糖底物的磷酸化是对细胞代谢至关重要的常见生化转化(1-3)。其通常涉及磷酰基从磷酸化活化的供体底物(例如ATP)转移至糖主链上的受体基团(4-7)，通常为羟基。各种磷酸转移酶催化糖的磷酸化(8-12)。在由糖苷磷酸化酶催化的备选反应中，其中磷酸化仅在糖的异头位置发生，糖基残基从糖供体底物转移至磷酸盐(图1A)(13-14)。与糖连接的磷酸酯部分是生物识别的关键要素，例如整个糖酵解的所有步骤，并且其用于引导糖在不同生物化学途径中进一步转化(15-18)。从细胞内代谢物分析研究中已知，常见的糖磷酸酯(例如D-葡萄糖-6-磷酸酯，Glc-6-P；D-果糖-6-磷酸酯，Fru-6-P)的浓度变化通常与细胞生理的主要改变相关(19-22)。由于在不同生物学研究中对可靠的参考材料的需求，对糖磷酸酯的合成制备(20)有相当大的兴趣。技术上来说，糖磷酸酯作为营养补充剂和增味剂应用于食品和饲料产品；作为化妆品中的保湿成分；作为洗涤剂中的离子型表面活性剂；以及作为新聚合物的结构单元(23-25)。已经成功开发了天然已知的磷酸化反应，用于糖磷酸酯的生物催化合成。糖基转移至磷酸酯基本上限于应用在己糖-1-磷酸酯产物，并且糖苷磷酸化酶反应的相对较窄的底物范围限制一个至仅几个糖基磷酸酯，其已在制备规模上证明能有效生产(例如α和β-Glc-1-P(26,27)，α-D-半乳糖-1-磷酸酯(28))。相反，磷酸转移酶反应提供了方便获得多种糖磷酸酯产物的途径，如多种己糖底物通过例如糖激酶的核苷三磷酸依赖性磷酸化所示(29-33)。然而，磷酸化活化的供体底物的高成本和由所得的脱磷酸化产物(例如来自ATP的ADP)引起的酶抑制需要磷酰基供体仅以催化量提供，并因此在反应期间被连续再生(图1B)(34,35)。这使得生物催化的磷酰基转移成为技术上复杂的整体转化，目前在糖磷酸酯合成中使用有限。在其天然的磷酸单酯水解反应的改变中，磷酸酶催化的转磷酸化被认为是糖磷酸酯的替代途径(图1C)(36-39)。在糖以足以有效地超出与水反应的浓度存在的条件下，一些磷酸酶(例如酸性磷酸酶)以中等(例如D-甘露糖-6-磷酸酯；15％)至优良的产率(例如Glc-6-P；高达95％)(37)促进糖磷酸酯的形成。使用合适的磷酰基供体底物例如无机焦磷酸盐或寡磷酸盐是有利的。然而，供体底物水解的高度优势、糖磷酸酯产物的快速二次水解以及所释放的磷酸的组合抑制和质量作用效应(图1C)是磷酸酶催化合成的关键问题(40,41)。因此，仍然需要确认具有改善的合成效力的转磷酸化系统。本发明的目的是提供用于以高产率有效生产糖磷酸酯的系统。特别地，本发明的目的是提供用于从多种磷酸供体底物向糖底物的酶促磷酰基转移的方法和材料。本发明的发明人能够证明，具有α-葡萄糖-1-磷酸酶活性的酶能够有效地催化多种磷酸供体和糖底物之间的转磷酸化反应，因此是用于灵活的生成糖磷酸酯的非常有效的工具。因此，上述的本发明的目的通过以下方法来实现：一种通过酶促转磷酸化制备一种或多种糖磷酸酯的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供一种或多种糖底物，(ii)提供一种或多种磷酸供体底物，(iii)提供α-葡萄糖-1-磷酸酶或具有α-葡萄糖-1-磷酸酶活性的酶，(iv)将步骤(i)中提供的一种或多种糖底物和步骤(ii)中提供的一种或多种磷酸供体底物与步骤(iii)中提供的α-葡萄糖-1-磷酸酶或具有α-葡萄糖-1-磷酸酶活性的酶在允许转磷酸化的条件下一起温育，(v)任选地，纯化在步骤(iv)中获得的一种或多种糖磷酸酯。在本发明的上下文中，术语转磷酸化是指一个或多个磷酸基团从供体底物向受体底物的转移。在本发明的上下文中，底物可以是能够在一个或多个位置提供或接受一个或多个磷酸基团的任何分子。特别地，本发明上下文中的底物是磷酸化或未磷酸化的碳水化合物，例如醛糖或酮糖。在上述详细方法的步骤(iii)中提供的酶可以是由一种或多种酶或其片段组成的任何催化实体，其能够催化α-葡萄糖-1-磷酸酯水解(例如酶分类EC3.1.3.10的酶(葡萄糖-1-磷酸酶))。特别地，所提供的酶可以是α-葡萄糖-1-磷酸酶。例如，可使用来自大肠杆菌的agp基因产物α-Glc-1-P磷酸酶。关于在步骤(iv)中可调节的允许磷酸化的条件，上面已经提到，糖底物的浓度必须有效地超出与水的反应，以便以高产率促进糖磷酸酯形成。在本发明的上下文中，已经发现，当将5至30倍过量的糖底物加入到通过糖磷酸酶进行的糖磷酸酯的转化中时，令人惊讶地，转化率可以以糖底物浓度的双曲线依赖性方式增加最多约5倍。与不存在糖底物的情况下进行的对照反应相比，磷酸释放速率同时降低。令人惊讶的是，磷酸酶在外部受体的存在下以某种方式“活化”。此外，尽管磷酸酶对于在反应中合成的每个糖磷酸酯具有显著的水解酶活性，在实验的时间跨度中有利地没有观察到转磷酸化产物向二次水解的损失。与其他磷酸酶催化的转磷酸化反应(其中产物的动力学稳定性给生物催化转化的合成应用(37,38)带来问题)不同，形成了糖磷酸酯，就好像它们是真正的平衡产物，因此使其能够方便地生产。组氨酸酸性磷酸酶家族的许多磷酸酶在酸性pH范围(≤5.0)中表现出它们最佳的活性。然而，如本发明的上下文中所示，活性在4.0-6.0的pH范围内是恒定的，并且在较高的pH下仅逐渐降低。在上述方法的一个优选实施方案中，糖底物选自醛糖和酮糖，优选地选自葡萄糖、葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、果糖、半乳糖、岩藻糖、甘露糖、山梨糖、木糖、阿拉伯糖、木糖醇、阿拉伯糖醇、鼠李糖和N-乙酰神经氨酸和这些糖的磷酸酯，优选这些糖的单磷酸酯。根据上述方法的另一个优选实施方案，所述一种或多种磷酸供体底物选自α-葡萄糖-1-磷酸酯、葡萄糖-6-磷酸酯、果糖-6-磷酸酯和果糖-1-磷酸酯。在本发明的上下文中已经证明，可以通过本文所述的方法使用一系列磷酸供体底物有效地磷酸化多种糖底物，有利地提供期望的糖磷酸酯的灵活生产。在本发明的方法的特别优选的实施方案中，步骤(ii)中提供的磷酸供体底物或磷酸供体底物之一是α-葡萄糖-1-磷酸酯。该Cori酯，即α-葡萄糖-1-磷酸酯(α-Glc1-P)是细胞碳水化合物代谢的关键中间体。其在25℃下的水解自由能(ΔG°_水解)为-5.0kcal/mol，这类似于焦磷酸盐(ΔG°_水解＝-4.6kcal/mol)，并且α-Glc1-P仅略低于ATP(ΔG°_水解＝-7.3kcal/mol)。从不同的糖，特别是从蔗糖(26)方便地产生α-Glc1-P。其糖苷磷酸单酯基团引导α-Glc1-P用于在葡萄糖基和磷酰基转移反应中的灵活利用，然而到目前为止，α-Glc1-P的生物催化用途完全限制为葡萄糖苷合成(例如(42,43))。根据另一个优选的实施方案，在本发明的方法中，步骤(ii)包括在磷酸酯或一种或多种磷酸酯源的存在下通过蔗糖磷酸化酶[EC2.4.1.7]或具有蔗糖磷酸化活性的酶将蔗糖经酶促转化为D-果糖和α-D-葡萄糖-1-磷酸酯。方便地，作为磷酸供体底物或底物之一的α-D-葡萄糖-1-磷酸酯可以通过蔗糖磷酸化酶或具有蔗糖磷酸化酶活性的酶在磷酸酯存在下将蔗糖简单转化为D-果糖和α-D-葡萄糖-1-磷酸酯来提供。这允许通过简单的酶转化使用蔗糖作为廉价的离析物。在上述方法的特别优选的实施方案中，步骤(ii)和步骤(iv)以及任选的步骤(iii)同时进行，优选在一锅反应中进行。有利地，蔗糖磷酸化酶或具有蔗糖磷酸化酶活性的酶在磷酸盐存在下将蔗糖转化为D-果糖和α-D-葡萄糖-1-磷酸酯以及转磷酸化反应可以常规地在一锅反应中进行，不需要插入分离或纯化的步骤。