1.领域
本文的公开内容涉及免疫学领域，并且更具体地，涉及T淋巴细胞或其它免疫细胞的修饰。
2.背景
T淋巴细胞识别特异性抗原(包括肿瘤相关或肿瘤特异性抗原)并与之相互作用。由于T淋巴细胞能够杀灭肿瘤细胞，因此过去25年以来在用T淋巴细胞(无论是抗原特异性T淋巴细胞，还是经遗传修饰以表达一个或多个嵌合抗原受体(CAR；参见，例如，Eshhar，美国专利号7,741,465；Eshhar，美国专利申请公开号2012/0093842)的T淋巴细胞)靶向肿瘤细胞方面投入浓厚兴趣。然而，鉴于将CAR T细胞靶向身体必需区域的难度，需要寻找新的方法来增强CAR T细胞的归巢。
3.概述
本文提供了经遗传修饰的细胞，例如免疫细胞，诸如T淋巴细胞，例如人T淋巴细胞，其包含某种受体，该受体引起表达所述受体的细胞归巢至特定解剖区、特定组织或特定类型细胞，例如淋巴结的B细胞区、胃肠道或皮肤。在具体实施方案中，本文提供的经遗传修饰的细胞是T淋巴细胞，例如原代T淋巴细胞。在某些实施方案中，经遗传修饰的细胞表达嵌合抗原受体(CAR)。不希望受任何特定机制或理论的束缚，据信，当本文经遗传修饰的细胞表达某些受体(该受体引起表达所述受体的细胞归巢至特定区)时，它们更可能暴露于天然抗原，其中细胞(例如，表达CAR的细胞)能够被活化。
在第一个方面，本文提供包含(例如已被工程化以表达)归巢受体和CAR的细胞，例如T淋巴细胞，例如原代T淋巴细胞，或此类细胞群。在某些实施方案中，归巢受体通常不在T淋巴细胞中表达或内源性地在T淋巴细胞中表达。在某些实施方案中，归巢受体是B细胞区归巢受体。在具体实施方案中，B细胞区归巢受体是CXCR5。在更具体的实施方案中，包含归巢受体(例如B细胞区归巢受体)的细胞或细胞群，另外缺乏T细胞区归巢受体(例如CXCR7)的表达，或与正常T细胞相比具有降低的所述T细胞区归巢受体的表达，例如该细胞或细胞群被工程化以比正常T细胞更低的水平表达T细胞归巢受体。
在某些实施方案中，归巢受体是胃肠归巢受体。在具体实施方案中，胃肠归巢受体是整联蛋白α4β7(也称为淋巴细胞派伊尔结(Peyer patch)粘附分子)。在其它具体实施方案中，胃肠归巢受体是CCR9(C-C趋化因子受体类型9)。在某些实施方案中，细胞，例如T淋巴细胞，例如原代T淋巴细胞，或此类细胞群，包含(例如已被工程化以表达)一种以上(例如第二)胃肠归巢受体，例如，原代T淋巴细胞包含CCR9和整联蛋白α4β7。
在一个实施方案中，包含(例如已被工程化以表达)胃肠归巢受体的细胞，例如T淋巴细胞，或此类细胞群，在维生素A代谢物存在下已被活化、扩增，或既被活化又被扩增。在具体实施方案中，维生素A代谢物是视黄酸。
在某些实施方案中，归巢受体是皮肤归巢受体。在具体实施方案中，皮肤归巢受体是CLA(皮肤淋巴细胞相关抗原受体)。在其它具体实施方案中，皮肤归巢受体是CCR4、CCR8或CCR10。在某些实施方案中，细胞，例如T淋巴细胞，例如原代T淋巴细胞，或此类细胞群，包含(例如已被工程化以表达)第二皮肤归巢受体。在其它实施方案中，细胞，例如T淋巴细胞，例如原代T淋巴细胞，或此类细胞群，包含(例如表达)第三皮肤归巢受体。在其它实施方案中，细胞，例如T淋巴细胞，例如原代T淋巴细胞，或此类细胞群，包含(例如表达)第四皮肤归巢受体。在其它实施方案中，细胞或细胞群包含(例如表达)两种或更多种皮肤归巢受体，例如，CLA、CCR4、CCR8和/或CCR10中的两种或更多种。
在一个实施方案中，包含(例如表达)皮肤归巢受体的细胞，例如T淋巴细胞，例如原代T淋巴细胞，或此类细胞群，在维生素D代谢物存在下已被活化、扩增，或既被活化又被扩增。在具体实施方案中，维生素D代谢物是1,26-二羟胆钙化醇(1,25(OH)2D3)。在一些实施方案中，细胞，例如T淋巴细胞，例如原代T淋巴细胞，或此类细胞群，在IL-12存在下已被活化、扩增，或既被活化又被扩增。在具体实施方案中，细胞，例如T淋巴细胞，例如原代T淋巴细胞，或此类细胞群，在IL-12和维生素D代谢物二者存在下已被活化、扩增，或既被活化又被扩增。
在一些实施方案中，细胞，例如T淋巴细胞，例如原代T淋巴细胞，或此类细胞群，包含(例如已被工程化以表达)胃肠归巢受体或皮肤归巢受体，并且另外包含B细胞归巢受体。在具体实施方案中，B细胞归巢受体是CXCR5。
在另一个方面，本文提供产生表达归巢受体的细胞，例如T淋巴细胞，例如原代T淋巴细胞，或此类细胞群的方法。在某些实施方案中，本文提供产生归巢至淋巴结的B细胞区的细胞，例如T淋巴细胞，例如原代T淋巴细胞，或此类细胞群的方法，该方法包括使细胞或细胞群工程化来以足以引起该细胞或细胞群归巢至淋巴结的B细胞区的量或水平表达B细胞区归巢受体。在具体实施方案中，B细胞区归巢受体是CXCR5。
在某些实施方案中，本文提供产生归巢至胃肠道的细胞，例如T淋巴细胞，例如原代T淋巴细胞，或此类细胞群的方法，该方法包括使细胞或细胞群工程化来以足以引起细胞或细胞群归巢至胃肠道的量或水平表达胃肠归巢受体。在具体实施方案中，胃肠归巢受体是整联蛋白α4β7。在其它具体实施方案中，胃肠归巢受体是CCR9。在某些实施方案中，本文提供产生细胞，例如T淋巴细胞，例如原代T淋巴细胞，或此类细胞群的方法，该方法包括使细胞或细胞群工程化以表达另外的胃肠归巢受体，例如，另外表达第二胃肠归巢受体。在某些实施方案中，本文提供的方法另外包括其中在维生素A代谢物存在下细胞或细胞群被活化、扩增，或既被活化又被扩增的步骤。在具体实施方案中，维生素A代谢物是视黄酸。
在某些实施方案中，本文提供产生归巢至皮肤的细胞，例如T淋巴细胞，例如原代T淋巴细胞，或此类细胞群的方法，该方法包括使细胞或细胞群工程化来以足以引起细胞或细胞群归巢至皮肤的量或水平表达皮肤归巢受体。在具体实施方案中，皮肤归巢受体是CLA。在其它具体实施方案中，皮肤归巢受体是CCR4、CCR8或CCR10。在某些实施方案中，本文提供产生细胞，例如T淋巴细胞，例如原代T淋巴细胞，或此类细胞群的方法，该方法包括使细胞或细胞群工程化以表达另外的皮肤归巢受体，例如，另外表达第二皮肤归巢受体。在某些实施方案中，本文提供产生细胞，例如T淋巴细胞，例如原代T淋巴细胞，或此类细胞群的方法，该方法包括使细胞或细胞群工程化以另外表达第三皮肤归巢受体。在某些实施方案中，本文提供产生细胞，例如T淋巴细胞，例如原代T淋巴细胞，或此类细胞群的方法，该方法包括使细胞或细胞群工程化以另外表达第四皮肤归巢受体。在某些实施方案中，本文提供的方法另外包括其中在维生素D代谢物存在下细胞或细胞群被活化、扩增，或既被活化又被扩增的步骤。在具体实施方案中，维生素D代谢物是1,26-二羟胆钙化醇(1,25(OH)2D3)。在某些实施方案中，本文提供的方法另外包括其中在IL-12存在下细胞或细胞群被活化、扩增，或既被活化又被扩增的步骤。
在某些实施方案中，本文提供产生被工程化以表达胃肠归巢受体或皮肤归巢受体，并且另外被工程化以表达B细胞区归巢受体的细胞，例如T淋巴细胞，例如原代T淋巴细胞，或此类细胞群的方法。在具体实施方案中，本文提供产生被工程化以表达胃肠归巢受体或皮肤归巢受体，并且另外被工程化以表达CXCR5的细胞，例如T淋巴细胞，例如原代T淋巴细胞，或此类细胞群的方法。
在某些实施方案中，本文提供产生被工程化以表达胃肠归巢受体或皮肤归巢受体的细胞，例如T淋巴细胞，例如原代T淋巴细胞，或此类细胞群的方法，所述方法包括向T淋巴细胞施用编码嵌合抗原受体(CAR)的慢病毒载体的步骤。
在另一个方面，本文提供治疗个体的癌症或肿瘤的方法，该方法包括向需要其的个体施用T淋巴细胞或T淋巴细胞群，所述T淋巴细胞或T淋巴细胞群包含(i)B细胞区归巢受体；和(ii)CAR。在某些实施方案中，B细胞区归巢受体是CXCR5。
在某些实施方案中，本文提供治疗个体的胃肠癌症或肿瘤的方法，该方法包括向需要其的个体施用T淋巴细胞或T淋巴细胞群，所述T淋巴细胞或T淋巴细胞群包含(例如表达)(i)胃肠归巢受体；和(ii)CAR。在具体实施方案中，胃肠归巢受体是整联蛋白α4β7。在其它具体实施方案中，胃肠归巢受体是CCR9。在某些实施方案中，本文提供治疗个体的胃肠癌症或肿瘤的方法，该方法包括向需要其的个体施用T淋巴细胞或T淋巴细胞群，所述T淋巴细胞或T淋巴细胞群另外包含(例如表达)第二胃肠归巢受体。
在某些实施方案中，本文提供治疗个体的皮肤癌症或肿瘤的方法，该方法包括向需要其的个体施用T淋巴细胞或T淋巴细胞群，所述T淋巴细胞或T淋巴细胞群包含(i)皮肤归巢受体；和(ii)CAR。在具体实施方案中，皮肤归巢受体是CLA。在其它具体实施方案中，皮肤归巢受体是CCR4、CCR8或CCR10。在某些实施方案中，本文提供治疗个体的皮肤癌症或肿瘤的方法，该方法包括向需要其的个体施用T淋巴细胞或T淋巴细胞群，所述T淋巴细胞或T淋巴细胞群另外包含第二皮肤归巢受体。在某些实施方案中，本文提供治疗个体的皮肤癌症或肿瘤的方法，该方法包括向需要其的个体施用T淋巴细胞或T淋巴细胞群，所述T淋巴细胞或T淋巴细胞群另外包含第三皮肤归巢受体。在某些实施方案中，本文提供治疗个体的皮肤癌症或肿瘤的方法，该方法包括向需要其的个体施用T淋巴细胞或T淋巴细胞群，所述T淋巴细胞或T淋巴细胞群另外包含第四皮肤归巢受体。
在某些实施方案中，本文提供治疗个体的胃肠癌症或肿瘤的方法，该方法包括向需要其的个体施用T淋巴细胞或T淋巴细胞群，所述T淋巴细胞或T淋巴细胞群包含(i)胃肠归巢受体；和(ii)CAR，其中T淋巴细胞或T淋巴细胞群还包含B细胞区归巢受体。在具体实施方案中，B细胞区归巢受体是CXCR5。在某些实施方案中，本文提供的T淋巴细胞用于治疗胃肠癌症或肿瘤的方法。
