Gal2转运蛋白的变体及它们的用途的制作方法

本发明涉及多肽，所述多肽是包含在对应于m435位置处的至少一种氨基酸取代(atleastoneaminoacidsubstitution，至少一个氨基酸取代)和可选的另外的氨基酸取代的gal2变体。本发明进一步涉及编码多肽的核酸分子以及涉及含有所述核酸分子的宿主细胞。本发明进一步涉及用于生产生物乙醇和/或其它基于生物的化合物(bio-basedcompound)的方法，包括优选在所述宿主细胞中表达所述核酸分子。本发明还涉及多肽、核酸分子或宿主细胞用于生产生物乙醇和/或其它基于生物的化合物和/或用于含有戊糖、优选d-木糖和/或l-阿拉伯糖的生物材料的重组发酵的用途。
背景技术：
：由于其将糖发酵到乙醇和二氧化碳的特性，已经使用了啤酒、葡萄酒和面包酵母酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)几个世纪，用于生产面包、葡萄酒和啤酒。在生物技术中，除异源蛋白的生产之外，酿酒酵母(s.cerevisiae)特别用于乙醇生产(用于工业目的)。在众多行业分支中乙醇用作合成的初始底物(initialsubstrate)。由于石油日益稀缺、油价上涨和全球对汽油的需求不断增加，乙醇作为替代燃料越来越重要。此外，酿酒酵母还用于生产其它生物燃料或有价值的生化化合物如异丁醇、琥珀酸、法呢烯/法呢烷(farnesen/farnesan)或青蒿素。为了使有利的价格和高效的生物燃料生产成为可能，含有木质纤维素如例如稻草、来自木材工业和农业的废物以及日常生活垃圾的有机组分的生物质的使用，自身呈现为初始底物。首先，所述生物质是非常方便的并且其次是大量存在的。木质纤维素的三种主要组分是木质素、纤维素和半纤维素。半纤维素，其是在纤维素之后的第二最常发生的聚合物，是高度支化的杂聚物。它由戊糖(l-阿拉伯糖、d-木糖)、糖醛酸(4-o-甲基-d-葡糖醛酸、d-半乳糖醛酸)和己糖(d-甘露糖、d-半乳糖、l-鼠李糖、d-葡萄糖)组成。虽然半纤维素可以比纤维素更容易水解，但它含有戊糖l-阿拉伯糖和d-木糖，其通常不能由酵母酿酒酵母转化。为了能够将戊糖用于发酵，这些必须首先通过质膜进入细胞。虽然酿酒酵母不能代谢d-木糖或l-阿拉伯糖，但它可以将d-木糖或l-阿拉伯糖摄入细胞。然而，酿酒酵母不具有特异性转运蛋白(transporter)。借助于己糖转运蛋白来发生转运。然而，转运蛋白对d-木糖的亲和力是明显低于对d-葡萄糖的亲和力(kotter和ciriacy,1993)。在能够代谢d-木糖的酵母中，如例如毕赤酵母(p.stipitis)、休哈塔假丝酵母(c.shehatae)或嗜鞣管囊酵母(p.tannophilus)(dupreez等人,1986)，存在非特异性低亲和力转运蛋白，其转运d-葡萄糖，以及仅用于d-木糖的特异性高亲和力质子同向转运体(hahn-hagerdal等人,2001)。在早期的实验中，发现了一些酵母，如例如热带假丝酵母(candidatropicalis)、嗜鞣管囊酵母、毕赤酵母、休哈塔假丝酵母，其自然地使d-木糖或l-阿拉伯糖发酵或可以至少同化它。然而，这些酵母完全缺乏将l-阿拉伯糖和d-木糖发酵成乙醇的能力，或它们仅具有非常低的乙醇产率(dien等人,1996)。此外，关于d-木糖和l-阿拉伯糖的摄取，知道的很少。在酵母休哈塔假丝中，假设质子同向转运(lucas和uden,1986)。在酿酒酵母中，依据半乳糖通透酶gal2，已知它可以转运d-木糖，但还转运l-阿拉伯糖，其结构非常类似于d-半乳糖(kou等人,1970)。