在另一方面，本发明提供了生物催化剂，其具有蔗糖磷酸化酶活性和α-葡萄糖-1-磷酸酶活性和/或包含蔗糖磷酸化酶和α-葡萄糖-1-磷酸酶或由其组成。因此，本发明的另一方面涉及上述生物催化剂在如上所述的方法中的用途。在本发明的上下文中，术语生物催化剂是指具有指定的一种或多种活性的任何催化实体，并且可以是单个双功能或多功能酶以及两种或更多种酶或其片段的混合物。根据本发明的生物催化剂提供用于在一锅反应中进行上述方法的步骤(ii)和(iv)的可立即使用(readytouse)的单个产物，而不需要调节反应条件。因此，其允许在单一的反应设置中生产糖磷酸酯，导致所需糖磷酸酯产物的高产率。在本发明方法的另一个优选实施方案中，步骤(iii)包括通过宿主细胞表达α-葡萄糖-1-磷酸酶或具有α-葡萄糖-1-磷酸酶活性的酶，优选在宿主细胞的细胞质中表达。已知适合生物技术应用的很多种微生物都可以用作所需酶的同源或异源表达的宿主细胞。步骤(iii)可以例如包括在宿主细胞中表达与大肠杆菌的agp基因具有大于75％、优选大于85％、更优选大于95％、最优选大于99％的核苷酸序列同一性的核苷酸序列，优选在宿主细胞的细胞质中表达。在本发明的背景中，借助Waterman-Smith算法确定核苷酸序列相似性，所述算法具有缺口开放罚分(gapopenpenalty)为10，缺口延伸罚分(gapextensionpenalty)为0.5以及Blosum62矩阵。Waterman-Smith算法描述于SmithT.F.和WatermanM.S.，“Identificationofcommonmolecularsubsequences”，JournalofMolecularBiology(1981)，147：195-197，以及例如通过EMBL的相应工具页在线实施，目前为“EMBOSS::water”，可通过www.ebi.ac.uk/tools/emboss/align/获得。此外，在优选的实施方案中，α-葡萄糖-1-磷酸酶或具有α-葡萄糖-1-磷酸酶活性的酶分别表达为重组融合蛋白，其包含适于分离α-葡萄糖-1-磷酸酶或具有α-葡萄糖-1-磷酸酶活性的酶的标记。例如，通过agp基因的表达获得的大肠杆菌α-葡萄糖-1-磷酸酶已经在本发明的上下文中证明是用于上述转磷酸化反应的强大的生物催化剂。在另一方面，本发明因此涉及α-葡萄糖-1-磷酸酶或具有α-葡萄糖-1-磷酸酶活性的酶用于一种或多种糖底物，特别是醛糖和酮糖的转磷酸化的用途。α-葡萄糖-1-磷酸酶是在本发明的上下文中首次报道的成功用于各种糖磷酸酯的灵活生产的转磷酸化反应中的生物催化剂。本发明的另一方面涉及生产重组融合蛋白的方法，所述重组融合蛋白具有大于75％，优选大于85％，更优选大于95％，最优选大于99％的与大肠杆菌α-葡萄糖-1-磷酸酶的氨基酸序列同一性，并且具有适于分离该蛋白质的标签，该方法包括在宿主细胞中，优选在宿主细胞的细胞质中表达核苷酸序列的步骤。在本发明的上下文中，氨基酸序列相似性也是借助于Waterman-Smith算法确定的，缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5以及如上所述的Blosum62矩阵。酶作为具有适于分离蛋白质的标签(例如Strep-标签)的融合蛋白，其表达允许使用标准方法容易且有效地纯化酶。agp基因在大肠杆菌中的过表达导致重组酶在周质空间中的蓄积，因此22个氨基酸长度的N端靶向序列被正确加工除去(59,60)。然而，α-Glc1-P磷酸酶的细胞质生产将是有用的，因为在细胞质中不存在N-末端加工，提供了用功能标签修饰N末端的灵活性。然而，当在大肠杆菌细胞质中表达重组α-Glc1-P磷酸酶时，在这些条件下蛋白质结构中二硫键的存在提供了蛋白质生产的关键问题，其在内源性二硫键异构酶(DsbC)共表达时则可以避免(61)。最终的α-Glc1-P磷酸酶构建体具有缺失的靶向序列和添加的N-末端Strep-标签以便于帮助回收。因此，在上述方法的优选实施方案中，具有二硫键异构酶活性的酶与所述重组融合蛋白共表达。在另一方面，本发明涉及与大肠杆菌的α-葡萄糖-1-磷酸酶具有大于75％，优选大于85％，更优选大于95％，最优选大于99％的氨基酸序列同一性的重组融合蛋白，并且具有适于分离蛋白质的标签，优选通过上述方法获得或可通过上述方法获得。如上所述的重组融合蛋白提供了通过酶促转磷酸化来有效生产多种糖磷酸酯的有力工具。添加以下实施例和附图以说明本发明，但不限制保护范围。附图说明图1：由二糖磷酸化酶(A)、激酶(B)和磷酸酶(C)催化的反应。图2：推荐的由αGlc1-P磷酸酶催化的αGlc1-P水解的双转位样机制(A)。(B)通过αGlc1-P磷酸酶催化的从αGlc1-P到Fru的磷酰基转移。图3：从10个单独的波长扫描平均的αGlc1-P磷酸酶的CD光谱。图4：通过从纯化的αGlc1-P磷酸酶(SEQIDNO：7)生成的胰蛋白酶和糜蛋白酶解的肽的LC-MS/MS分析得到的序列覆盖。匹配的肽是粗体。图5：用αG1Pase催化的产物形成。(A)(■)D-果糖(□)D-葡糖胺(●)D-半乳糖(○)N-乙酰葡糖胺(▲)L-岩藻糖(B)(□)D-甘露糖(■)L-山梨糖(Δ)D-木糖(▲)L-阿拉伯糖(○)D-木糖醇(●)L-阿拉伯糖醇。图6：由αGlc1-P磷酸酶催化的从αGlc1-P和Glc合成Glc6-P的时间进程。反应混合物含有在50mMMes(pH7.0)中的20mMαGlc1-P、200mMGlc和0.1μMαGlc1-P磷酸酶。符号表示：αGlc1-P(▼)、Glc6-P(■)和磷酸盐(○)。图7：分别在100mM(A)、200mM(B)、400mM(C)和600mMFru(D)存在下从20mMαGlc1-P生成Fru1-P(●)的时间进程。指示形成副产物Glc6-P(▼)、Fru6-P(○)和磷酸盐(◇)。Fru1-P与Glc6-P(F1P/G6P)、Fru1-P与Fru6-P(F1P/F6P)以及Fru1-P与水解物(F1P/Pi)的比率显示在右侧一列，其是从显示在左侧的相应时间进程中提取。图8：由αGlc1-P磷酸酶催化的水解-转磷酸化反应的动力学研究。(A)总转磷酸化率(Fru1-P、Fru6-P、Glc6-P)和αGlc1-P消耗率的比率取决于Fru浓度(100mM-600mM；实线)。该比率在高Fru浓度下接近1，如虚线所示。(B)对于αGlc1-P消耗(○)和Fru1-P合成(●)的对数的kcat_app的pH依赖性。线条是方程3对数据的拟合。(C)在200mMFru存在下的20mMαGlc1-P的完整时程。符号表示：αGlc1-P(▼)，磷酸化产物总和(■)和磷酸盐(○)。(D)在不同的Fru起始浓度下进行的转磷酸化反应中在50分钟时合成的磷酸化产物。Fru1-P(灰色)、Glc6-P(黑色)、Fru6-P(灰色虚线)、磷酸盐(白色)。图9：通过蔗糖磷酸化酶(SPace)和α-Glc1-P磷酸酶(α-G1Pase)组合的生物催化剂合成α-糖基磷酸酯。图10：被葡萄糖-1-磷酸酶磷酸化的受体底物。确定每个受体的αGlc1-P消耗速率(rS)与磷酸释放速率(rP)的比率。D-葡萄糖醛酸和D-半乳糖胺不被葡萄糖-1-磷酸酶磷酸化。除了N-乙酰基D-葡萄糖胺(GlcNAc)38％、D-葡萄糖胺(D-GlcN)81％、D-木糖(D-Xyl)69％、L-阿拉伯糖(L-Ara)86％、D-木糖醇(D-Xol)89％和L-岩藻糖(L-Fuc)75％以外，在转化率>90％下测定产物产率。除了(*)D-葡糖胺的主要产物在C6-OH被磷酸化以外，所有受体在C1-OH位置被磷酸化。