在某些实施方案中，本文提供治疗个体的皮肤癌症或肿瘤的方法，该方法包括向需要其的个体施用T淋巴细胞或T淋巴细胞群，所述T淋巴细胞或T淋巴细胞群包含(i)皮肤归巢受体；和(ii)CAR，其中T淋巴细胞或T淋巴细胞群还包含B细胞区归巢受体。在具体实施方案中，B细胞区归巢受体是CXCR5。在某些实施方案中，本文提供的T淋巴细胞用于治疗皮肤癌症或肿瘤的方法。
在具体实施方案中，本文提供治疗个体的癌症或肿瘤的方法，该方法包括向需要其的个体施用T淋巴细胞或T淋巴细胞群，所述T淋巴细胞或T淋巴细胞群包含(i)归巢受体；和(ii)CAR，其中CAR的胞外结构域结合选自由以下组成的组的抗原：Her2、前列腺干细胞抗原(PSCA)、α-胎儿蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、钙网膜蛋白(calretinin)、MUC-1、上皮膜蛋白(EMA)、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、CD19、CD34、CD45、CD99、CD117、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巨囊性病液状蛋白(GCDFP-15)、HMB-45抗原、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、蛋白黑素-A(由T淋巴细胞识别的黑色素瘤抗原；MART-1)、myo-D1、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶、突触素(synaptophysis)、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子1、丙酮酸激酶同工酶M2型的二聚体形式(肿瘤M2-PK)、异常ras蛋白、异常p53蛋白、fuc-GM1、GM2(癌胚抗原免疫原性-1；OFA-I-1)；GD2(OFA-I-2)、GM3、GD3、α-辅肌动蛋白-4、Bage-1、BCR-ABL、Bcr-Abl融合蛋白、β-连环蛋白、CA 15-3(CA 27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、Casp-8、cdc27、cdk4、cdkn2a、coa-1、dek-can融合蛋白、EBNA、EF2、EB病毒抗原、ETV6-AML1融合蛋白、HLA-A2、HLA-A11、hsp70-2、KIAAO205、Mart2、Mum-1,2和3、neo-PAP、I类肌球蛋白、OS-9、pml-RARα融合蛋白、PTPRK、磷酸丙糖异构酶、Gage 3,4,5,6,7、GnTV、Herv-K-mel、Lage-1、NA-88、NY-Eso-1/Lage-2、SP17、SSX-2、TRP2-Int2、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、RAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15(58)、RAGE、、SCP-1、Hom/Mel-40、PRAME、HER-2/neu、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7、TSP-180、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、13-连环蛋白、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、CT7、端粒酶、43-9F、5T4、791Tgp72、13HCG、BCA225、BTAA、、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB\70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、CD19、CD22、CD27、CD30、CD70、EGFRvIII(表皮生长因子变体III)、精子蛋白17(Sp17)、间皮素、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、前列腺癌相关蛋白(prostein)、TARP(T细胞受体γ交替阅读框蛋白)、Trp-p8、STEAP1(前列腺六次跨膜上皮抗原1)、整联蛋白αvβ3(CD61)、泌乳激素和Ral-B。在具体实施方案中，本文提供治疗个体的胃肠癌症或肿瘤的方法，该方法包括向需要其的个体施用T淋巴细胞或T淋巴细胞群，所述T淋巴细胞或T淋巴细胞群包含(i)胃肠归巢受体；和(ii)CAR，其中CAR的胞外结构域结合与胃肠肿瘤或癌症有关(例如由其表达)的抗原。在具体实施方案中，与胃肠肿瘤或癌症有关(例如由其表达)的抗原是CEA、Her2、CA242、MUC1、CA125或CA19-9。在具体实施方案中，本文提供的T淋巴细胞用于治疗癌症或肿瘤的方法。
在其它具体实施方案中，本文提供治疗个体的皮肤癌症或肿瘤的方法，该方法包括向需要其的个体施用T淋巴细胞或T淋巴细胞群，所述T淋巴细胞或T淋巴细胞群包含(i)皮肤归巢受体；和(ii)CAR，其中CAR的胞外结构域结合与皮肤肿瘤或癌症有关的抗原。在具体实施方案中，与皮肤肿瘤或癌症有关(例如由其表达)的抗原是HMW-MAA、Her2、GD2、GD3、CEA或SPAG9。在其它具体实施方案中，本文提供的T淋巴细胞用于治疗皮肤癌症或肿瘤的方法。
4.发明详述
适应性免疫应答始于二级淋巴器官，包括淋巴结。B细胞和T细胞分别被隔离在淋巴结的称为“B细胞区”(位于淋巴结或滤泡的外皮层)和“T细胞区”(更广泛地分布在滤泡周围的区域(也称为副皮质))的不同区域。B细胞和T细胞表达允许它们归巢至这些各个区，使得它们可以暴露于抗原的受体。完整抗原存在于B细胞区，而在T细胞区，抗原是由抗原呈递细胞(例如树突细胞)呈递。完整抗原(例如肿瘤抗原)也存在于肿瘤位点。
本文提供经遗传修饰的细胞，例如免疫细胞，诸如T淋巴细胞，例如人T淋巴细胞，其包含某种受体，所述受体引起表达所述受体的细胞归巢至特定解剖区、特定组织或特定类型细胞，例如淋巴结的B细胞区、胃肠道或皮肤。在具体实施方案中，本文提供的遗传修饰的细胞是T淋巴细胞。在某些实施方案中，经遗传修饰的细胞表达嵌合抗原受体(CAR)，如章节4.4所述。在某些实施方案中，经遗传修饰的细胞表达CAR并内源性表达一个或多个归巢受体，例如引起表达该受体的细胞归巢至淋巴结的B细胞区、胃肠道或皮肤的受体。不希望受任何特定机制或理论的束缚，据信，当本文经遗传修饰的细胞表达某种受体(该受体引起表达所述受体的细胞归巢至特定区)时，它们更可能暴露于天然抗原，其中细胞(例如表达CAR的细胞)能够被活化。
4.1包含B细胞区归巢受体的细胞、其制备方法及用途
在一个实施方案中，本文提供包含(例如已被工程化以表达)引起细胞归巢至淋巴结的B细胞区(例如淋巴结的滤泡)的受体的经遗传修饰的细胞，例如免疫细胞，例如T淋巴细胞，例如人T淋巴细胞。此类受体在本文中被称为“B细胞区归巢受体”。在具体实施方案中，B细胞区归巢受体是CXCR5，例如人CXCR5。GenBankTM登录号NM_001716.4和NM_032966.2提供人CXCR5的示例性核苷酸序列。GenBankTM登录号NP_116743.1和NP_001707.1提供人CXCR5的示例性氨基酸序列。人归巢受体的示例性核苷酸和氨基酸序列可见于表1。在具体实施方案中，本文提供的经遗传修饰的细胞是T淋巴细胞。在某些实施方案中，经遗传修饰的细胞表达B细胞区归巢受体，并且还表达CAR，如章节4.4所述。在某些实施方案中，经遗传修饰的细胞表达CAR并内源性表达一种或多种B细胞区归巢受体。
本文还提供产生归巢至淋巴结的B细胞区(例如淋巴结的滤泡)的被基因工程化的T淋巴细胞的方法，该方法包括使T淋巴细胞工程化以表达B细胞区归巢受体(例如CXCR5)的步骤，其中所述B细胞区归巢受体以足以引起细胞归巢至淋巴结的B细胞区的水平或量由该细胞表达。在一些实施方案中，使T细胞工程化以表达B细胞区归巢受体的步骤包括将包含一个或多个受体核酸序列(即，编码一个或多个受体的一个或多个核酸序列)的一个或多个载体引入细胞的步骤。在具体实施方案中，载体包含人CXCR5的核酸序列。在某个实施方案中，使T淋巴细胞工程化以表达B细胞区归巢受体的步骤通过本领域技术人员已知的任何方法进行。
用于使T淋巴细胞工程化以表达B细胞区归巢受体的示例性核酸公开(例如)于章节4.5。