大多数己糖转运蛋白可以介导d-木糖的摄取。近些年来，特别是连同木糖的发酵一起，描述了在酿酒酵母的生物技术修饰的酵母菌株中戊糖的乙醇发酵，其中尤其是酵母菌株毕赤酵母的各种基因用于酿酒酵母的遗传修饰。在这里工程特别集中于将来自毕赤酵母(木糖-发酵酵母)的用于初始木糖同化的基因引入酿酒酵母，即引入传统上用于从己糖进行乙醇生产的酵母(jin等人2004)。jeppson等人(2006)描述了通过酿酒酵母的木糖发酵，其中借助于引入木糖代谢途径，其类似于在自然使用木糖的酵母毕赤酵母和休哈塔假丝酵母中的木糖代谢途径，或类似于细菌代谢途径。katahira等人(2006)描述了木质纤维素生物质如木屑的硫酸水解产物作为用于生产燃料生物乙醇的重要材料。在这项研究中，构建了重组酵母菌株，其能够使木糖和纤维寡糖发酵。为此，将各种基因整合至此酵母菌株中，并且也就是用于来自毕赤酵母的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶以及来自酿酒酵母的木酮糖激酶的细胞间表达，并且用于在细胞表面上来自棘孢曲霉(aspergillusacleatus)的β-葡糖苷酶的呈递。在木屑的硫酸水解产物的发酵中，在36小时之后，重组菌株充分发酵了木糖和纤维寡糖。pitkanen等人(2005)描述了获得和表征酿酒酵母菌株的木糖恒化器分离物(xylosechemostatisolate)，其过度表达编码木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的毕赤酵母的基因以及编码内源性木酮糖激酶的基因。分离物获得自需氧恒化器培养物，其中木糖作为单一或主要碳源。在需氧条件下并在具有30g/l木糖的基本培养基上，恒化器分离物的生长速率是原始菌株的生长速率的3倍高(与0.05h-1相比的0.15h-1)。木糖摄取率增加了几乎两倍。戊糖磷酸代谢途径的关键酶(转酮酶、转醛醇酶)的活性增加了两倍，同时相应降低了它们的底物(戊糖-5-磷酸酯、景天庚酮糖-7-磷酸酯)的浓度。brat等人(2009)筛选了用于编码假定木糖异构酶的序列并终于能够在酿酒酵母中克隆并成功表达来自厌氧菌梭状芽孢杆菌(clostridiumphytofermentans)的高活性新型的木糖异构酶的核酸数据库。这种酶的异源表达赋予酵母细胞代谢d-木糖并使用它作为唯一的碳源和能源的能力。demeke等人(2013)开发了表达盒(expressioncassette)，其含有13种基因，包括菌梭状芽孢杆菌xyla，编码d-木糖异构酶，和戊糖磷酸途径的酶，并且以两份将上述盒插入工业酿酒酵母菌株乙醇红的基因组。随后的ems诱变，在富含d-木糖的木质纤维素水解产物中的基因组混杂和选择，接着在含有d-木糖的复合培养基中的多轮进化工程，逐渐建立高效d-木糖发酵。becker和boles(2003)描述了酿酒酵母的实验室菌株的工程和选择，其能够将l-阿拉伯糖用于生长以及用于将它发酵成乙醇。这是可能的，这是因为细菌l-阿拉伯糖代谢途径的过度表达，由枯草芽孢杆菌araa(bacillussubtilisaraa)以及大肠杆菌arab和arad组成，以及在酵母菌株中转运l-阿拉伯糖的酵母半乳糖通透酶的同时过度表达。所选菌株的分子分析表明使用l-阿拉伯糖的预先确定的先决条件是l-核酮糖激酶的较低活性。然而，除其他外，报道了来自这种酵母菌株的非常缓慢的生长。wiedemann和boles(2008)表明表达来自地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)的l-阿拉伯糖异构酶以及来自大肠杆菌的l-核酮糖激酶和l-核酮糖-5-p4-差向异构酶的密码子优化的基因大大改善了l-阿拉伯糖转化率。