浅灰色柱表示rS/rP比率，而深灰色柱表示产物产率。反应含有20mMαGlc1-P和200mM受体。图11：D-甘露糖1-P产率对受体与供体的比率的依赖性。在独立的反应设置中，D-葡萄糖1-磷酸酯浓度(50mM、160mM、400mM、500mM和1M)和葡萄糖-1-磷酸酶浓度(0.3μM、1.3μM、1.7μM和3.3μM)变化，而D-甘露糖(1M)浓度保持恒定。符号表示：(●)D-甘露糖1-磷酸酯产率和(○)受体与供体比率(D-Man/αGlc1-P)。图12：(A)以同时反应模式操作的一锅法两步级联反应。在开始时同时加入底物(100mM蔗糖、100mM磷酸酯*、800mMD-甘露糖)和酶(1.3μMSPase、0.1μMαG1Pase)。(B)以顺序模式操作的一锅法两步级联反应。在第一步中，将蔗糖和磷酸酯(各200mM)通过SPase(1.3μMSPase)催化转化为D-葡萄糖1-磷酸酯和D-果糖。在第二步中，αG1Pase(0.1μM)将D-葡萄糖1-磷酸酯和D-甘露糖(终浓度：800mM)转化为D-甘露糖1-磷酸酯和副产物。反应条件：50mMMES,pH7.0,37℃,650rpm。符号表示：D-葡萄糖1-磷酸酯D-葡萄糖6-磷酸酯(□)、D-甘露糖1-磷酸酯(●)和磷酸盐(◇)。化学品和试剂：除非另有说明，所有化学品均来自Sigma-Aldrich(奥地利维也纳)或Roth(Karlsruhe，德国)的最高纯度。GeneJET基因组DNA纯化试剂盒来自ThermoFisherScientific(Waltham，USA)。寡核苷酸来自Sigma-Aldrich。DNA测序在LGCGenomics(德国柏林)进行。电感受态大肠杆菌OrigamiB(DE3)细胞来自Novagen(MerckKgaA，Darmstadt，德国)。H218O(97％同位素纯度)来自Sigma-Aldrich。α-Glc1-P、Glc6-P、Fru6-P的钠盐和焦磷酸盐来自Sigma-Aldrich。Fru1-P的钡盐来自Sigma-Aldrich。植酸盐(钠盐)来自Roth。β-Glc1-P的钾盐(27)来自Prof.TomDesmet(比利时根特大学)。含有1％三甲基氯硅烷的N,O-二(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA/1％TMCS)和吡啶来自Sigma-Aldrich。蔗糖磷酸化酶的纯化制剂来自肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)(SPase)(51)，甘露醇1-磷酸酯脱氢酶来自烟曲霉菌(52)，通过报道的方法获得。实施例1：酶的制备和鉴定α-Glc1-P磷酸酶是agp基因产物，并且该酶位于大肠杆菌周质(44)。具有葡糖基磷酸酯配体的酶复合物的晶体结构揭示了高分子量组氨酸酸性磷酸酶家族的成员的典型的双结构域蛋白质拓扑学(45)。蛋白质折叠包括紧邻α/β结构域的离散的α-螺旋结构域和位于两个结构域之间的深裂缝中的催化中心(45)。α-Glc1-P磷酸酶结构在Cys94和Cys125、Cys189和Cys195、以及Cys384和Cys392之间显示3个二硫键(45)。活性位点含有被认为起催化亲核体作用的高度保守的组氨酸(His18)。Asp290是可能的普通酸-碱催化剂，并且α-Glc1-P的磷酸单酯基团通过带正电荷的残基(Arg17，Arg21，Arg94，His289)的簇紧密地保持在此位(45)。所提出的α-Glc1-P磷酸酶的催化反应遵循通过共价磷酸-组氨酸中间体的双转位样机制，如图2A所示。αGlc1-P磷酸酶的分子克隆、表达和纯化：将大肠杆菌BL21-Gold(DE3)细胞在30℃下在Lennox-培养基中生长过夜。将细胞在20,000g和4℃下离心30分钟。将沉淀用于制备基因组DNA。通过使用PhusionDNA聚合酶(ThermoFisherScientific，Waltham，USA)与寡核苷酸引物1(SEQIDNO1)和2(SEQIDNO2)组合的PCR扩增编码αGlc1-P磷酸酶的基因(表1)。PCR由以下组成：在98℃、5分钟的预加热步骤，接着30个反应循环：98℃变性30秒，70℃退火30秒，72℃延伸1.5分钟。最终延伸步骤在72℃进行5分钟。使用SignalIP-4.1在生物序列分析中心(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)预测N-末端66bp长的信号序列的存在。为了除去N末端信号序列、添加N末端Strep-标签并且使重叠区域的基因末端延伸至载体，进行PCR，其中使用寡核苷酸引物3(SEQIDNO3)和4(SEQIDNO4)(表1)。为了将具有重叠区域的基因开始延伸至载体，进行了使用引物5(SEQIDNO5)和3(SEQIDNO3)的PCR。最终的扩增产物用DpnI处理以消化亲本模板。通过Gibson装配将最终构建体克隆到线性化的pMS470_dsbC载体中。将具有结构基因的测序质粒载体转化到大肠杆菌OrigamiB细胞中。将接受的大肠杆菌菌株在含有0.115mg/mL氨苄青霉素的Lennox培养基中在37℃和110rpm下在1-L带挡板的摇瓶中培养。当OD600达到0.8时，将温度降低至18℃，随后用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(0.01mM)诱导。20小时后，将细胞在4℃和4,420g下离心30分钟(SorvallRC-5B冷冻超速离心机；DuPontInstruments，Newtown，USA)。将沉淀重悬于50mMMes，pH7.0，pH7.0中，并在-20℃冷冻。将解冻的细胞悬浮液在150巴下通过French压力细胞压力机(AmericanInstruments，SilverSprings，USA)两次，并通过在4℃，20,000g离心30分钟除去细胞碎片。使用Strep-Tactin琼脂糖柱(IBA，德国)，使用其他地方描述的一般方案(51)从粗提取物中分离αGlc1-P磷酸酶。将含有αGlc1-P磷酸酶的合并组分加载到FractogelEMD-DEAE柱(Merck，Darmstadt，Germany)上并根据标准方案纯化。使用AmiconUltra-15离心过滤器单元(Millipore，Billerica，USA)进行缓冲液交换到50mMMes，pH7.0(αGlc1-P磷酸酶)。注意：除非提及，所有进一步的实验在50mMMes缓冲液，pH7.0中进行。通过SDS-PAGE监测纯化；蛋白条带通过银染显色。表1：用于αGlc1-P磷酸酶分子克隆的寡核苷酸引物。CD光谱：αGlc1-P磷酸酶(0.4mg/mL)的远紫外CD光谱在JascoJ715分光偏振仪(JASCOInst.，Gross-Umstadt，德国)上在25℃下记录。在190nm至260nm的波长范围内以100nm/min的扫描速度使用2.0nm的带宽和1.0s的响应时间收集CD光谱。所有光谱在0.01cm比色皿中记录。对于每个样品，记录10个光谱，取平均值，并扣除缓冲液信号。通过使用Dichroweb(54)和参考数据库No.4评价CD光谱。来自α-Glc1-P磷酸酶的溶液的远紫外圆二色光谱(CD)谱图如图3所示。二级结构元件的相对含量的估计值总结在表2中，其中它们与从实验的蛋白质结构得到的数据进行比较。结果一致表明α-螺旋相对于β-折叠稍微过量，并且结构的相当一部分被分类为无序的。在所使用的重组酶制剂中没有主要蛋白错误折叠的提示。表2：从CD谱和从晶体结构(在括号中)获得的αGlc1-P磷酸酶的二级结构元件的相对含量。