本文还提供治疗个体的癌症或肿瘤的方法，该方法包括向个体施用治疗有效量的经遗传修饰的细胞，例如人T淋巴细胞，所述细胞包含(i)引起表达某种受体的细胞归巢至淋巴结的B细胞区(例如淋巴结的滤泡)的所述受体，和(ii)CAR。在具体实施方案中，B细胞区归巢受体是CXCR5。在某些实施方案中，包含(i)引起表达某种受体的细胞归巢至淋巴结的B细胞区(例如淋巴结的滤泡)的所述受体，和(ii)CAR的经遗传修饰的细胞，例如人T淋巴细胞，抑制肿瘤细胞的增殖。在某些实施方案中，包含(i)引起表达某种受体的细胞归巢至淋巴结的B细胞区(例如淋巴结的滤泡)的所述受体，和(ii)CAR的经遗传修饰的细胞，例如人T淋巴细胞，抑制肿瘤的生长。在某些实施方案中，包含(i)引起表达某种受体的细胞归巢至淋巴结的B细胞区(例如淋巴结的滤泡)的所述受体，和(ii)CAR的经遗传修饰的细胞，例如人T淋巴细胞，杀灭肿瘤细胞。在具体实施方案中，CAR的胞外结构域结合选自由以下组成的组的抗原：Her2、前列腺干细胞抗原(PSCA)、α-胎儿蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、钙网膜蛋白、MUC-1、上皮膜蛋白(EMA)、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、CD19、CD34、CD45、CD99、CD117、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巨囊性病液状蛋白(GCDFP-15)、HMB-45抗原、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、蛋白黑素-A(由T淋巴细胞识别的黑色素瘤抗原；MART-1)、myo-D1、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶、突触素、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子1、丙酮酸激酶同工酶M2型的二聚体形式(肿瘤M2-PK)、异常ras蛋白、异常p53蛋白、fuc-GM1、GM2(癌胚抗原免疫原性-1；OFA-I-1)；GD2(OFA-I-2)、GM3、GD3、α-辅肌动蛋白-4、Bage-1、BCR-ABL、Bcr-Abl融合蛋白、β-连环蛋白、CA 15-3(CA 27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、Casp-8、cdc27、cdk4、cdkn2a、coa-1、dek-can融合蛋白、EBNA、EF2、EB病毒抗原、ETV6-AML1融合蛋白、HLA-A2、HLA-A11、hsp70-2、KIAAO205、Mart2、Mum-1,2和3、neo-PAP、I类肌球蛋白、OS-9、pml-RARα融合蛋白、PTPRK、磷酸丙糖异构酶、Gage 3,4,5,6,7、GnTV、Herv-K-mel、Lage-1、NA-88、NY-Eso-1/Lage-2、SP17、SSX-2、TRP2-Int2、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、RAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15(58)、RAGE、、SCP-1、Hom/Mel-40、PRAME、HER-2/neu、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7、TSP-180、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、13-连环蛋白、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、CT7、端粒酶、43-9F、5T4、791Tgp72、13HCG、BCA225、BTAA、、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB\70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、CD19、CD22、CD27、CD30、CD70、EGFRvIII(表皮生长因子变体III)、精子蛋白17(Sp17)、间皮素、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、前列腺癌相关蛋白、TARP(T细胞受体γ交替阅读框蛋白)、Trp-p8、STEAP1(前列腺六次跨膜上皮抗原1)、整联蛋白αvβ3(CD61)、泌乳激素和Ral-B。本文还提供了用于治疗癌症或肿瘤的方法中的经遗传修饰的细胞。
4.2.包含胃肠归巢受体的细胞、其制备方法及用途
在一个实施方案中，本文提供包含(例如已被工程化以表达)某种受体的经遗传修饰的细胞，例如免疫细胞，诸如T淋巴细胞，例如人T淋巴细胞，该受体引起表达所述受体的细胞归巢至胃肠道，例如胃肠器官、组织或细胞。此类引起细胞归巢至胃肠道的受体在本文中被称作“胃肠归巢受体”。在具体实施方案中，本文提供的经遗传修饰的细胞是T淋巴细胞。在某些实施方案中，胃肠归巢受体是CCR9或整联蛋白α4β7，例如，人CCR9或人整联蛋白α4β7。GenBankTM登录号NM_031200.2和NM001256369.1提供人CCR9的示例性核苷酸序列。GenBankTM登录号NP_112477.1和NP_001243298.1提供人CCR9的示例性氨基酸序列。GenBankTM登录号NM_000885.4和NM_000889.2分别提供人α4和人β7的示例性核苷酸序列。GenBankTM登录号NP_000876.3和NP_000880.1分别提供人α4和人β7的示例性氨基酸序列。人归巢受体的示例性核苷酸和氨基酸序列可见于表1。在某些实施方案中，遗传修饰的细胞还包括第二胃肠归巢受体。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞包含第一胃肠归巢受体，其中所述第一胃肠归巢受体是CCR9，并且还包含第二胃肠归巢受体，其中第二胃肠归巢受体是整联蛋白α4β7。在其它具体实施方案中，经遗传修饰的细胞包含胃肠归巢受体CXCR3。
在某些实施方案中，含有一种个或多种胃肠归巢受体的经遗传修饰的细胞在维生素A代谢物存在下被扩增、活化，或既被扩增又被活化。在具体实施方案中，扩增、活化，或扩增和活化二者在体内、体外或离体发生。在具体实施方案中，维生素A代谢物是视黄酸。在某些实施方案中，含有一种或多种胃肠归巢受体的经遗传修饰的细胞包含B细胞区归巢受体。在具体实施方案中，B细胞区归巢受体是CXCR5。在某些实施方案中，经遗传修饰的细胞表达胃肠归巢受体，并且还表达CAR，如章节4.4所述。在某些实施方案中，经遗传修饰的细胞表达CAR并内源性表达一种或多种胃肠归巢受体。
本文还提供产生包含一种或多种受体的经遗传修饰的细胞，例如人T淋巴细胞的方法，该一种或多种受体引起表达所述一种或多种受体的细胞归巢至胃肠道，例如胃肠器官、皮肤或组织。在某些实施方案中，包含一种或多种受体(例如CCR9或整联蛋白α4β7)的T淋巴细胞通过包括使T淋巴细胞工程化以表达一种或多种胃肠归巢受体的步骤的方法产生，该一种或多种受体引起表达所述一种或多种受体的细胞归巢至胃肠道。在一些实施方案中，使T淋巴细胞工程化以表达一种或多种胃肠归巢受体的步骤包括将包含编码所述受体的核酸序列的一个或多个载体引入细胞。在具体实施方案中，载体包含人CCR9的核酸序列、人整联蛋白α4β7的核酸序列，或两者兼而有之。
在某些实施方案中，归巢至胃肠道的T淋巴细胞通过以下方法产生，所述方法包括用诱导一种或多种胃肠归巢受体(例如，CCR9或α4β7)的表达的分子处理细胞的步骤。在具体实施方案中，分子是维生素A。
在某些实施方案中，用于产生包含一种或多种受体(该受体引起表达所述一种或多种受体的细胞归巢至胃肠道)的经遗传修饰的T淋巴细胞的方法包括使细胞扩增的步骤，该步骤在维生素A代谢物存在下进行。在某些实施方案中，用于产生包含一种或多种受体的归巢至胃肠道的经遗传修饰的T淋巴细胞的方法包括使细胞活化的步骤，该步骤在维生素A代谢物存在下进行。在某些实施方案中，扩增和活化步骤均在维生素A代谢物存在下进行。在某些实施方案中，维生素A代谢物是视黄酸。在某个实施方案中，使T细胞工程化以表达胃肠归巢受体的步骤通过本领域技术人员已知的任何方法进行。
用于使T淋巴细胞工程化以表达胃肠归巢受体的示例性核酸讨论(例如)于章节4.5。
本文还提供治疗个体的胃肠癌症或肿瘤的方法，该方法包括向个体施用治疗有效量的经遗传修饰的细胞，例如人T淋巴细胞，所述细胞包含(i)引起表达一种或多种受体的细胞归巢至胃肠道的所述一种或多种受体，和(ii)CAR。在某些实施方案中，胃肠归巢受体是CCR9或α4β7。在某些实施方案中，经遗传修饰的细胞还包含第二胃肠归巢受体。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞包含第一胃肠归巢受体，其中所述第一胃肠归巢受体是CCR9，并且还包含第二胃肠归巢受体，其中所述第二胃肠归巢受体是α4β7。在某些实施方案中，包含(i)引起表达一种或多种受体的细胞归巢至胃肠道的所述一种或多种受体，和(ii)CAR的经遗传修饰的细胞，例如人T淋巴细胞，抑制肿瘤细胞的增殖。在某些实施方案中，包含(i)引起表达一种或多种受体的细胞归巢至胃肠道的所述一种或多种受体，和(ii)CAR的经遗传修饰的细胞，例如人T淋巴细胞，抑制肿瘤生长。在某些实施方案中，包含(i)引起表达一种或多种受体的细胞归巢至胃肠道的所述一种或多种受体，和(ii)CAR的经遗传修饰的细胞，例如人T淋巴细胞，杀灭肿瘤细胞。在具体实施方案中，胃肠癌症或肿瘤是肝癌、胃癌、食道癌、胆囊癌、结肠直肠癌、肛门癌或胰腺癌。在某些实施方案中，CAR的胞外结构域结合与胃肠癌症或肿瘤相关的抗原。本文还提供用于治疗胃肠癌症或肿瘤的方法中的经遗传修饰的细胞。
4.3.包含皮肤归巢受体的细胞、其制备方法及用途