farwick等人(2014)开发了用于筛查和工程不再受到葡萄糖的抑制的戊糖转运蛋白的新系统。此系统是基于d-木糖发酵酵母菌株，其具有所有己糖-转运蛋白和所有己糖-/葡糖激酶的缺失(hxt0hxk0菌株)。d-葡萄糖可能不再用作碳源，但在转运水平上干扰d-木糖利用。因此，可以容易地选择这样的突变转运蛋白，在增加浓度的d-葡萄糖的存在下，其允许d-木糖摄取。利用在进化工程和诱变方法中的此系统，作者能够从酿酒酵母己糖转运蛋白产生特异性d-木糖转运蛋白。这些突变转运蛋白的一些在对应于半乳糖转运蛋白gal2的n376的位置处具有交换。然而，虽然它们证明耐葡萄糖，但它们大多数具有降低的对于木糖的摄取率。wo2008/080505al公开了来自毕赤酵母的阿拉伯糖转运蛋白，其使得酵母细胞能够摄入l-阿拉伯糖。ep11001841.3公开了用于构建戊糖-发酵酵母的植物拟南芥(arabidopsisthaliana)的特异性阿拉伯糖转运蛋白。wo2012/049170a2和wo2012/049173al公开了戊糖和葡萄糖发酵酵母细胞，其含有和表达(除了核酸之外)具有阿拉伯糖通透酶活性的多肽，其包含在gal2的t219至天冬酰胺或n376至丝氨酸的位置处的突变，其使得转运蛋白能够耐葡萄糖的抑制效应。在本领域中仍需要特异性戊糖转运蛋白，尤其是特异性d-木糖转运蛋白，其对于戊糖具有较高亲和力和/或较高活性，尤其是结合有葡萄糖抗性，其允许将d-木糖和/或l-阿拉伯糖特异性地摄入细胞，如酵母细胞，即使在低戊糖浓度下也具有高摄取率，因而促进戊糖的利用和发酵，尤其是d-木糖和/或l-阿拉伯糖，并且尤其是在葡萄糖的同时存在下。因此，本发明的目的是提供改善的和/或更加特异性的转运蛋白，其利用较高活性和/或较高亲和力转运戊糖，如d-木糖和/或l-阿拉伯糖。技术实现要素：根据本发明，此目标通过多肽来解决，所述多肽包含在对应于seqidno:1的氨基酸序列的m435位置处的至少一种氨基酸取代，其中多肽与seqidno:1的氨基酸序列具有至少60％、或优选至少70％或80％或90％或95％的序列同一性(sequenceidentity)，并且其中多肽具有体外和/或体内戊糖转运功能。根据本发明，此目标通过编码本发明的多肽的核酸分子来解决。根据本发明，此目标通过宿主细胞来解决，所述宿主细胞含有本发明的核酸分子并且优选表达所述核酸分子，其中所述宿主细胞优选是真菌细胞并且更优选酵母细胞，如酵母属(saccharomycesspecies)、克鲁维酵母属(kluyveromycessp.)、汉逊酵母属(hansenulasp.)、毕赤酵母属(pichiasp.)或耶氏酵母属(yarrowiasp.)。根据本发明，此目标通过用于生产生物乙醇和/或其它基于生物的化合物的方法来解决，所述方法包括优选地在根据本发明的宿主细胞中表达根据本发明的核酸分子。根据本发明，此目标通过下述来解决：利用根据本发明的多肽、根据本发明的核酸分子、或根据本发明的宿主细胞用于生产生物乙醇和/或其它基于生物的化合物，和/或用于重组发酵含有戊糖、优选d-木糖和/或l-阿拉伯糖的生物材料。具体实施方式在下面更详细地描述本发明之前，应该明白的是，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以改变。还应该明白的是，本文所用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而不是为了限制本发明的范围，其将仅由所附权利要求来限定。