质谱：为制备样品，将纯化的αGlc1-P磷酸酶(5μg)用20mM碘乙酰胺(IAA)溶液在37℃温育30分钟，并用改性胰蛋白酶(Promega,Madison,USA)(55)和/或用0.5μg糜蛋白酶(RocheAppliedSciences,Penzberg,Germany)在50mM碳酸氢铵和10mMCaCl2中消化。对于MS分析，将消化物酸化至0.1％甲酸，并用配备有μ-前柱(C18,5μm,5×0.3mm)和AcclaimPepMapRSLC纳米柱(C18,2μm,150×0.075mm)(全部来自ThermoFisherScientific)的纳米-HPLC(DionexUltimate3000)分离。将约0.5μg消化的蛋白质进样，并以0.5％三氟乙酸作为等度溶剂，以20μL/min的流速在富集柱上浓缩2分钟。使用以下梯度以300nL/min的流速在纳米柱上进行分离，其中溶剂A是0.05％三氟乙酸水溶液，且溶剂B是0.05％三氟乙酸在80％乙腈中的溶液：0-2min:4％B；2-70min:4-28％B；70-94min:28-50％B,94-96min:50-95％B；96-116min:95％B；116-116.1min:95-4％B；116.1-140min:在4％B重新平衡。样品在装备有不锈钢发射器的纳米喷雾源(ES528,ThermoFisherScientific)中电离，并在以正离子模式操作的Orbitrapvelos质谱仪(ThermoFisherScientific)中，在离子回旋加速器中应用交替全扫描MS(m/z400-2000)，以及启用动态排除的MS/MS通过更高能量碰撞解离的最强的20个峰来进行分析。通过用Mascot2.3(MatrixScience,London,UK)搜索包含αGlc1-P磷酸酶和已知背景蛋白的蛋白质序列的数据库来分析LC-MS/MS数据。搜索标准是电荷2+或3+，前体质量误差0.05Da，产物质量误差0.7Da，且脲基甲基化、甲硫氨酸的氧化、半胱氨酸(二硫化物)的-2H作为可变修饰。选择使用诱饵数据库搜索的最大错误发现率为0.05、离子得分截止值为20和最少2个鉴定的肽作为蛋白质鉴定标准。液相色谱-串联质谱法用于重组α-Glc1-P磷酸酶的分离制备中的二硫键的测定。使用胰蛋白酶或糜蛋白酶的蛋白质消化解析为62％的总序列覆盖度，214个肽，37个独特肽，Mascot评分6046(图4)。在Cys189和Cys195之间的三个天然二硫键之一的同一性从肽KDSPACKEKQQCSLVDGKNTF(SEQIDNO6)(离子得分:34；预期0.00042)清楚确认。结果清楚表明，在所用的表达条件下二硫键的形成是可能的。测定：使用20mMαGlc1-P作为底物，在37℃和pH7.0下测定α-Glc1-P磷酸酶的比活性。通过加入α-Glc1-P磷酸酶(0.1μM)开始反应，并在75分钟内测量游离磷酸盐的释放。在850nm处比色测定无机磷酸盐(56)。α-Glc1-P和Glc6-P在具有磷酸葡萄糖变位酶和Glc6-P脱氢酶的偶联酶系统中测定(57)。使用甘露醇1-磷酸酯脱氢酶测定法(52)测量Fru6-P。Fru1-P间接从消耗的底物(Δ[αGlc1-P])和形成的产物的磷酸质量平衡(方程1)或直接使用HPAEC-PAD(参见下文)测量。Δ[αGlc1-P]＝[Fru1-P]+[Glc6-P]+[Fru6-P]+[磷酸](1)使用针对BSA参照的Roti-Quant测定法测量总蛋白质浓度(58)。磷酸酶动力学：水解反应在初始底物浓度为20mM下进行。使用的不同底物总结在表3中。通过加入酶(α-Glc1-P磷酸酶，0.1μM)开始反应，并在37℃和650rpm的热混合器搅拌速率下继续温育至多150分钟。以15分钟间隔取样，热处理(99℃，5分钟)，并在20,000g离心5分钟。测量磷酸盐的释放，并从磷酸盐浓度和时间之间的线性关系确定初始速率V(mMmin-1)。用方程2计算表观转换频率(kcat_app；s-1)，其中[E]是从蛋白质浓度确定的摩尔酶浓度，假设αGlc1-P磷酸酶的分子量为45kDa。kcat_app＝V/[E](2)表3.磷酸化的糖水解的表观转换频率。kcat_app的S.D.等于或小于报告值的10％，除了14％、18％和24％以外。n.d.，无活性高于试验检测限。实施例2:机制研究在αGlc1-P水解过程中的无机磷酸盐-水介质18O交换：所有反应混合物由H218O(97％)制备，得到90％的水溶剂的最终18O同位素纯度。磷酸酶反应是使用2.0mMαGlc1-P作为底物完成。使用标准的Mes和Hepes缓冲液。磷酸化酶反应是在50mMMes缓冲液(pH7.0)中使用1.0mMαGlc1-P完成。通过在37℃下向底物溶液中加入酶(0.1μM,蔗糖磷酸化酶:14μM)开始反应。在Eppendorf热混合器中以650rpm搅拌进行温育2小时。通过加热(99℃,5min)停止反应。以完全相同的方式使用正常H216O代替H218O进行对照反应。每个样品中αGlc1-P底物的转化率为90％或更高。通过GC-MS分析18O标记物掺入磷酸盐。将样品在SpeedVac中干燥3小时，并用BSTFA/1％TMCS在吡啶(1:2体积比)中衍生化。分析使用TraceDSQ单四级杆GC–MS仪器(ThermoScientific)进行。使用以下GC参数：注射体积，1μL；注射器温度，250℃；载体气体，He；载体气流，1mL/min；柱，HP-5MS(60m,ID0.250mm,膜厚度0.25μm)，来自Agilent(Waldbronn,德国)。温度梯度如下：起始温度,110℃，4min；以20℃/min的加热速率升温至300℃；最终保持时间，10分钟。MS在EI模式(源温度：280℃)下操作，检测质量范围为50-700m/z。使用Xcalibur1.4软件(ThermoScientific)对m/z299和m/z301的提取的离子色谱图进行积分。使用18O标记的α-Glc1-P水解的机制表征：在所提出的α-Glc1-P磷酸酶的催化反应中，底物的O1-P键被裂解，并且水(来自溶剂)在α-Glc1-P的总体水解转化的脱磷酸化步骤中攻击磷酸-酶中间体(图2)。与α-Glc1-P的未催化的和糖苷酶样催化的水解(其中C1-O键断裂并且水被引入异头的葡糖基碳)相反，预期磷酸酶反应导致向磷中添加水。因此，检测从同位素富集的水溶剂中掺入的18O标记可用于区分两种机制的可能性。在H218O(在最终反应混合物中90％18O含量)和正常水(对照)中进行2.0mMα-Glc1-P的酶转化。α-Glc1-P在各个反应中完全耗尽。GC-MS分析用于确定释放的磷酸盐的同位素组成。分析三(三甲基硅烷基)磷酸酯(TMS-磷酸酯)种类。在文献(62)中所述并在我们的实验中证实的电子电离条件下，由于损失一个甲基且主要离子为m/z299，形成了m/z314片段的TMS-磷酸酯分子离子。分析了完整的分析细节以及实验GC-MS色谱图。在正常水中的反应给出0.13的峰面积比，这与用IsoPro3.1计算的磷酸盐中的天然18O/16O同位素比率一致。在18O富集的溶剂中的反应产生比相应的对照更大的峰面积比(高达65倍的增加)，清楚地表明在这些条件下从溶剂到磷酸盐的18O标记物掺入。进行机制对照，其中蔗糖磷酸化酶与α-Glc1-P在H218O溶剂中温育。α-Glc1-P被磷酸化酶水解，没有检测到释放的磷酸盐标记，正如该催化机制所预期。因此，这些结果强烈支持α-Glc1-P磷酸酶对α-Glc1-P的酶水解通过经典的磷酸单酯水解酶机制进行，其中键的断裂和形成发生在磷处，如图2所示。