaccgtgccctgttcagtctgaaactgttccgtact780cgtaccttttcgctgggcctggcggggagctttgccggacgtattggcagtggcatgttg840ccctttatgacaccggttttcctgcaaattggcctcggtttctcgccgtttcatgccgga900ctgatgatgatcccgatggtgcttggcagcatgggaatgaagcgaattgtggtacaggtg960gtgaatcgctttggttatcgtcgggtactggtagcgaccacgctgggtctgtcgctggtc1020accctgttgtttatgactaccgccctgctgggctggtactacgttttgccgttcgtcctg1080tttttacaagggatggtcaactcgacgcgtttctcctccatgaacaccctgacgctgaaa1140gatctcccggacaatctggcgagcagcggcaacagcctgctgtcgatgattatgcaattg1200tcgatgagtatcggcgtcactatcgccgggctgttgctgggactttttggttcacagcat1260gtcagcgtcgacagcggcaccacacaaaccgtctttatgtacacctggcttagcatggcg1320ttgatcatcgcccttccggcgttcatctttgccagagtgccgaacgatacgcatcaaaat1380gtagctatttcgcggcgaaaaaggagcgcgcaatga1416<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增yhhS以构建pCL-PrhtB-yhhS的引物<400>5gatatcatgcccgaacccgtagc23<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增yhhS以构建pCL-PrhtB-yhhS的引物<400>6aagcttttaagatgatgaggcggcct26<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增mdtD以构建pCL-PrhtB-mdtD的引物<400>7gatatcatgacagatcttcccgacagc27<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增mdtD以构建pCL-PrhtB-mdtD的引物<400>8aagctttcattgcgcgctccttt23<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增rhtB以构建pCL-PrhtB-rhtB的引物<400>9gatatcatgaccttagaatggtgg24<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增rhtB以构建pCL-PrhtB-rhtB的引物<400>10aagctttcacgcatgcctcgccga24<210>11<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增emrD以构建pCL-PrhtB-emrD的引物<400>11gatatcatgaaaaggcaaagaaacgtcaa29<210>12<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增emrD以构建pCL-PrhtB-emrD的引物<400>12aagcttttaaacgggctgcccct23<210>13<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增ycaD以构建pCL-PrhtB-ycaD的引物<400>13gatatcatgtccacgtatacccagcctg28<210>14<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增ycaD以构建pCL-PrhtB-ycaD的引物<400>14aagcttttacacgtgagcaacgggttt27<210>15<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增pCL-PrhtB-基因以构建pCL-Prmf-serA(G336V)-serC_PrhtB-基因的引物<400>15aagcttcgggcctcttcgctattacgc27<210>16<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增pCL-PrhtB-基因以构建pCL-Prmf-serA(G336V)-serC_PrhtB-基因的引物<400>16aagcttaggcttacccgtcttactgtc27<210>17<211>446<212>PRT<213>谷氨酸棒状杆菌<220><221>肽<222>(1)..(446)<223>磷酸丝氨酸磷酸酶,SerB<400>17MetSerCysSerAlaLeuArgHisGluThrIleValAlaValThrGlu151015LeuIleGlnAsnGluSerGlnGluIleAlaGluLeuGluAlaGlyGln202530GlnValAlaLeuArgGluGlyTyrLeuProAlaValIleThrValSer354045GlyLysAspArgProGlyValThrAlaAlaPhePheArgValLeuSer505560AlaAsnGlnValGlnValLeuAspValGluGlnSerMetPheArgGly65707580PheLeuAsnLeuAlaAlaPheValGlyIleAlaProGluArgValGlu859095ThrValThrThrGlyLeuThrAspThrLeuLysValHisGlyGlnSer100105110ValValValGluLeuGlnGluThrValGlnSerSerArgProArgSer115120125SerHisValValValValLeuGlyAspProValAspAlaLeuAspIle130135140SerArgIleGlyGlnThrLeuAlaAspTyrAspAlaAsnIleAspThr145150155160IleArgGlyIleSerAspTyrProValThrGlyLeuGluLeuLysVal165170175ThrValProAspValSerProGlyGlyGlyGluAlaMetArgLysAla180185190LeuAlaAlaLeuThrSerGluLeuAsnValAspIleAlaIleGluArg195200205SerGlyLeuLeuArgArgSerLysArgLeuValCysPheAspCysAsp210215220SerThrLeuIleThrGlyGluValIleGluMetLeuAlaAlaHisAla225230235240GlyLysGluAlaGluValAlaAlaValThrGluArgAlaMetArgGly245250255GluLeuAspPheGluGluSerLeuArgGluArgValLysAlaLeuAla260265270GlyLeuAspAlaSerValIleAspGluValAlaAlaAlaIleGluLeu275280285ThrProGlyAlaArgThrThrIleArgThrLeuAsnArgMetGlyTyr290295300GlnThrAlaValValSerGlyGlyPheIleGlnValLeuGluGlyLeu305310315320AlaGluGluLeuGluLeuAspTyrValArgAlaAsnThrLeuGluIle325330335ValAspGlyLysLeuThrGlyAsnValThrGlyLysIleValAspArg340345350AlaAlaLysAlaGluPheLeuArgGluPheAlaAlaAspSerGlyLeu355360365LysMetTyrG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