在一个实施方案中，本文提供包含某种受体的经遗传修饰的细胞，例如免疫细胞，诸如T淋巴细胞，例如人T淋巴细胞，该受体引起表达所述受体的细胞归巢至皮肤，例如，皮肤组织或皮肤细胞。在具体实施方案中，本文提供的经遗传修饰的细胞是T淋巴细胞。在某些实施方案中，皮肤归巢受体是CCR10、CCR8、CCR4或CLA，例如，人CCR10、人CCR8、人CCR4或人CLA。GenBankTM登录号NM_016602.2和AF215981.1提供人CCR10的示例性核苷酸序列。GenBankTM登录号NP_057686.2和P46092.3提供人CCR10的示例性氨基酸序列。GenBankTM登录号NM_005201.3和BC107159.1提供人CCR8的示例性核苷酸序列。GenBankTM登录号NP_005192.1和AAI07160.1提供人CCR8的示例性氨基酸序列。GenBankTM登录号NM_005508.4提供人CCR4的示例性核苷酸序列。GenBankTM登录号P51679.1提供人CCR4的示例性氨基酸序列。GenBankTM登录号NM_001206609.1和NM_003006.4提供人CLA的示例性核苷酸序列。GenBankTM登录号NP_001193538.1和NP_002997.2提供人CLA的示例性氨基酸序列。人归巢受体的示例性核苷酸和氨基酸序列可见于表1。在某些实施方案中，遗传修饰的细胞还包括第二皮肤归巢受体。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞包括第一皮肤归巢受体，其中第一皮肤归巢受体是CCR10，并且还包括第二皮肤归巢受体，其中第二皮肤归巢受体是CLA。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞包括第一皮肤归巢受体，其中第一皮肤归巢受体是CCR10，并且还包括第二皮肤归巢受体，其中第二皮肤归巢受体是CCR4。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞包括第一皮肤归巢受体，其中第一皮肤归巢受体是CCR4，并且还包括第二皮肤归巢受体，其中第二皮肤归巢受体是CLA。在某些实施方案中，遗传修饰的细胞还包括第三皮肤归巢受体。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞包括第一皮肤归巢受体，其中第一皮肤归巢受体是CCR10，还包括第二皮肤归巢受体，其中第二皮肤归巢受体是CCR4，并且还包括第三皮肤归巢受体，其中第三皮肤归巢受体是CLA。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞包含第一皮肤归巢受体，其中第一皮肤归巢受体是CCR8，并且还包含第二皮肤归巢受体，其中第二皮肤归巢受体是CLA、CCR4或CCR10。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞包含第一皮肤归巢受体，其中第一皮肤归巢受体是CCR8，还包含第二皮肤归巢受体，其中第二皮肤归巢受体是CLA、CCR4或CCR10，并且还包含第三皮肤归巢受体，其中第三皮肤归巢受体不同于第二皮肤归巢受体，并且选自由CLA、CCR4和CCR10组成的组。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞还包含第三皮肤归巢受体。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞包括第一皮肤归巢受体，其中第一皮肤归巢受体是CCR10，还包括第二皮肤归巢受体，其中第二皮肤归巢受体是CCR4，还包括第三皮肤归巢受体，其中第三皮肤归巢受体是CLA，并且还包括第四皮肤归巢受体，其中第四皮肤归巢受体是CCR8。在某些实施方案中，经遗传修饰的细胞包含一个或多个皮肤归巢受体。在其它具体实施方案中，经遗传修饰的细胞包含皮肤归巢受体CCR6。
在某些实施方案中，含有一种或多种皮肤归巢受体的经遗传修饰的细胞在维生素D代谢物存在下被扩增、活化，或既被扩增又被活化。在具体实施方案中，扩增、活化，或扩增和活化二者在体内、体外或离体发生。在具体实施方案中，维生素D代谢物是1,25-二羟胆钙化醇(1,25(OH)2D3)。在某些实施方案中，含有一种或多种皮肤归巢受体的经遗传修饰的细胞在IL-12存在下被扩增、活化，或既被扩增又被活化。在具体实施方案中，扩增、活化，或扩增和活化二者在体内、体外或离体发生。在更具体的实施方案中，含有一种或多种皮肤归巢受体的经遗传修饰的细胞在维生素D代谢物和IL-12存在下被扩增、活化，或既被扩增又被活化。在具体实施方案中，扩增、活化，或扩增和活化二者在体内、体外或离体发生。在某些实施方案中，含有一种或多种皮肤归巢受体的经遗传修饰的细胞另外包含B细胞区归巢受体。在具体实施方案中，B细胞区归巢受体是CXCR5。在某些实施方案中，经遗传修饰的细胞表达皮肤归巢受体，并且还表达CAR，如章节4.4所述。在某些实施方案中，经遗传修饰的细胞表达CAR，并内源性表达一种或多种皮肤归巢受体。
本文还提供产生包含一种或多种受体的归巢至皮肤(例如，皮肤组织或细胞)的经遗传修饰的细胞(例如人T淋巴细胞)的方法。在某些实施方案中，归巢至皮肤的T淋巴细胞由以下方法产生，所述方法包括使T淋巴细胞工程化以表达皮肤归巢受体(例如，CCR4、CCR8、CCR10或CLA)的步骤。在一些实施方案中，使T淋巴细胞工程化以表达皮肤归巢受体的步骤包括将一个或多个包含一个或多个受体核酸序列(即，编码一个或多个受体的一个或多个核酸序列)的载体引入细胞。在具体实施方案中，载体包含人CCR10的核酸序列、人CLA的核酸序列，或两者兼而有之。在具体实施方案中，载体包含人CCR4的核酸序列，和任选地人CLA的核酸序列。在具体实施方案中，载体包含人CCR4的核酸序列和人CCR10的核酸序列。在具体实施方案中，载体包含人CCR10的核酸序列、人CCR4的核酸序列和人CLA的核酸序列。在具体实施方案中，载体包含人CCR8的核酸序列。在具体实施方案中，载体包含人CCR8的核酸序列，和任选地人CLA的核酸序列。在具体实施方案中，载体包含人CCR8的核酸序列和人CCR10的核酸序列。在具体实施方案中，载体包含人CCR8的核酸序列、人CCR4的核酸序列和人CLA的核酸序列。在具体实施方案中，载体包含人CCR8的核酸序列、人CCR10的核酸序列和人CLA的核酸序列。在具体实施方案中，载体包含人CCR8的核酸序列、人CCR4的核酸序列和人CCR10的核酸序列。在具体实施方案中，载体包含人CCR8的核酸序列、人CCR4的核酸序列、CCR10的核酸和人CLA的核酸序列。
在某些实施方案中，归巢至皮肤的细胞(例如T淋巴细胞)通过以下方法产生，所述方法包括用诱导(例如增加)一种或多种皮肤归巢受体(例如，CCR4、CCR10、CCR8或CLA)的表达的分子处理细胞(例如T淋巴细胞)的步骤。在具体实施方案中，分子是维生素D。在某些实施方案中，皮肤归巢受体的表达的诱导通过用IL-12处理细胞(例如T淋巴细胞)来辅助，例如，以足够增加所述细胞的CCR4、CCR8、CCR10或CLA中一种或多种的表达的量使细胞与IL-12接触一段时间。
在某些实施方案中，用于产生包含一种或多种受体(该受体引起表达所述一种或多种受体的细胞归巢至皮肤)的经遗传修饰的T淋巴细胞的方法包括使细胞扩增的步骤，该步骤在维生素D代谢物和任选的IL-12存在下进行。在某些实施方案中，用于产生包含一种或多种受体(该受体引起表达所述一种或多种受体的细胞归巢至胃肠道)的经遗传修饰的T淋巴细胞的方法包括使细胞活化的步骤，该步骤在维生素D代谢物和任选的IL-12存在下进行。在某些实施方案中，扩增和活化步骤均在维生素D代谢物和任选的IL-12存在下进行。在某些实施方案中，维生素D代谢物是1,25(OH)2D3。在某个实施方案中，使T细胞工程化以表达皮肤归巢受体的步骤通过本领域技术人员已知的任何方法进行。
用于使T淋巴细胞工程化以表达皮肤归巢受体的示例性核酸讨论(例如)于章节4.5。
本文还提供治疗个体的皮肤癌症或肿瘤的方法，该方法包括向个体施用治疗有效量的经遗传修饰的细胞，例如人T淋巴细胞，所述细胞包含(i)引起表达一个或多个受体的细胞归巢至皮肤的所述一种或多种受体，和(ii)CAR。在某些实施方案中，皮肤归巢受体是CCR10、CCR8、CCR4或CLA。在某些实施方案中，经遗传修饰的细胞还包含第二皮肤归巢受体。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞包含第一皮肤归巢受体，其中第一皮肤归巢受体是CCR10，并且还包含第二皮肤归巢受体，其中第二皮肤归巢受体是CLA。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞包含第一皮肤归巢受体，其中第一皮肤归巢受体是CCR10，并且还包含第二皮肤归巢受体，其中第二皮肤归巢受体是CCR4。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞包含第一皮肤归巢受体，其中第一皮肤归巢受体是CCR10，并且还包含第二皮肤归巢受体，其中第二皮肤归巢受体是CCR8。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞包含第一皮肤归巢受体，其中第一皮肤归巢受体是CCR4，并且还包含第二皮肤归巢受体，其中第二皮肤归巢受体是CLA。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞包含第一皮肤归巢受体，其中第一皮肤归巢受体是CCR4，并且还包含第二皮肤归巢受体，其中第二皮肤归巢受体是CCR8。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞包含第一皮肤归巢受体，其中第一皮肤归巢受体是CLA，并且还包含第二皮肤归巢受体，其中第二皮肤归巢受体是CCR8。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞还包含第三皮肤归巢受体。