实施例3:磷酰基转移研究磷酰基转移研究：反应如上文所述(磷酸酶动力学)进行，使用20mMα-Glc1-P作为供体底物。使用Fru(100,200,400or600mM)或Glc(200mM)作为受体底物。分析在某些时间取得的样品的磷酸盐、αGlc1-P和Glc6-P。当Fru是受体时，在每个样品中另外检测Fru1-P和Fru6-P。进行取样以允许确定初始速率，但也记录了完整的反应时间过程。使用方程式2从相应的V值获得底物消耗、磷酸盐释放和磷酰基转移的相关kcat_app值。数据的内部一致性总是通过质量平衡检查。pH依赖性磷酰基转移：包含各20mM的αGlc1-P和Fru的反应(0.1μM酶)，并从αGlc1-P的消耗或Fru1-P的形成的V来测定kcat_app。分析的pH范围是4.0-8.0。使用50mMMes缓冲液，除了在pH≤6.0时使用50mMMes和20mM乙酸钠，并且在pH8.0时使用50mMMes和50mMTes。缓冲液的pH值在37℃下调节，并在记录每个酶催化的反应之前和之后控制。取样和分析如上所述。对于通过非线性最小二乘法回归的数据分析，使用SigmaPlot2004版本9.0。方程式3描述了pH依赖性，其中活性(表示为对数的kcat_app)在低pH下恒定且降至pKa以上。C是在最佳质子化状态下kcat_app的pH非依赖性的值，K是质子解离常数，[H+]是质子浓度。log(kcat_app)＝log(C/(1+K/[H+]))(3)带有脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱(HPAEC-PAD)：在DionexBioLC系统(DionexCorporation，Sunnyvale，USA)上分析所选择的样品，其配备有CarboPacPA10柱(4×250mm)和在30℃恒温的AminoTrap保护柱(4×50mm)。Glc、Fru、αGlc1-P、Glc6-P、Fru1-P和Fru6-P用ED50A电化学检测器使用金工作电极和银/氯化银参比电极检测，应用碳水化合物的预定波形。按照以下方法以0.9mL/min的流速进行洗脱：等度流动的52mMNaOH20分钟，随后是100mMNaOAc至400mMNaOAc的线性梯度，在25分钟内应用100mMNaOH的等度背景。将柱子用52mMNaOH洗涤5分钟。在所用条件下，Glc在10.2min洗脱，Fru在11.8min洗脱，αGlc1-P在30.3min洗脱，Glc6-P在36.6min洗脱，Fru1-P在37.2min洗脱，且Fru6-P在39.1min洗脱。NMR光谱检测：为了制备样品，将20mMαGlc1-P和200mMFru用0.1μMαGlc1-P磷酸酶在37℃温育75分钟。反应通过加热(99℃,5min)终止。20,000g离心5分钟后，上清施加在DEAEFF柱(GEHealthcare,LittleChalfont,U.K.)上，用去离子水预平衡。用去离子水洗涤除去未结合的不带电的单糖类。用50mMNaCl完成磷酸化的反应产物的洗脱。将包含磷酸化产物的流份合并，经冷冻干燥浓缩，然后进行NMR分析。对于NMR分析，将分离的化合物溶于D2O(～5mg在0.7mL中)，并转移到5mm高精度NMR样品管中。使用Topspin1.3软件在400.13MHz(1H)的BrukerDRX-400上进行检测。通过获得64k数据点和傅里叶变换记录1D1HNMR光谱，得到范围为14ppm的光谱。为了测定2DCOSY、TOCSY和NOESY光谱，128个具有2048个数据点的实验每个都被记录并且经傅立叶变换为具有10ppm范围的2D光谱。检测温度为298K+/-0.05K，且外部丙酮用作位移参考标准(δH2.225)。分离的化合物：β-D-吡喃果糖1-磷酸酯-1HNMR(D2O):δ＝3,99(1H,m,H-6a),3.93(1H,m,H-3),3.84(1H,m,H-4*),3,82(1H,m,H-1b),3,81(1H,m,H-1a),3.77(1H,m,H-5*),3.65(1H,m,H-6b)；13CNMR(D2O):δ＝96.3(s,C-2),71.9(d,C-3),71.8(d,C-4*),70.5(d,C-5*),68.6(t,C-6),66.2(t,C-1)；31PNMR(D2O):δ＝5.5(RO-POH2-)；关于异头物形式和吡喃/呋喃形式的其它异构体以可忽略的浓度存在；[*]位移不是可明确指定的。分子对接研究：使用在YasaraV11.11.21中实施的AutoDock4.2用于酶-配体对接。使用AMBER03力场和由标准对接宏提供的默认参数，除了运行次数增加到50。在分子对接实验中使用αGlc1-P磷酸酶(His18→Ala突变体；pdb条目1nt4)的结构作为大分子，其使用各自作为二或单阴离子的αGlc1-P或αGlc6-P作为配体。使用Chimera(http://www.cgl.ucsf.edu/chimera)从SMILES串产生配体的3D坐标。用质子化或未质子化的Asp290进行对接。将配体柔性地置于酶活性位点中，所述活性位点通过施用的的搜索空间完全覆盖。对接姿势通过其相关的自由能和机械似然性来评估。PyMOL(http://www.pymol.org)用于可视化。在水解中αGlc1-P磷酸酶的磷酸供体底物利用：测试一系列磷酸化糖作为通过磷酸酶水解的底物。在20mM底物浓度下测定的表观转换频率(kcat_app)总结在表3中。与对αGlc1-P磷酸酶完全无活性的β-Glc1-P相比，该酶表现出对水解α-Glc1-P的高选择性。使用在伯羟基上具有磷酸酯基团的高活性的磷酸-糖(Glc6-P；Fru6-P；D-果糖1-磷酸盐,Fru1-P)，相应的kcat_app在转换α-Glc1-P的kcat_app的2倍范围内。还检测焦磷酸盐和植酸盐(肌醇六磷酸盐)作为酶底物，并在pH7.0和pH4.5(50mM乙酸钠)下进行反应。焦磷酸盐不被水解，这是有趣的，因为它是许多酸性磷酸酶的极好的底物(39、63)。α-Glc1-P磷酸酶对植酸盐具有弱的活性，但仅在4.5的低pH下，此时植酸盐不再与金属离子强烈络合(64)。不同糖底物的磷酸化：使用α-Glc6-P作为供体底物，由α-Glc1-P磷酸酶催化的不同受体的磷酸化在补充有20mMα-Glc6-P和200mM相应受体的50mMMespH7.0中进行。根据时间的产物形成示于图5中。酶促磷酸化：αGlc1-P磷酸酶催化从αGlc1-P到外部Glc受体的6-羟基的有效磷酰基转移。在αGlc1-P磷酸酶水解αGlc1-P(20mM)的时间-过程研究期间，在反应的后期(≥70％底物转化)中，释放的磷酸盐的摩尔浓度与消耗的α-Glc1-P不精确匹配(≥10％)。通过具有脉冲电流检测(HPAEC-PAD)的HP阴离子交换色谱分析反应混合物，显示存在新的磷酸化糖，其被发现与真正的Glc6-P标准物共洗脱。使用基于Glc6-P脱氢酶对Glc6-P的选择性NAD+依赖性氧化的酶测定，明确地证实反应样品中Glc6-P的存在。形成的Glc6-P的量正好是在与αGlc1-P转化的平衡中缺少的磷酸酯。在αGlc1-P转化过程中的Glc6-P的合成被认为是由酶促转磷酸化反应产生的，其中αGlc1-P是供体，在之前水解中形成的Glc是受体。从机制而言，底物的磷酰基将转移到酶的催化性His18，然后可以通过与水(水解)或Glc(磷酰基转移)反应发生αGlc1-P磷酸酶的去磷酸化。因为磷酸转移将在与水解的竞争中发生，所以Glc浓度对于有效利用αGlc1-P以合成Glc6-P是决定性的。