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。出于本发明的目的，本文引用的所有参考文献通过引证以其整体并入本文。gal2变体如上所述，本发明提供了gal2变体。尤其是，本发明提供了多肽，其包含在对应于seqidno:1的氨基酸序列的m435位置处的至少一种氨基酸取代。本发明的多肽与seqidno:1的氨基酸序列具有至少60％、或优选至少70％或80％或90％或95％的序列同一性，并且具有体外和/或体内戊糖转运功能。优选地，本发明的多肽是酿酒酵母的gal2。seqidno:1是野生型蛋白或cen.pk2-1c和cen.pk113-7d的gal2的氨基酸序列。cen.pk2-1c的gal2是574个氨基酸的蛋白质。http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/fungi/getseq.pl？seq＝ylr081w_cen.pk113-7d根据本发明的多肽，优选gal2变体，包含在对应于seqidno:1的氨基酸序列或与seqidno:1的氨基酸序列至少60％相同、优选至少70％相同、更优选至少80％相同、甚至更优选至少90％相同、还更优选95％相同、以及还更优选99％相同的氨基酸序列的m435位置处的至少一种氨基酸取代。如在本文中所使用的，术语“在对应于…的位置处”是指在seqidno:1中的相应位置，然而，在相关多肽链中，其可以具有另一个相对位置编号。可以通过在为了比较的目的可以被对齐的两个序列中比较位置来确定等同替换。由于相关多肽的不同长度，或在相关多肽中氨基酸的缺失或添加，氨基酸的相对位置可以改变。根据本发明的多肽，优选gal2变体，具有体外和/或体内戊糖转运功能，尤其是体外和/或体内d-木糖和/或l-阿拉伯糖转运功能。优选地，戊糖是d-木糖和/或l-阿拉伯糖。如在本文中所使用的，如果没有另外指出，术语“木糖”是指与d-木糖相同，“阿拉伯糖”是指与l-阿拉伯糖相同，以及“葡萄糖”是指与d-葡萄糖相同。如在本文中所使用的，术语“百分比(％)相同的”是指在两个氨基酸序列之间的序列同一性。可以通过在为了比较的目的可以被对齐的两个序列中比较位置来确定同一性。当在比较序列中的等同位置由相同氨基酸占据时，则认为分子在上述位置处是相同的。如在本文中所使用的，术语“功能等效”是指这样的氨基酸序列，其与seqidno.1的氨基酸序列不是100％相同并且包含氨基酸添加和/或插入和/或缺失和/或取代和/或交换，与具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质相比，其并不更改或改变蛋白质的活性或功能，即“功能等效”，例如，包含具有保守氨基酸取代或较小缺失和/或插入的氨基酸序列，只要这些修饰不显著影响体外和/或体内l-阿拉伯糖转运功能。通常，本领域技术人员知道以下事实：在蛋白质的氨基酸序列中的一些氨基酸交换并不影响上述蛋白质的(二级或三级)结构、功能和/或活性。与本文所公开的氨基酸序列相比，具有这样的“中性”氨基酸交换的氨基酸序列落入本发明的范围。在优选实施方式中，根据本发明的包含在对应于seqidno.1的m435位置处的至少一种氨基酸取代的多肽，优选gal2变体，包含氨基酸取代m435i。优选地，在对应于m435位置处的氨基酸取代与没有这种氨基酸取代的多肽相比，增加体外和/或体内戊糖转运功能的活性。优选地，在对应于m435位置处的氨基酸取代与没有这种氨基酸取代的多肽相比，增加多肽对于戊糖的亲和力。