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞包含第一皮肤归巢受体，其中第一皮肤归巢受体是CCR10，还包含第二皮肤归巢受体，其中第二皮肤归巢受体是CCR4，并且还包含第三皮肤归巢受体，其中第三皮肤归巢受体是CLA。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞包含第一皮肤归巢受体，其中第一皮肤归巢受体是CCR10，还包含第二皮肤归巢受体，其中第二皮肤归巢受体是CCR4，并且还包含第三皮肤归巢受体，其中第三皮肤归巢受体是CCR8。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞包含第一皮肤归巢受体，其中第一皮肤归巢受体是CCR8，还包含第二皮肤归巢受体，其中第二皮肤归巢受体是CCR4，并且还包含第三皮肤归巢受体，其中第三皮肤归巢受体是CLA。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞包含第一皮肤归巢受体，其中第一皮肤归巢受体是CCR10，还包含第二皮肤归巢受体，其中第二皮肤归巢受体是CCR8，并且还包含第三皮肤归巢受体，其中第三皮肤归巢受体是CLA。在某些实施方案中，经遗传修饰的细胞还包含第四皮肤归巢受体。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞包含第一皮肤归巢受体，其中第一皮肤归巢受体是CCR10，还包含第二皮肤归巢受体，其中第二皮肤归巢受体是CCR4，还包含第三皮肤归巢受体，其中第三皮肤归巢受体是CLA，并且还包含第四皮肤归巢受体，其中第四皮肤归巢受体是CCR8。在某些实施方案中，包含(i)引起表达一种或多种受体的细胞归巢至皮肤的所述一种或多种受体，和(ii)CAR的经遗传修饰的细胞(例如人T淋巴细胞)，抑制肿瘤细胞的增殖。在某些实施方案中，包含(i)引起表达一种或多种受体的细胞归巢至皮肤的所述一种或多种受体，和(ii)CAR的经遗传修饰的细胞(例如人T淋巴细胞)，抑制肿瘤的生长。在某些实施方案中，包含(i)引起表达一种或多种受体的细胞归巢至皮肤的所述一种或多种受体，和(ii)CAR的经遗传修饰的细胞(例如人T淋巴细胞)，杀灭肿瘤细胞。在具体实施方案中，皮肤癌症或肿瘤是黑色素瘤、鳞状细胞癌或基底细胞癌。在某些实施方案中，CAR的胞外结构域结合与皮肤癌症或肿瘤相关的抗原。本文还提供用于治疗皮肤癌症或肿瘤的方法中的经遗传修饰的细胞。
表1.人归巢受体的示例性核苷酸和氨基酸序列。
4.4.嵌合抗原受体
当本文提供的细胞是如上所述包含归巢受体的T淋巴细胞时，在某些实施方案中，此类T淋巴细胞可以包含嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR是将T淋巴细胞引导至抗原，并刺激T淋巴细胞杀死呈现抗原的细胞的人工膜结合蛋白。参见，例如，Eshhar，美国专利号7,741,465。CAR至少包含结合抗原(例如细胞上的抗原)的细胞外结构域、跨膜结构域和将初级活化信号传递至免疫细胞的胞内(细胞质)信号传导结构域。当CAR表达于(例如)T淋巴细胞(例如原代T淋巴细胞)的表面，并且CAR的细胞外结构域结合抗原的所有其它条件满足时，胞内信号传导结构域将信号传递至T淋巴细胞以活化和/或增殖并且(如果抗原存在于细胞表面)杀死表达抗原的细胞。由于T淋巴细胞需要两种信号，初级活化信号和共刺激信号，因此为了最大程度地活化，通常CAR还包含共刺激结构域，使得抗原与细胞外结构域的结合导致初级活化信号和共刺激信号二者的传递。
4.4.1.一般CAR结构胞内结构域
在某些实施方案中，CAR的胞内结构域是或包括在T淋巴细胞的表面上表达并触发所述T淋巴细胞的活化和/或增殖的蛋白质的胞内结构域或基序。此类结构域或基序能够传递响应于抗原结合到CAR的胞外部分的T淋巴细胞活化所必需的初级抗原结合信号。通常，此结构域或基序包括(或者是)ITAM(基于免疫受体酪氨酸的活化基序)。适用于CAR的含有ITAM的多肽包括(例如)ζCD3链(CD3ζ)或其含有ITAM的部分。在具体实施方案中，胞内结构域是CD3ζ胞内信号传导结构域。在其它具体实施方案中，胞内结构域来自淋巴细胞受体链、TCR/CD3复合物蛋白质、Fc受体亚基或IL-2受体亚基。
在某些实施方案中，CAR另外包含一个或多个共刺激结构域或基序，例如，作为多肽的胞内结构域的一部分。一个或多个共刺激结构域或基序可以是(或包括)共刺激CD27多肽序列、共刺激CD28多肽序列、共刺激OX40(CD134)多肽序列、共刺激4-1BB(CD137)多肽序列、或共刺激可诱导的T细胞共刺激(ICOS)多肽序列、或其它共刺激结构域或基序中的一个或多个。
跨膜区可以是可并入功能CAR的任何跨膜区，通常是来自CD4或CD8分子的跨膜区。
4.4.2.CAR胞外结构域
多肽的胞外结构域结合目标抗原。在本文描述的任何多肽的某些实施方案中，胞外结构域包括结合所述抗原的受体、或受体的一部分。胞外结构域可以是(例如)结合所述抗原的受体、或受体的一部分。在某些实施方案中，胞外结构域包括(或者是)抗体或其抗原结合部分。在具体实施方案中，胞外结构域包括(或者是)单链Fv结构域。单链Fv结构域可以包括(例如)通过柔性接头连接到VH的VL，其中所述VL和VH来自结合所述抗原的抗体。
多肽的胞外结构域所结合的抗原可以是任何目标抗原，例如，可以是肿瘤细胞上的抗原。肿瘤细胞可以是(例如)实体瘤的细胞或血液癌症的细胞。抗原可以是在任何肿瘤或癌症类型的细胞，例如淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、鼻咽癌、黑色素瘤(例如，恶性黑色素瘤)、皮肤癌、结肠直肠癌、硬纤维瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、内分泌肿瘤、尤因肉瘤(Ewing sarcoma)、外围原始神经外胚层瘤、生殖细胞实体肿瘤、肝母细胞瘤、神经母细胞瘤、非横纹肌软组织肉瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、维尔姆斯肿瘤(Wilms tumor)、成胶质细胞瘤、粘液瘤、纤维瘤、脂肪瘤等的细胞上表达的任何抗原。在更具体的实施方案中，所述淋巴瘤可以是慢性淋巴细胞性白血病(小淋巴细胞性淋巴瘤)、B细胞幼淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(macroglobulinemia)、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、结内边缘区B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、T淋巴细胞幼淋巴细胞性白血病、T淋巴细胞大颗粒淋巴细胞性白血病、侵袭性NK细胞白血病、成人T淋巴细胞白血病/淋巴瘤、结外NK/T淋巴细胞淋巴瘤、鼻型、肠病型T淋巴细胞淋巴瘤、肝脾型T淋巴细胞淋巴瘤、母细胞NK细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿病、塞扎里综合征(Sezary syndrome)、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、血管免疫母细胞T淋巴细胞淋巴瘤、外周T淋巴细胞淋巴瘤(未指定)、间变性大细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)或非霍奇金淋巴瘤。
在某些实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。在各种(但不限制)具体实施方案中，肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原是Her2、前列腺干细胞抗原(PSCA)、α-胎儿蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、钙网膜蛋白、MUC-1、上皮膜蛋白(EMA)、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、CD19、CD34、CD45、CD99、CD117、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巨囊性病液状蛋白(GCDFP-15)、HMB-45抗原、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、蛋白黑素-A(由T淋巴细胞识别的黑色素瘤抗原；MART-1)、myo-D1、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶、突触素、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、丙酮酸激酶同工酶M2型的二聚体形式(肿瘤M2-PK)、异常ras蛋白、或异常p53蛋白。
在某些实施方案中，TAA或TSA是癌症/睾丸(CT)抗原，例如，BAGE、CAGE、CTAGE、FATE、GAGE、HCA661、HOM-TES-85、MAGEA、MAGEB、MAGEC、NA88、NY-ESO-1、NY-SAR-35、OY-TES-1、SPANXB1、SPA17、SSX、SYCP1或TPTE。