因此，在反应开始时，使用作为外部磷酰基受体加入的200mMGlc重复αGlc1-P(20mM)的酶促转化。图6显示了与随着αGlc1-P磷酸酶催化的反应时程的αGlc1-P消耗相关的Glc6-P产量。还显示了游离磷酸盐的形成。使用α-Glc1-P磷酸酶，大量形成Glc6-P，占酶反应中裂解的几乎所有α-Glc1-P。与缺乏Glc的对照反应相比，磷酸盐释放速率在很大程度上被抑制(～10倍)。在这些条件下，磷酸盐形成的kcat_app仅为4s-1。图6中的数据还用于分别计算Glc6-P合成和α-Glc1-P消耗的34s-1和40s-1的kcat_app值。因此，在Glc存在和不存在下，总转化的表观转换频率是相似的。αGlc1-P到Glc6-P的转化形式上等同于磷酸葡萄糖变位酶反应，然而其涉及在O6和α-O1之间的相同葡萄糖分子内的磷酸单酯基团的位置重排(7)。磷酸葡萄糖变位酶反应的平衡强烈地倾向于Glc6-P(65)。酶促转磷酸化的Glc6-P的合成通过约10mMGlc6-P的动力学最佳值进行(图6)。在更长的反应时间，Glc6-P完全水解。通过酶促转磷酸化从Glc1-P合成Fru1-P：当向通过α-Glc1-P磷酸酶转化α-Glc1-P(20mM)的反应中加入Fru(200mM)时，有令人感兴趣的效果，与不存在Fru时进行的对照反应相比，α-Glc1-P消耗速率增加约3倍(kcat_app＝137s-1)，而磷酸盐释放速率同时降低约2倍(kcat_app＝18s-1)。因此，这提供了清楚的指示，磷酰基从αGlc1-P转移至除水以外的受体(可能为Fru)，构成了在所使用的条件下磷酰基供体底物利用的主要途径。使用HPAEC-PAD的分析，证实了新的糖磷酸酯产物的形成。在仅水解和磷酰基转移条件下的kcat_app的比较显示了α-Glc1-P磷酸酶在外部受体存在下以某种方式“活化”。在酶促转磷酸化的推荐方案中，其中水解的磷酸-酶中间体被受体截断，当酶去磷酸化是整个水解过程的缓慢步骤时，在Fru的存在下增强kcat_app是可能的，并且通过与Fru的反应加速。与该概念一致，显示kcat_app(α-Glc1-P)以Fru浓度(100-600mM；表4)的双曲线依赖性方式增加约5倍，在磷酰基受体的饱和浓度下接近计算的最大值254s-1(图7)。从数据确定Fru为209mM的表观KM。表4总结了在不同Fru受体浓度下酶促转磷酸化的综合动力学分析的结果。以表观一级速率常数表示，在受体存在下磷酸盐释放速率被强烈抑制到小于在600mMFru条件下α-Glc1-P消耗速率的十分之一。Glc6-P的形成以非常低的速率发生。不论使用的Fru浓度如何，Fru6-P的合成以大约为Fru1-P形成速率的四分之一发生。在图8A中，绘制了总转磷酸化速率(Fru1-P、Fru6-P、Glc6-P)和α-Glc1-P消耗速率的比率，并显示了其对Fru浓度的依赖性。该比率接近在高Fru下的值1，这与外部添加的(Fru)和原位形成的(Glc)受体与水有效竞争与磷酸-酶中间体反应的机制观点一致。与αGlc1-P磷酸酶相关的各种磷酸酶通过组氨酸酸性磷酸酶家族的共同成员性在酸性pH范围(≤5.0)(66,67)中表现出它们的最佳活性。因此通过α-Glc1-P磷酸酶在pH范围4.0-8.0中测定了kcat_app对于αGlc1-P消耗和Fru1-P合成的pH依赖性。活性在4.0-6.0的pH范围内是恒定的，在更高的pH下逐渐降低。在7.0的标准pH下的活性仍然是最佳pH下的活性的88％。有趣地是，αGlc1-P消耗和Fru1-P合成的pH速率曲线是相同的(图8B)，表明磷酸-酶中间体在与Fru反应和与水反应之间的分配不依赖于pH。表4.在不同Fru浓度下分析的αGlc1-P磷酸酶的转磷酸化的动力学分析。对于kcat_app的S.D.为≤报告值的10％，除了a11％、b16％和c20％以外。不适用，n.a.在200mMFru存在下α-Glc1-P的完整转化过程如图8C所示。根据α-Glc1-P完全耗尽时的磷酸盐浓度，测定转磷酸化产物的总浓度为16mM，对应于使用的供体底物的产率为80％。使用针对真实标准品的HPAEC-PAD分析，显示Fru1-P是主要产物(12mM)，Fru6-P(2.7mM)和Glc6-P(1.0mM)形成为副产物。然而，当大量浓度的Glc(≥10mM)已经积累时，Glc6-P主要出现在反应的后期。在反应期间，Fru1-P与Glc6-P的摩尔比从初始值20降低至在转化末期的约10(图7)。尽管Fru以约20倍摩尔过量存在，Glc的磷酸化发生，反映了αGlc1-P磷酸酶的受体底物选择性。尽管αGlc1-P磷酸酶对反应中合成的每个糖磷酸酯都具有显著的水解酶活性(表3)，但在实验的时间跨度中没有发生转磷酸化产物向二级水解的损失。与其他磷酸酶催化的转磷酸化反应(其中产物d动力学稳定性给生物催化转化(37、38)的合成应用带来问题)不同，糖磷酸酯从α-Glc1-P形成，就好像它们是真正的平衡产物(图8C)，从而使其便于生产。图8D显示在不同Fru浓度下从αGlc1-P转化获得的磷酸化产物的组成。通过产物混合物的1D和2DNMR分析进一步证实Fru1-P的身份。Fru1-P以四种不同的端基异构形式存在，其中β-D-吡喃果糖-1-磷酸酯具有最高的丰度(～80％)。对于该异头物，H-1a&b的质子信号在ABX中在3.82ppm和3.81ppm处作为分离的信号基团共振，与磷酸基团的3JH-P异核偶联。所有其它质子信号属于自旋系统，如在TOCSY光谱中所检测。6位亚甲基的质子信号存在于3.99和3.65ppm，均显示与H-5的3JH-H偶联，H-5在3.77ppm共振。H-5与H-4(3.84ppm)的进一步偶联以及H-4至H-3(3.95)的连续偶联在COZY光谱中也可见。H-6a和H-6b的信号之间的大位移差异指示端基异构形式。此外，酶促合成的Fru1-P的NMR数据与从商业Fru1-P记录的参考光谱精确一致。NMR数据与来自HPAEC-PAD分析和酶测定的证据结合，证实了Fru6-P和Glc6-P是Fru1-P后的转磷酸化产物。通过分子对接分析的αGlc1-P磷酸酶对αGlc1-P和Glc6-P的结合：具有催化的His18被Ala取代的α-Glc1-P磷酸酶的x射线晶体结构包含结合配体，报告为α-Glc1-P(45)。然而，由酶-配体复合物的原子坐标表示的磷酸糖显然是β-Glc1-P，而不是α-Glc1-P。实验的电子密度图未随蛋白质结构释放，因此不能用于澄清。进行对接研究，其中α-Glc1-P灵活地放置在酶的底物结合口袋(pdb条目1nt4)中。检查单或双带负电荷的α-Glc1-P的结合，分析假定的催化性酸-碱Asp290质子化或未质子化。在不同条件下接受的最佳配合对接姿势不取决于α-Glc1-P和Asp290的电荷状态。α-Glc1-P以拉长的构象被容纳，其中磷酰基相对于葡糖基部分位于反式。将底物的糖苷氧O1引入允许质子化的Asp290提供布朗斯台德催化辅助的对O1-P键的裂变并因此使Glc离去基团离去的位置。Asp290在β-Glc1-P的水解过程中可以采用类似的催化作用，即使催化酶和反应性底物基团之间的距离基本上大于α-Glc1-P对接姿势β-Glc1-P不是α-Glc1-P磷酸酶的底物(表3)，并且β-Glc1-P在蛋白质晶体结构中的结合模式实际上对于催化O1-P键断裂是非生产性的。来自对接分析的证据表明，α-Glc1-P磷酸酶的底物结合识别主要通过与磷酰基的许多强相互作用，而α-Glc1-P的葡糖基部分的结合相对较弱。对接实验导致多达6个相似的计算的自由能的对接姿势。