-另外的氨基酸取代在一种实施方式中，根据本发明的多肽，优选gal2变体，包含另外的氨基酸取代：优选地，在对应于seqidno:1的氨基酸序列的n376的位置处的氨基酸取代。所述另外的氨基酸取代优选选自n376y或n376f。本发明优选提供了以下多肽/gal2变体：-m435i-m435i/n376y-m435i/n376f-m435i/t354a-m435i/v71i-m435i/t354a/v71i-m435i/t354a/n376y-m435i/t354a/n376f-m435i/t354a/n376y/v71i-m435i/t354a/n376f/v71i核酸分子如上所述，本发明提供了核酸分子，其编码根据本发明的多肽。在一种实施方式中，本发明的核酸分子进一步包含：-载体核酸序列，优选表达载体序列，和/或-启动子核酸序列和终止子核酸序列(terminatornucleicacidsequence)，和/或-包含其它调控核酸序列。在一种实施方式中，本发明的核酸分子包含dsdna、ssdna、pna、cna、rna或mrna或它们的组合。根据本发明的核酸分子优选包含这样的核酸序列，其(除根据本发明的氨基酸取代的添加之外)与天然存在的核酸序列相同或是密码子优化的，以用于宿主细胞。根据本发明所使用的核酸分子优选是核酸表达构建体(nucleicacidexpressionconstruct)。根据本发明的核酸表达构建体例如是包含根据本发明的核酸分子的表达盒、或包含根据本发明的核酸分子或表达盒的表达载体。核酸表达构建体优选包含调控序列，如启动子和终止子序列，其可操作地与编码本发明的多肽的核酸序列连接。核酸表达构建体可以进一步包含5’和/或3’识别序列和/或选择标记。宿主细胞如上所述，本发明提供了含有根据本发明的核酸分子的宿主细胞。优选地，本发明的宿主细胞表达所述核酸分子。优选地，根据本发明的宿主细胞是真菌细胞并且更优选酵母细胞。酵母细胞优选是选自由酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属或耶氏酵母属组成的组的属的成员。酵母细胞更优选是选自以下组的物种的成员：酿酒酵母、s.bulderi、s.barnetti、少孢酵母(s.exiguus)、葡萄汁酵母(s.uvarum)、糖化酵母(s.diastaticus)、乳酸克鲁维酵母(k.lactis)、马克斯克鲁维酵母(k.marxianus)、脆壁克鲁维酵母(k.fragilis)、多形汉逊酵母(h.polymorpha)、巴斯德毕赤酵母(p.pastoris)和解脂耶氏酵母(y.lipolytica)，如酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母或解脂耶氏酵母。在优选实施方式中，宿主细胞属于物种酿酒酵母。当编码本发明的多肽(优选gal2变体)的核酸分子/序列被表达在宿主细胞(优选酵母细胞)中时，宿主细胞被赋予摄入d-木糖和/或l-阿拉伯糖的能力，其然后可以被进一步代谢。通过此，细胞能够基于d-木糖和/或l-阿拉伯糖作为碳源进行生长。优选地，与不含有根据本发明的核酸分子的细胞相比，对于d-木糖和/或l-阿拉伯糖，宿主细胞(优选酵母细胞)具有增加的摄取率。在优选实施方式中，本发明的宿主细胞(优选酵母细胞)进一步含有-编码木糖代谢途径的蛋白质(优选木糖异构酶和木酮糖激酶)的核酸分子，和/或-编码阿拉伯糖代谢途径的蛋白质(优选阿拉伯糖异构酶、核酮糖激酶、核酮糖-5-p4-差向异构酶)的核酸分子。