在某些其它实施方案中，TAA或TSA是碳水化合物或神经节苷脂，例如fuc-GM1、GM2(癌胚抗原免疫原性-1；OFA-I-1)、GD2(OFA-I-2)、GM3、GD3等。
在某些其它实施方案中，TAA或TSA是α-辅肌动蛋白-4、Bage-1、BCR-ABL、Bcr-Abl融合蛋白、β-连环蛋白、CA 125、CA 15-3(CA27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、Casp-8、cdc27、cdk4、cdkn2a、CEA、coa-1、dek-can融合蛋白、EBNA、EF2、EB病毒抗原、ETV6-AML1融合蛋白、HLA-A2、HLA-A11、hsp70-2、KIAAO205、Mart2、Mum-1,2和3、neo-PAP、I类肌球蛋白、OS-9、pml-RARα融合蛋白、PTPRK、K-ras、N-ras、磷酸丙糖异构酶、Gage 3,4,5,6,7、GnTV、Herv-K-mel、Lage-1、NA-88、NY-Eso-1/Lage-2、SP17、SSX-2、TRP2-Int2、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、RAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15(58)、RAGE、、SCP-1、Hom/Mel-40、PRAME、p53、H-Ras、HER-2/neu、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、13-连环蛋白、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、CT7、端粒酶、43-9F、5T4、791Tgp72、13HCG、BCA225、BTAA、、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB\70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、CD19、CD22、CD27、CD30、CD70、GD2(神经节苷脂G2)、EGFRvIII(表皮生长因子变体III)、精子蛋白17(Sp17)、间皮素、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、前列腺癌相关蛋白、TARP(T细胞受体γ交替阅读框蛋白)、Trp-p8、STEAP1(前列腺六次跨膜上皮抗原1)、异常ras蛋白、或异常p53蛋白。在另一个具体的实施方案中，所述肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原是整合蛋白αvβ3(CD61)、泌乳激素，K-Ras(V-Ki-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因)或Ral-B。其它肿瘤相关和肿瘤特异性抗原是本领域技术人员已知的。
结合TSA和TAA的抗体和scFv是本领域已知的，编码它们的核苷酸序列也一样。
在某些具体的实施方案中，抗原是不被认为是TSA或TAA的抗原，但其仍然与肿瘤细胞或由肿瘤引起的损伤相关。在某些实施方案中，(例如)抗原是(例如)生长因子、细胞因子或白介素，例如与血管生成或血管发生相关的生长因子、细胞因子或白介素。此类生长因子、细胞因子或白介素可以包括(例如)血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)或白介素-8(IL-8)。肿瘤也可以创建肿瘤局部的缺氧环境。同样地，在其它具体实施方案中，抗原是缺氧相关因子，例如HIF-1α、HIF-1β、HIF-2α、HIF-2β、HIF-3α或HIF-3β。肿瘤也可能导致对正常组织的局部损伤，引起被称为损伤相关分子模式(damage associated molecular pattern)分子(DAMP；也称为警报素)的分子释放。因此，在某些其它具体实施方案中，抗原是DAMP，例如热休克蛋白、染色质相关蛋白质高迁移率族蛋白1(HMGB1)、S100A8(MRP8，钙粒蛋白A)、S100A9(MRP14，钙粒蛋白B)、血清淀粉样蛋白A(SAA)，或者可以是脱氧核糖核酸、三磷酸腺苷、尿酸或硫酸肝素。
在其中癌症是胃肠癌症(例如肝癌、胃癌、食道癌、胆囊癌、结肠直肠癌、肛门癌或胰腺癌)的具体实施方案中，抗原是胃肠癌特异性的或与胃肠癌相关的抗原。在具体实施方案中，本文提供的T淋巴细胞表达胃肠归巢受体，并且还表达具有结合与胃肠癌相关的抗原的胞外结构域的CAR。在具体实施方案中，CAR的胞外结构域结合CEA。在其它具体实施方案中，CAR的胞外结构域结合Her2、CA242、MUC1、CA125或CA19-9。
在其中癌症是皮肤癌(例如黑色素瘤、鳞状细胞癌或基底细胞癌)的具体实施方案中，抗原是皮肤癌特异性的或与皮肤癌相关的抗原。在具体实施方案中，本文提供的T淋巴细胞表达皮肤归巢受体，并且还表达具有结合与皮肤癌相关的抗原的胞外结构域的CAR。在具体实施方案中，CAR的胞外结构域结合HMW-MAA。在其它具体实施方案中，CAR的胞外结构域结合Her2、GD2、GD3、CEA或SPAG9。
在本文描述的多肽的某些实施方案中，胞外结构域通过接头、间隔子或铰链多肽序列(例如来自CD28的序列)连接到所述跨膜结构域。
4.5.分离的核酸
在一个实施方案中，本文提供编码本文提供的多肽(例如，嵌合受体和归巢受体)的多核苷酸序列。多核苷酸可以包含在适合于转化免疫细胞(例如T淋巴细胞)的任何多核苷酸载体中。例如，T淋巴细胞可以使用含有编码第一和第二多肽(例如，嵌合受体)的多核苷酸的合成载体、慢病毒或逆转录病毒载体、自主复制质粒、病毒(例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或疱疹病毒)等转化。适合于T淋巴细胞转化的慢病毒载体包括(但不限于)例如，在美国专利号5,994,136；6,165,782；6,428,953；7,083,981；和7,250,299中描述的慢病毒载体，所述美国专利的公开内容在此通过引用整体并入本文。适合于T淋巴细胞转化的HIV载体包括(但不限于)例如，在美国专利号5,665,577中描述的载体，所述美国专利的公开内容在此通过引用整体并入本文。
用于产生本文提供的多肽的核酸(例如在T淋巴胞内)包括DNA、RNA或核酸类似物。核酸类似物可以在碱基部分、糖部分或磷酸骨架处进行修饰，并且可以包括脱氧尿苷取代脱氧胸苷、5-甲基-2'-脱氧胞苷或5-溴-2'-脱氧胞苷取代脱氧胞苷。糖部分的修饰可包括核糖的2'羟基的修饰以形成2'-O-甲基或2'-O-烯丙基糖。脱氧核糖磷酸骨架可以被修饰以产生吗啉代核酸，其中每个碱基部分与六元吗啉代环或肽核酸连接，其中脱氧磷酸骨架被假肽骨架代替，并保留四个碱基。参见，例如，Summerton和Weller(1997)Antisense Nucleic Acid Drug Dev.7:187-195；和Hyrup等人(1996)Bioorgan.Med.Chain.4:5-23。另外，脱氧磷酸骨架可以替换为(例如)硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯骨架、亚磷酰胺或烷基磷酸三酯骨架。
编码本文提供的多肽的核酸可以作为载体(诸如例如，表达载体)的一部分被引入宿主细胞中。此外，本文提供的多肽可通过用编码此类多肽的核酸转染宿主细胞来产生，并且此类核酸可以是载体的一部分。在具体实施方案中，载体是能够指导编码本文提供的多肽的核酸的表达的表达载体。表达载体的非限制性实例包括(但不限于)质粒和病毒载体，如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、新城疫病毒、牛痘病毒和杆状病毒。标准分子生物学技术可以用于将编码本文提供的多肽的核酸引入表达载体中。
表达载体包含呈适合于在宿主细胞或非人受试者中表达核酸的形式的编码本文提供的多肽的核酸。在具体实施方案中，表达载体包含一个或多个基于用于表达的宿主细胞进行选择的可操作地连接到待表达的核酸的调控序列。在表达载体内，“可操作地连接”旨在意指目标核酸以允许核酸表达的方式(例如，在体外转录/翻译系统或当载体被引入宿主细胞时在宿主细胞中)连接到一个或多个调控序列。调控序列包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。调控序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核酸的组成型表达的那些序列，仅在某些宿主细胞中指导核酸表达的那些序列(例如，组织特异性调控序列)，以及在用特定试剂刺激后指导核酸表达的那些序列(例如，可诱导的调控序列)。将由本领域技术人员所理解的是，表达载体的设计可取决于诸如例如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等因素。
可通过常规转化或转染技术将表达载体引入宿主细胞。此类技术包括(但不限于)磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染和电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可见于Sambrook等人，1989，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press，New York，和其它实验室手册。在某些实施方案中，用含有编码本文提供的多肽的核酸的表达载体瞬时转染宿主细胞。在其它实施方案中，用含有编码本文提供的多肽的核酸的表达载体稳定转染宿主细胞。