不同的对接姿势具有类似地结合的磷酰基，但是特征在于葡糖基部分的比对中的变化。结合口袋的尺寸和拓扑学显示适合于在多个取向中容纳不同的糖结构，如与结合α-Glc1-P相比的结合Glc6-P所示，因此解释了该酶的较宽松的供体和受体底物特异性。与使用分子对接的水解反应选择性相比，检查转磷酸化是不实际的。αGlc1-P磷酸酶的分子和动力学性质是该酶的显著的转磷酸化活性的基础：αGlc1-P磷酸酶催化不同糖磷酸酯的水解，对离去基团(Glc、Fru)的结构以及糖部分上的磷酰基的位置(αGlc1-P、Glc6-P)具有宽松的特异性。然而，在Glc1-P的α和β-异头物的比较中，该酶强烈地抵抗β-Glc1-P的水解。对α-Glc1-P磷酸酶的x射线晶体结构进行的对接分析表明了酶的端基选择性的分子基础。它还提供了α-Glc1-P磷酸酶的宽泛的供体和受体底物特异性的解释。在αGlc1-P磷酸酶对αGlc1-P水解期间，来自H218O溶剂的18O标记掺入释放的磷酸盐中，支持了在磷处的亲核取代的酶促反应。根据组氨酸酸性磷酸酶的机制性建议(图2)，预期α-Glc1-P的整体转化在两步双转位样催化过程中分别通过共价的磷酸-组氨酸和磷酸-天冬氨酸酶中间体进行。磷酰基转移到糖受体发生于磷酸化的酶，可能是在Glc解离后发生，直接与水解竞争。因此，磷酸-酶中间体的有效截留防止其与水的反应将是合成上有用的受体底物的关键特征。磷酰基转移和水解的磷酸化酶的分配以使催化瓦解可通过受体底物浓度调节，如通过α-Glc1-P磷酸酶对Fru的磷酸化所示(图8A)。使用在200mMGlc存在下从α-Glc1-P转化的数据，可以应用用于形成Glc6-P和磷酸盐的实验kcat_app比率来计算αGlc1-P磷酸酶(kcat_app比率＝34/4.0＝8.5)。利用当前的生物信息学方法，不可能单独从磷酸酶蛋白结构推断转磷酸化的催化能力，因此需要专门的生物化学鉴定。转磷酸化的受体底物选择性和磷酸化位点选择性可通过将糖受体底物定位在磷酸-酶中间体上的结合口袋中来微调。αGlc1-P磷酸酶以两种不同的结合模式容纳Fru，其中优选的结合模式导致Fru1-P的形成，另一种导致Fru6-P的形成。αGlc1-P的转磷酸化的合成应用：Fru1-P是难以化学合成的高价值代谢物(68)。到Fru1-P的生物催化合成途径是醛缩酶(EC4.1.2.13)-催化的甘油醛和磷酸二羟丙酮之间的碳-碳偶联(69)，或通过己酮糖激酶(EC2.7.1.3)(62、63)从ATP对Fru的1-磷酸化。与ATP或磷酸二羟丙酮相比，从α-Glc1-P的转磷酸化提供了获得方便和廉价的磷酰基供体底物的有利替代。此外，α-Glc1-P磷酸酶在αGlc1-P和Fru之间的转磷酸化显示出良好的转换频率(≥100s-1；表4)。通过使用600mM的Fru，在有效防止底物水解(≤10％；参见图7)的意义上，利用αGlc1-P作为转磷酸化的供体底物几乎完全实现。基于转化的αGlc1-P，以70％产率(14mM)获得Fru1-P。剩余产物是Fru6-P(4mM)和Glc6-P(0.5mM)。在下一步优化用于合成Fru1-P的Fru的生物催化磷酸化的步骤中，增加初始αGlc1-P浓度是令人感兴趣的。已经开发了用于磷酸-糖的色谱分离的有效方法(70、71)，使得从含有Fru6-P和Glc6-P的产物混合物捕获Fru1-P是当然可能的。或者，使用主要是水解性的磷酸酶(72)选择性水解糖的6-磷酸酯可能是有用的。在某些磷酸酶中的磷酰基转移酶活性的早期发现(36)之后，最近的工作已经证明了生物催化转磷酸化反应在不同糖磷酸酯的制备中的合成有用性。大多使用来自A类非特异性酸性磷酸酶家族的细菌磷酸酶，并且弗氏志贺菌(37,73)、肠沙门菌(73)和摩氏摩根菌(74)是该酶的主要来源。Wever和同事的一篇关键论文显示使用来自弗氏志贺菌(S.flexneri)的酸性磷酸酶对来自焦磷酸供体底物的一系列己醛糖、戊醛糖和酮己糖受体的磷酸化(37)。使用各自为100mM的供体和受体，磷酸化产物的产率通常为15％或更低，除了以实质上更高的产率获得的Glc和5-硫代-D-葡萄糖的6-磷酸酯以外。有趣的是，Fru是志贺氏菌磷酸酶的相当差的受体底物(5％磷酸化产量)，表明α-Glc1-P磷酸酶和先前使用的转磷酸化催化剂的受体底物特异性中有用的互补性。此外，虽然在pH4.0使用非特异性酸性磷酸酶，但是也可以在中性pH范围内应用α-Glc1-P磷酸酶。使用己醛糖受体(例如Glc、D-甘露糖、D-半乳糖)，vanHerk等人(37)显示，从100mM焦磷酸盐获得的磷酸化产物的最大浓度强烈地取决于所用的受体浓度；并且由于在延长的反应时间下的二级水解的显著效应，其经历不同的动力学最佳值。Glc6-P是一个例外，并且其作为动力学稳定的转磷酸产物获得。在αGlc1-P磷酸酶催化的Fru磷酸化过程中没有遇到二级水解的问题。然而，Glc6-P被水解。最后，尽管焦磷酸盐通常被视为用于酶促转磷酸化的高度便利的磷酰基供体底物，但不能忽视地是，即使在没有水解的情况下，焦磷酸盐转化导致无机磷酸盐的释放，其能够抑制磷酸酶(40)。使用α-Glc1-P与专用的α-Glc1-P磷酸酶组合可能有助于使磷酸在磷酸酶催化的转磷酸化反应中抑制产物的作用最小化。来自大肠杆菌α-Glc1-P磷酸酶的酶是这类转化的强有力的生物催化剂。实施例4：使用磷酸化酶-磷酸酶生物催化剂的磷酸化如图9所示，通过磷酸化酶-磷酸酶生物催化剂同时和先后两步转化产生α-醛糖1-磷酸酯和酮糖1-磷酸酯产物，基于用于反应的磷酸盐，产率通常可优良地达到≥70％。来自蔗糖的葡萄糖基化在激活磷酸盐用于随后的磷酰基转移中是热力学有效的(～80％产率)。使用合适浓度的己糖/酮糖受体，磷酸酶催化的α-D-葡萄糖-1-磷酸酯水解被强烈抑制。由葡萄糖-1-磷酸酶磷酸化的受体底物如图10所示。测定每个受体的αGlc1-P消耗速率(rs)与磷酸盐释放速率(rp)之比。D-葡萄糖醛酸和D-半乳糖胺不被葡萄糖-1-磷酸酶所磷酸化。除了N-乙酰基D-葡萄糖胺(GlcNAc)38％、D-葡萄糖胺(D-GlcN)81％、D-木糖(D-Xyl)69％、L-阿拉伯糖(L-Ara)86％、D-木糖醇(D-Xol)89％和L-岩藻糖(L-Fuc)75％以外，在转化率>90％下测定产物产率。除了(*)D-葡糖胺(其中主要产物在C6-OH被磷酸化)，所有受体都在C1-OH位置被磷酸化。浅灰色柱表示rS/rP比例，而深灰色柱表示产物产率。反应含有20mMαGlc1-P和200mM受体。NMR数据表明，除了在6-OH被磷酸化的D-葡糖胺之外，醛糖给出α-构型的糖基-磷酸酯产物。L-山梨糖在1-OH处被磷酸化，D-果糖主要产生1-磷酸酯产物，虽然也合成了一些6-磷酸酯。糖醇可能在伯羟基被磷酸化，但是在这些实例中没有测定产物同一性。图11显示D-甘露糖1-P产率对受体与供体的比率的依赖性。在独立的反应设置中，D-葡萄糖1-磷酸酯浓度(50mM、160mM、400mM、500mM和1M)和葡萄糖-1-磷酸酶浓度(0.3μM、1.3μM、1.7μM和3.3μMμM)变化，而D-甘露糖(1M)浓度保持恒定。可以获得约200-400mM磷酸化产物(此处是α-Man1-P)的浓度。产率良好(≥50％)，并且不需要使用非常过量的受体底物。进行在同时反应模式下操作的一锅法两步级联反应和在顺序模式下操作的一锅法两步级联反应。对于以同时模式操作的一锅两步反应，在开始时同时加入底物(100mM蔗糖、100mM磷酸酯*、800mMD-甘露糖)和酶(1.3μMSPase、0.1μMαG1Pase)。