这样的宿主细胞优选地具有-增加的d-木糖和/或l-阿拉伯糖利用率和/或-与不含有根据本发明的核酸分子的细胞相比，利用d-木糖和/或l-阿拉伯糖的更快的生长速率。例如，本发明的宿主细胞(优选酵母细胞)可以进一步含有核酸分子，其编码阿拉伯糖代谢途径的蛋白质，尤其是编码阿拉伯糖异构酶、核酮糖激酶、核酮糖-5-p4-差向异构酶。优选的是细菌阿拉伯糖代谢途径的蛋白质，尤其是大肠杆菌arabl-核酮糖激酶、大肠杆菌aradl-核酮糖-5-p4-差向异构酶和地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)araal-阿拉伯糖-异构酶。在优选实施方式中，根据本发明的宿主细胞(优选酵母细胞)是通过引入和表达基因araa(l-阿拉伯糖-异构酶)、arab(l-核酮糖激酶)和arad(l-核酮糖-5-p-4-差向异构酶)加以修饰并且此外过度表达tali(转醛醇酶)基因，如例如由本发明人在ep1499708bl中描述的，并且除此之外，这还含有根据本发明的至少一种核酸分子。取决于酵母细胞的预期用途，所述酵母细胞可以含有表达或过度表达另外的核酸序列，其编码另外的蛋白质如转醛醇酶tali和/或tal2、转酮酶tkl1和/或tkl2、d-核酮糖-5-磷酸酯3-差向异构酶rpel、核糖-5-磷酸酯乙酮醇-异构酶rkil或来自其他生物体的编码相同酶活性的相应序列。例如，本发明的宿主细胞(优选酵母细胞)可以进一步过度表达核酸分子，其编码木糖代谢途径的蛋白质，尤其是编码木糖异构酶和木酮糖激酶。优选的是梭状芽孢杆菌或梨囊鞭菌属xyla(piromycesxyla)木糖异构酶和酿酒酵母xks1木酮糖激酶。在优选实施方式中，根据本发明的宿主细胞(优选酵母细胞)通过引入和/或过度表达基因xyla(木糖异构酶)、xks1(木酮糖激酶)加以修饰，并且此外过度表达tali(转醛醇酶)基因。取决于酵母细胞的预期用途，所述酵母细胞可以含有表达或过度表达另外的核酸序列，其编码另外的蛋白质，如转醛醇酶tali和/或tal2、转酮酶tkl1和/或tkl2、d-核酮糖-5-磷酸酯3-差向异构酶rpel、核糖-5-磷酸酯乙酮醇-异构酶rkil或来自其他生物体的编码相同酶活性的相应序列。用于生产生物乙醇的方法和用途如上所述，本发明提供了用于生产生物乙醇和/或其它基于生物的化合物的方法。所述方法包括优选在根据本发明的宿主细胞中表达根据本发明的核酸分子。如上所述，本发明提供了-根据本发明的多肽，-根据本发明的核酸分子，或-根据本发明的宿主细胞，用于生产生物乙醇和/或其它基于生物的化合物，和/或用于含有戊糖、优选d-木糖和/或l-阿拉伯糖的生物材料的重组发酵的用途。如在本文中所使用的，术语“基于生物的化合物”或“其它基于生物的化合物”是指化学化合物和物质，其获自生物材料和原料(生物质)，特别是通过使用微生物。(其它)基于生物的化合物可以是化合物，其选自但不限于：乳酸、乙酸、琥珀酸、苹果酸或其他有机酸，1-丁醇、异丁醇、2-丁醇、其他醇，氨基酸、烷烃、萜烯、类异戊二烯、溶剂、药物化合物，维生素。优选实施方式的进一步描述本发明人已经确定了gal2变体，与野生型或与没有相应的氨基酸取代的gal2多肽相比，其呈现-体外和/或体内戊糖转运功能的增加的活性和/或-对于戊糖的增加的亲和力。因此，本发明人已经确定了gal2变体，其因此赋予宿主细胞(优选酵母细胞)摄入d-木糖和/或d-阿拉伯糖的能力，并且优选地，对于戊糖、优选d-木糖和/或d-阿拉伯糖的增加的摄取的能力。为此，还要提及实施例和附图。-l-阿拉伯糖和d-木糖的摄取因此戊糖，尤其是d-木糖和/或l-阿拉伯糖，可以由酿酒酵母代谢，它们必须首先由细胞摄取。