4.6.细胞
可以使用归巢受体的细胞的非限制性实例包括(但不限于)天然杀伤(NK)细胞、树突细胞(DC)、胎盘干细胞(例如，在美国专利号7,468,276；8,057,788和8,202,703中公开的胎盘干细胞，所述美国专利的公开内容在此通过引用整体并入本文)，来自脐带血、胎盘血、外周血、骨髓、牙髓、脂肪组织、骨软骨组织等的间充质样干细胞；胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、神经嵴干细胞、神经干细胞和分化细胞(例如，成纤维细胞等)。归巢受体也可以用于肿瘤细胞系，例如用于动物模型实验目的。
在具体实施方案中，包含本文提供的多肽的细胞是T淋巴细胞。包含本文提供的多肽的T淋巴细胞可以是天然T淋巴细胞或MHC限制性T淋巴细胞。在某些实施方案中，T淋巴细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。在某些实施方案中，T淋巴细胞已从肿瘤活检分离，或已从由肿瘤活检分离的T淋巴细胞扩增。在某些其它实施方案中，T淋巴细胞已从外周血、脐带血或淋巴分离，或从由外周血、脐带血或淋巴扩增的T淋巴细胞扩增。
在某些实施方案中，在本方法中使用的免疫细胞(例如T淋巴细胞)对于施用T淋巴细胞的个体是自体型的。在某些实施方案中，T淋巴细胞对于施用T淋巴细胞的个体是同种异体型的。当同种异体T淋巴细胞用于制备T淋巴细胞时，优先选择将降低个体的移植物抗宿主病(GVHD)的可能性的T淋巴细胞。例如，在某些实施方案中，选择病毒特异性T淋巴细胞来制备T淋巴细胞；此类淋巴细胞将被预期具有结合任何受体抗原，从而被任何受体抗原活化的大大降低的天然能力。在某些实施方案中，受体介导的同种异体T淋巴细胞的排斥可以通过向宿主共同施用一种或多种免疫抑制剂(例如环孢霉素、他克莫司、西罗莫司、环磷酰胺等)而降低。
在一个实施方案中，T淋巴细胞从个体获得，然后任选地扩增，然后用编码一种或多种归巢受体的多核苷酸和任选地一个或多编码一种或多种CAR的多核苷酸转化，然后任选地扩增。在另一个实施方案中，T淋巴细胞从个体获得，然后任选地扩增，然后用编码一种或多种归巢受体的多核苷酸和任选地一个或多个编码一种或多种CAR的多核苷酸转化，然后任选地扩增。含有任何多核苷酸的细胞可以使用一个或多个可选择的标志物进行选择。
在某些实施方案中，任何本文提供的T淋巴细胞表达或包含天然TCR蛋白，例如能够形成天然TCR复合物的TCR-α和TCR-β。在某些其它实施方案中，将T淋巴细胞中编码TCR-α和TCR-β的天然基因的任一者或两者修饰为无功能的，例如部分或全部缺失，插入突变等。
在某些实施方案中，任何本文提供的T淋巴细胞从肿瘤病灶分离，例如，是肿瘤浸润性淋巴细胞；此类T淋巴细胞预期对TSA或TAA具有特异性。
T淋巴细胞，和包含含有CD3ζ信号传导结构域和CD28共刺激结构域的多肽的T淋巴细胞可以使用针对CD3和CD28的抗体(例如，附着于珠粒或附着于细胞培养板表面上的抗体)来扩增；参见，例如，美国专利号5,948,893；6,534,055；6,352,694；6,692,964；6,887,466；和6,905,681。
在某些实施方案中，抗原和/或抗体可以游离存在于培养T淋巴细胞的培养基中，或任一者或两者可附着于固体支持物，例如，组织培养塑料制品表面、珠粒等。
4.7.使用包含归巢受体的细胞的方法
在一个方面，如本文别处所述，本文提供的包含一种或多种归巢受体和任选的一种或多种CAR的细胞(例如T淋巴细胞)用于治疗具有一种或多种待由本文描述的细胞靶向所需的类型的细胞(例如，待杀灭的一种或多种类型的细胞)的个体。在某些实施方案中，待杀灭的细胞是癌细胞，例如肿瘤细胞。在具体实施方案中，癌细胞是实体瘤细胞。在具体实施方案中，细胞是淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、鼻咽癌、黑色素瘤(例如恶性黑色素瘤)、皮肤癌、结肠直肠癌、硬纤维瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、内分泌肿瘤、尤因肉瘤、外围原始神经外胚层瘤、生殖细胞实体肿瘤、肝母细胞瘤、神经母细胞瘤、非横纹肌软组织肉瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、维尔姆斯肿瘤、成胶质细胞瘤、粘液瘤、纤维瘤、脂肪瘤等的细胞。在更具体的实施方案中，所述淋巴瘤可以是慢性淋巴细胞性白血病(小淋巴细胞性淋巴瘤)、B细胞幼淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、结内边缘区B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、T淋巴细胞幼淋巴细胞性白血病、T淋巴细胞大颗粒淋巴细胞性白血病、侵袭性NK细胞白血病、成人T淋巴细胞白血病/淋巴瘤、结外NK/T淋巴细胞淋巴瘤、鼻型、肠病型T淋巴细胞淋巴瘤、肝脾型T淋巴细胞淋巴瘤、母细胞NK细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿病、塞扎里综合征、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、血管免疫母细胞T淋巴细胞淋巴瘤、外周T淋巴细胞淋巴瘤(未指定)、间变性大细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
在某些实施方案中，将经修饰的细胞(例如本文描述的经修饰的T淋巴细胞)施用于需要其的受试者，使得所选归巢受体的组合与已施用细胞(例如T淋巴细胞)的患者群体(或亚群)相容。例如，基于患者中存在的肿瘤或癌症类型来选择归巢受体的组合。
在具体实施方案中，将表达胃肠归巢受体的T淋巴细胞施用于患有胃肠肿瘤或癌症的患者。在某些实施方案中，胃肠肿瘤或癌症是食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、胰腺癌、结肠直肠癌或肛门癌。在具体实施方案中，所述T细胞还包含具有结合与胃肠肿瘤或癌症相关的抗原的胞外结构域的CAR。
在其它具体实施方案中，将表达皮肤归巢受体的T淋巴细胞施用于患有皮肤肿瘤或癌症的患者。在某些实施方案中，皮肤肿瘤或癌症是黑色素瘤、基底细胞癌或鳞状细胞癌。在具体实施方案中，所述T细胞还包含具有结合与皮肤肿瘤或癌症相关的抗原的胞外结构域的CAR。在具体实施方案中，包含归巢受体的T淋巴细胞还包含具有结合在患者的肿瘤或癌症细胞中表达的抗原的胞外结构域的CAR。
施用于患有由此类细胞(例如T淋巴细胞)可治疗的疾病或病症的个体(例如患有癌症的个体)后的细胞(例如T淋巴细胞)的功效可以通过一个或多个对特定疾病或病症有特异性、本领域普通技术人员已知、指示疾病或病症进展的标准来评估。通常，当一个或多个所述标准可检测地(例如显著地)从疾病状态值或范围移动到(或向)正常值或范围时，将细胞施用于此类个体是有效的。
在某些实施方案中，将细胞(例如T淋巴细胞)配制在药学上可接受的溶液中。在优选的实施方案中，药学上可接受的溶液适用于递送活细胞。在具体实施方案中，药学上可接受的溶液是(例如)盐溶液(如林格氏溶液)、明胶、碳水化合物(如乳糖、直链淀粉、淀粉等)、脂肪酸酯、羟甲基纤维素或聚乙烯基吡咯烷。在更具体的实施方案中，将药学上可接受的溶液在加入细胞之前灭菌。在其它更具体的实施方案中，药学上可接受的溶液可以与诸如润滑剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂和着色剂的助剂混合。适用于配制细胞的药物载体是本领域已知的，并且描述于例如WO 96/05309中。
在某些实施方案中，将细胞(例如T淋巴细胞)配制成单个剂量，其中所述单个剂量包括至少、至多、或约1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010或1×1011个T淋巴细胞。在某些实施方案中，将细胞(例如T淋巴细胞)配制成单个剂量，其中所述单个剂量包括1×104至5×104、5×104至1×105、1×105至5×105、5×105至1×106、1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010或5×1010至1×1011个T淋巴细胞的范围。在某些实施方案中，配制细胞用于静脉内、动脉内、肠胃外、肌内、皮下、鞘内或眼内施用，或在特定器官或组织内施用。
5.实施例
5.1.实施例1：鼠CXCR5+CAR T细胞的产生和体内研究
T淋巴细胞从B6 Thy 1.1小鼠的脾脏获得。产生包含嵌合抗原受体(CAR)的慢病毒构建体，所述嵌合抗原受体包含人源化小鼠抗人CEA-scFv或抗人HER2-scFv和小鼠共刺激胞内结构域和CD3ζ。CAR T细胞的验证是通过经由小鼠CXCL13趋化性试验的表型表征和功能评估完成。
对于体内测定，将鼠CXCR5+CAR T细胞的活性与CXCR5-CAR T细胞和未转导的T细胞的活性进行比较。将可自发形成CEA+胃肠肿瘤(或HER2+乳腺肿瘤)的人CEA(或HER2)-转基因小鼠用作受试者。通过静脉内施用一个或多个剂量来实现细胞的过继转移。