在顺序模式中，在第一步中，将蔗糖和磷酸酯(各200mM)通过SPase(1.3μMSPase)催化转化为D-葡萄糖1-磷酸酯和D-果糖，并且在第二步中，αG1Pase(0.1μM)将D-葡萄糖1-磷酸酯和D-甘露糖(终浓度：800mM)转化为D-甘露糖1-磷酸酯和副产物。结果如图12所示。参考文献1.DzejaPP，TerzicA.2003.Phosphotransfernetworksandcellularenergetics.J.Exp.Biol.206：2039-2047.2.BergJM，TymoczkoJL，StryerL.2002.Biochemistry，5thed.WHFreeman，NewYork，USA.3.WünschiersR.2012.Carbohydratemetabolismandcitratecycle，p.37-58.InBiochemicalPathways：AnAtlasofBiochemistryandMolecularBiology，2nded.JohnWiley&Sons，Inc.，Hoboken，USA.4.KnowlesJR.1980.Enzyme-catalyzedphosphoryltransferreactions.Annu.Rev.Biochem.49：877-919.5.LassilaJK，ZalatanJG，HerschlagD.2011.Biologicalphosphoryl-transferreac-tions：understandingmechanismandcatalysis.Annu.Rev.Biochem.80：669-702.6.FreyPA，HedgemanAD.Phosphotransferandnucleotidyltransfer，p.476-546.InEnzymaticreactionmechanisms.OxfordUniversityPress，Oxford，UK.7.AllenKN，Dunaway-MarianoD.2004.Phosphorylgrouptransfer：evolutionofacatalyticscaffold.TrendsBiochem.Sci.29：495-503.8.GranotD，KellyG，SteinO，David-SchwartzR.2014.Substantialrolesofhexo-kinaseandfructokinaseintheeffectsofsugarsonplantphysiologyanddevelop-ment.J.Exp.Bot.65：809-819.9.AgiusL.2008.Glucokinaseandmolecularaspectsofliverglycogenmetabolism.Biochem.J.414：1-18.10.KawaiS，MukaiT，MoriS，MikamiB，MurataK.2005.Hypothesis：structures，evolution，andancestorofglucosekinasesinthehexokinasefamily.J.Biosci.Bioeng.99：320-330.11.WilsonJE.2003.lsozymesofmammalianhexokinase：structure，subcellularlocalizationandmetabolicfunction.J.Exp.Biol.206：2049-2057.12.KornbergHL.2001.RoutesforfructoseutilizationbyEscherichiacoli.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.3：355-359.13.Luley-GoedlC，NidetzkyB.2010.Carbohydratesynthesisbydisaccharidephosphorylases：reactions，catalyticmechanismsandapplicationintheglycosciences.Biotechnol.J.5：1324-1338.14.NakaiH，KitaokaM，SvenssonB，OhtsuboK.2013.Recentdevelopmentofphosphorylasespossessinglargepotentialforoligosaccharidesynthesis.Curr.Opin.Chem.Biol.17：301-309.15.WestheimerFH.1987.Whynaturechosephosphates.Science235：1173-1178.16.KamerlinSCL，SharmaPK，PrasadRB，WarshelA.2013.Whynaturereallychosephosphate.Q.Rev.Biophys.46：1-132.17.MorrowJR，AmyesTL，RichardJP.2008.Phosphatebindingenergyandcataly-sisbysmallandlargemolecules.Acc.Chem.Res.41：539-548.18.NaganoN，OrengoCA，ThorntonJM.2002.Onefoldwithmanyfunctions：theevolutionaryrelationshipsbetweenTIMbarrelfamiliesbasedontheirsequences，structuresandfunctions.J.Mol.Biol.321：741-765.19.KlimacekM，KrahulecS，SauerU，NidetzkyB.2010.Limitationsinxylose-fermentingSaccharomycescerevisiae，madeevidentthroughcomprehensiveme-taboliteprofilingandthermodynamicanalysis.Appl.Environ.Microbiol.76：7566-7574.20.ZhangG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法，其中所述一种或多种磷酸供体底物选自α-葡萄糖-1-磷酸酯、葡萄糖-6-磷酸酯、果糖-6-磷酸酯和果糖-1-磷酸酯。4.根据上述权利要求任一项的方法，其中步骤(ii)中提供的磷酸供体底物或磷酸供体底物之一是α-葡萄糖-1-磷酸酯。5.根据权利要求4的方法，其中步骤(ii)包括在磷酸酯或一种或多种磷酸酯源的存在下通过蔗糖磷酸化酶或具有蔗糖磷酸化活性的酶将蔗糖经酶促转化为D-果糖和α-D-葡萄糖-1-磷酸酯。6.根据权利要求5的方法，其中步骤(ii)和步骤(iv)以及任选的步骤(iii)是同时进行。7.生物催化剂在根据权利要求5或6的方法中的用途，所述生物催化剂具有蔗糖磷酸化酶活性和α-葡萄糖-1-磷酸酶活性和/或包含蔗糖磷酸化酶和α-葡萄糖-1-磷酸酶或由蔗糖磷酸化酶和α-葡萄糖-1-磷酸酶组成。8.根据权利要求1-6任一项的方法，其中步骤(iii)包括通过宿主细胞表达α-葡萄糖-1-磷酸酶或具有α-葡萄糖-1-磷酸酶活性的酶。9.根据权利要求8的方法，其中所述α-葡萄糖-1-磷酸酶或具有α-葡萄糖-1-磷酸酶活性的酶分别表达为重组融合蛋白，所述重组融合蛋白包含适合于分离所述α-葡萄糖-1-磷酸酶或具有α-葡萄糖-1-磷酸酶活性的酶的标记。当前第1页1 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