针对戊糖d-木糖测试的所有己糖转运蛋白对于己糖比对于d-木糖具有高得多的亲和力。对于l-阿拉伯糖，假定了类似的情况。迄今为止构建的可以利用戊糖(d-木糖或l-阿拉伯糖)的所有菌株中，报道了相对缓慢的生长。首要的是，戊糖的慢且差的摄取被认为是此的原因(becker和boles,2003；richard等人,2002)。在由d-葡萄糖和d-木糖或d-葡萄糖和l-阿拉伯糖组成的糖混合物的发酵中，并不同时转化糖。由于转运蛋白对于d-葡萄糖的高亲和力，所以首先代谢d-葡萄糖。发生所谓的双峰移动(diauxicshift)。仅在耗尽d-葡萄糖以后，才接着转化戊糖，从而导致明显较慢的生长阶段(kuyper等人,2005a；kuyper等人,2005b)。给出的解释是没有用于戊糖的特异性转运蛋白。-gal2己糖半乳糖是通过高亲和力转运蛋白gal2(km＝1至5mm)来转运，其等同亲合葡萄糖(km＝1.5至1.9)(参见例如reifenberger等人,1997)。如同为半乳糖利用所需要的其它结构基因(gal1、半乳糖激酶；gal10、变旋酶/udp-葡萄糖-4-差向异构酶；gal7、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶)，其表达在葡萄糖的存在下被抑制并且还需要通过半乳糖的诱导。gal2还是分解代谢物失活的靶(horak和wolf,1997)。gal2是可以转运l-阿拉伯糖的仅少数转运蛋白之一。如同大多数的其它己糖转运蛋白，它可以转运d-木糖。然而，它对于l-阿拉伯糖和d-木糖的亲和力是相当低的。因此，在低d-木糖或l-阿拉伯糖浓度下，摄取活性非常低。farwick等人(2014)开发了突变转运蛋白，其允许在d-葡萄糖的存在下的d-木糖摄取。这些突变转运蛋白的一些具有在对应于半乳糖转运蛋白gal2的n376位置处的氨基酸交换。然而，虽然它们证明耐葡萄糖，但它们大多数具有降低的对于木糖的摄取率。本发明的多肽呈现对于木糖的增加的摄取率和/或亲和力，尤其是连同突变，其使得它们耐葡萄糖的抑制。在非常具体的条件下(工程酵母菌株具有各种不同修饰)，必须使用各种诱变方法以及进化工程以发现改善的gal2衍生的戊糖转运蛋白。必须用精心制作的筛查系统并借助于生长测试和糖摄取测定来测试这些转运蛋白。最后，必须测序突变转运蛋白，并且必须从各种突变阐明那些最终负责改善的性能的突变。在富含木聚糖的木质纤维素生物质如硬木和稻草中，d-木糖占高达35％的总糖(参见demeke等人2013)。具有显著量的阿拉伯糖的生物质(数据来源：美国能源部http://www.eere.energy.gov/biomass/progs/searchl.cgi)：根据本发明的gal2变体对于它的利用也是非常重要的。功能性和与此同时特异性戊糖转运蛋白在酵母酿酒酵母中的应用的可能性首先是从木质纤维素水解产物生产生物乙醇以及生产用于进一步化学合成的高级前体产物，尤其是当戊糖浓度较低并且同时存在葡萄糖时。以下列表源自研究“来自生物质的顶级增值化学品(topvalueaddedchemicalsfrombiomass)”(参见wwwl.eere.energy.gov/biomass/pdfs/35523.pdf)。在这里，将30种化学品分类为是特别有价值的，其可以由生物质产生。