为了检查过继转移的CAR T细胞在引流淋巴结(对于CEA转基因小鼠为肠系膜淋巴结或对于HER2转基因小鼠为腋下淋巴结)中的位置，通过引流淋巴结免疫组织化学进行读取测定(readout assay)。处死动物并鉴别引流淋巴结。用弯钳夹取淋巴结并拉取去掉附着的组织。将淋巴结包埋在最佳切割温度化合物中并在干冰上冷冻，然后保存在-80℃。切割冷冻切片，空气干燥，并在丙酮中固定。切片与兔(或山羊)血清在室温下预孵育，随后与一抗(大鼠抗小鼠CD3、CD8、CD4，生物素化的小鼠抗小鼠Thy-1.1、生物素化的山羊-抗-人IgG(H+L))、和生物素化的兔(或山羊)抗大鼠IgG(小鼠吸附)、然后亲和素-过氧化物酶(或荧光染料)缀合物孵育。然后切片用过氧化物酶的底物孵育进行显色。免疫组织化学染色结果的图像是利用共聚焦显微术获得的。由抗小鼠Thy1.1鉴别供体T细胞并且用抗-人IgG鉴别CAR T细胞。
为了检查在引流淋巴结中抗原特异性免疫应答的建立，通过从引流淋巴结中分离的CAR T细胞的流式细胞术来完成读取测定。进行表面标志物Thy 1.1、抗人IgG、CXCR5、CD69和HLA-DR的表型表征。CD69是活化的T细胞的标志物。HLA-DR是抗原呈递细胞的标志物。完成功能评价以测定增殖、Ki67表达和CAR T细胞计数。刺激后通过胞内细胞因子染色来评价细胞因子产生。
为了检测CAR T细胞在肿瘤部位的肿瘤杀伤活性，测定肿瘤体积和存活。通过外部卡尺体内测定肿瘤的体积。测定最大纵向直径(长度)和最大横向直径(宽度)。基于卡尺测量的肿瘤体积由修改的椭圆形公式计算：肿瘤体积＝1/2(长度×宽度2)。
5.2.实施例2：人CXCR5+CAR T细胞的产生
T淋巴细胞从人PBMC获得。产生包含由人源化小鼠抗人CEA-scFv或抗人HER2-scFv和人共刺激胞内结构域和CD3ζ组成的嵌合抗原受体(CAR)的慢病毒构建体，并用于转导T细胞以创建CEA-特异性CAR T细胞群。CAR T细胞进一步用含有编码人CXCR5的核酸序列的慢病毒载体转导；选择表达CXCR5的CAR T细胞用于进一步研究。CAR T细胞的验证通过经由人CXCL13趋化性测定的表型表征和功能评估完成。
5.3.实施例3：鼠胃肠归巢CAR T细胞的产生和体内研究
T淋巴细胞从小鼠脾脏获得。CAR T细胞使用如上所述含有编码CAR的核苷酸序列的慢病毒构建体产生，所述CAR包含人源化小鼠抗人CEA-scFv和小鼠共刺激胞内结构域和CD3ζ。胃肠归巢受体经由鼠CCR9和α4β7核酸序列的慢病毒转导引入。在T细胞活化过程中进行视黄酸处理。CAR T细胞的验证通过经由小鼠TECK(胸腺表达趋化因子，或CCL25)趋化性测定的表型表征和功能评估完成(Binger,等，2009,Experimental Cell Research 315:1468-79)。使用96多孔形式趋化板中的5μm孔径的聚碳酸酯膜来评估对TECK的趋化反应。含有剥夺培养基(deprivation medium)中的TECK的下部孔通过膜与上部孔分离。将剥夺培养基中的T细胞接种到上部孔中，并在37℃孵育20小时。去除留在膜上方的未迁移细胞。迁移的细胞被固定、染色，并显微计数，或经由具有计数珠的流式细胞仪计数。阴性对照在不含趋化因子的剥夺培养基中进行，并且阳性对照在含有10％FBS的细胞培养介质中进行。
对于体内测定，可自发形成CEA+胃肠肿瘤的人CEA转基因小鼠被用作受试者。通过静脉内施用一个或多个剂量来实现细胞的过继转移。
为了检查过继转移的CAR T细胞在建立的胃肠道肿瘤中的位置，经由胃肠道免疫组织化学完成读取测定。处死动物，并去除胃肠道。将小肠切成4-5份，然后浸没固定。将切片与兔(或山羊)血清在室温下预孵育，随后与一抗(大鼠抗小鼠CD3、生物素化的小鼠抗小鼠Thy-1.1、生物素化的山羊-抗-人IgG(H+L))、和生物素化的大鼠(或山羊)抗大鼠IgG(小鼠吸附)、然后亲和素-过氧化物酶(或荧光染料)缀合物孵育。然后将切片与过氧化物酶的底物孵育进行显色。免疫组织化学染色结果的图像利用显微术获得。经由抗小鼠Thy1.1鉴别供体T细胞并且用抗-人IgG鉴别CAR T细胞。也进行胃肠道的qRT-PCR或PCR用于检测组织中的迁移的CAR T细胞。
为了检查抗原特异性免疫应答在胃肠道中的建立，经由从胃肠道分离的CAR T细胞的流式细胞术来完成读取测定。进行表面标志物Thy 1.1、抗人IgG、CCR9、α4β7、CD69和HLA-DR的表型表征。完成功能评价以测定增殖、Ki67表达和CAR T细胞计数。刺激后通过胞内细胞因子染色来评价细胞因子产生。
为了检测CAR T细胞在肿瘤部位的肿瘤杀伤活性，测定肿瘤体积和存活。
5.4.实施例4：人胃肠归巢CAR T细胞的产生
T淋巴细胞从人PBMC获得。使用包含人源化小鼠抗人CEA-scFv和小鼠共刺激胞内结构域和CD3ζ的CAR进行CAR T细胞的产生。CAR T细胞进一步用含有编码人CCR9和α4β7的核酸序列的慢病毒载体转导；选择表达这两种蛋白的CAR T细胞用于进一步的研究。在随后的T细胞活化过程中，使CAR T细胞与视黄酸接触，使得相比于表达这两种蛋白质但不与视黄酸接触的CAR T细胞，CCR9和α4β7的水平增加。CAR T细胞的验证通过经由人TECK趋化性测定的表型表征和功能评估来完成。
5.5.实施例5：小鼠皮肤归巢CAR T细胞的产生和体内研究
T淋巴细胞从小鼠脾脏获得。使用包含人源化小鼠抗人HMW-MAA-scFv和小鼠共刺激胞内结构域和CD3ζ的CAR进行CAR T细胞的产生。CAR T细胞进一步用含有编码人CCR10或CCR4和/或CLA的核酸序列的慢病毒载体转导；选择表达这两种蛋白的CAR T细胞用于进一步的研究。CAR T细胞的验证通过经由小鼠CCL27趋化性测定的表型表征和功能评估来完成。使用96多孔形式趋化板中的5μm孔径的聚碳酸酯膜来评估对CCL27的趋化反应。含有剥夺培养基中的CCL27的下部孔通过膜与上部孔分离。将剥夺培养基中的T细胞接种到上部孔中，并在37℃孵育20小时。去除留在膜上方的未迁移细胞。迁移的细胞被固定、染色，并显微计数，或经由使用计数珠粒的流式细胞术计数。阴性对照用不含趋化因子的剥夺培养基中进行，并且阳性对照用含有10％FBS的细胞培养基进行。
对于体内测定，使用用表达HMW-MAA的人黑色素瘤细胞系移植的免疫缺陷小鼠作为受试者。通过使用多剂量静脉内施用的过继转移来施用细胞。
为了检查过继转移的CAR T细胞在建立的黑色素瘤中的位置，经由免疫组织化学完成读取测定。经由抗CD3来鉴别供体T细胞并且用抗-小鼠IgG来鉴别CAR T细胞。也进行用于检测组织中迁移的CAR T细胞的qRT-PCR或PCR。
为了检查在黑色素瘤中的抗原特异性免疫应答建立，经由从黑色素瘤中分离的CAR T细胞的流式细胞术来完成读取测定。进行表面标志物CD3、抗小鼠IgG、CCR10(或CCR4)、CLA、CD69和HLA-DR的表型表征。完成功能评价以测定增殖、Ki67表达和CAR T细胞的计数。刺激后通过胞内细胞因子染色来评价细胞因子产生。
为了检查CAR T细胞在肿瘤部位的肿瘤杀伤活性，测定肿瘤体积和存活。
5.6.实施例6：人皮肤归巢CAR T细胞的产生
T淋巴细胞从人PBMC获得。使用由人源化小鼠抗人HMW-MAA-scFv和人共刺激胞内结构域和CD3ζ组成的CAR进行CAR T细胞产生。胃肠归巢受体经由人CCR10或CCR4和CLA核酸序列的慢病毒转导而引入。在T细胞活化过程中进行用1,25(OH)2VD3和IL-12的处理。CAR T细胞的验证通过经由人CCL27趋化性测定的表型表征和功能评估完成，如在实施例5中。
5.7.实施例7：胃肠肿瘤的治疗
个体呈现胃肠肿瘤，例如结肠腺瘤样息肉。来自个体的肿瘤细胞的测试确定肿瘤细胞表达CEA。T淋巴细胞从个体获得，用包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列的慢病毒载体转染，并用包含编码人CCR9和/或α4β7核酸序列的核苷酸序列的第二慢病毒载体转染。在视黄酸存在下，使用CD3+CD28包被的珠粒将T淋巴细胞扩增到足够用于施用的数量。嵌合受体包含结合CEA的胞外抗原结合区域；跨膜结构域；来自CD28的胞内共刺激结构域；和胞内CD3ζ结构域。在30分钟内通过静脉内输注向个体施用200mL盐溶液中的109和1010个之间的T淋巴细胞。重新评估个体的胃肠肿瘤阶段和到淋巴结的扩散，并在施用后30、60和90天进行活检的胃肠组织的组织学。
5.8.实施例8：黑色素瘤的治疗
个体呈现黑色素瘤。来自个体的肿瘤细胞的测试确定肿瘤细胞表达HMW-MAA。T淋巴细胞从个体获得，用包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列的慢病毒载体转染，并用包含编码人CCR10(或CCR4)和CLA核酸序列的核苷酸序列的第二慢病毒载体转染。在1,25(OH)2VD3和IL-12存在下，使用CD3+CD28包被的珠粒将T淋巴细胞扩增到足够用于施用的数量。嵌合受体包含结合HMW-MAA的胞外抗原结合区域；跨膜结构域；来自CD28的胞内共刺激结构域；和胞内CD3ζ结构域。在30分钟内通过静脉内输注向个体施用200mL盐溶液中的介于109和1010个之间的T淋巴细胞。重新评估个体的黑色素瘤阶段和到淋巴结的扩散，并在施用后30、60和90天进行活检的皮肤组织的组织学。
等效案
本公开并不限于本文所述的具体实施方案的范围内。事实上，根据以上描述，除了所描述的那些之外的对本文提供的主题的各种修改对本领域技术人员将是显而易见的。此类修改旨在落入所附权利要求的范围之内。
本文引用了各种出版物、专利和专利申请，其公开内容通过引用整体并入。
本发明的T淋巴细胞用于本文公开的方法中。