c原子数最高的30个候选物1氢、一氧化碳23甘油、3-羟基丙酸、乳酸、丙二酸、丙酸、丝氨酸4乙偶姻、天冬氨酸、富马酸、3-羟基丁内酯、苹果酸、琥珀酸、苏氨酸5阿拉伯糖醇、糠醛、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸、脯氨酸、木糖醇、木糖酸6乌头酸、柠檬酸盐、2,5-呋喃二羧酸、葡糖二酸、赖氨酸、左旋葡聚糖、山梨醇一旦通过生物转化(例如，借助于酵母的发酵)从木质纤维素生产这些化学品，重要的是，具有用于半纤维素糖阿拉伯糖和木糖的特异性、高活性转运蛋白。下面的实施例和附图说明本发明，然而，不限于此。附图说明图1：相比n376y，gal2_ep3.1突变体在eby.vw4000中的生长试验。在30°下，在含有20g/l麦芽糖的5mlscm-尿嘧啶中培养转化体，用水洗涤并调节至od600为1。其后进行连续稀释。将5μl滴到相应的培养基并在30°下温育三天。采用含有20g/l麦芽糖的稀释scm-尿嘧啶作为对照。将突变转运蛋白的细胞滴到含有0.2％和2％葡萄糖的scd-尿嘧啶，以及含有0.2％和2％d-半乳糖的scg-尿嘧啶，以测试它们的功能。此外，野生型、gal2_ep3.1和gal2_n376y用于比较。图2：相比n376y，gal2_ep3.1突变体在afy10中的生长试验。在30°下，在含有2％乙醇的5mlsce-尿嘧啶-亮氨酸(sce-ura-leu)中培养转化体，用水洗涤并调节到od600为1。随后进行连续稀释。将5μl滴到相应的培养基上，然后在30°下温育五天。采用含有2％乙醇的稀释sce-尿嘧啶-亮氨酸作为对照。将突变转运蛋白的细胞滴到含有0.2％和2％d-木糖的scx-尿嘧啶-亮氨酸，以及含有1％d-木糖和4％d-葡萄糖的sc-尿嘧啶-亮氨酸以及含有0.2％d-木糖和2％d-葡萄糖的sc-尿嘧啶-亮氨酸，以测试它们的功能。此外，野生型和gal2_ep3.1用于比较。图3：在液体培养基中的生长试验以及发酵在150ml的sce-尿嘧啶-亮氨酸+g418中温育用yepl81_phxt7-opt.xi_clos和p426h7-gal2_wt(wt)或p426h7-gal2_ep3.1(ep3.1)或p426-gal2_n376y+m435i(m435i)转化的菌株afy10。这是预培养物，其用来在含有0.6％木糖(a)或含有0.6％木糖和2％葡萄糖(b)的30mlsc-尿嘧啶-亮氨酸中开始发酵，其中od600为0.6。在180rpm和30°下，温育培养物7天。获取样品，用于生长测量以及代谢物分析。借助于hplc来进行所示木糖浓度的测量，然而1:5稀释样品。以％(w/v)为单位来显示上清液的整个木糖浓度。数据表示三个独立重复的平均值，从而，为了清楚起见，未示出误差棒。图4：在30°下三天以后，gal2_m435i在eby.vw4000中的滴落试验。从左到右滴加几种稀释物(未稀释的、1:10、1:100、1:1000)。图5：在30°下在五天以后，gal2_m435i在afy10中的滴落试验。从左到右滴加几种稀释物(未稀释的、1:10、1:100、1:1000)。图6：在30°下在五天以后，gal2_n376f、n376f+m435i以及n376y+m435i在afy10中的滴落试验。从左到右滴加几种稀释物(未稀释的、1:10、1:100、1:1000)。但对于20g/l木糖，顺序是不同的(未稀释的、1:100、1:1000、1:10)。图7：gal2_n376y、n376y+m435i以及gal2野生型在eby.vw4000中的木糖摄取测定(三个独立的重复)。以nmol木糖每分钟每毫克细胞干重为单位来示出摄取速度。图8：gal2_n376f、n376f+m435i以及gal2野生型在eby.vw4000中的木糖摄取测定(三个独立的重复)。以nmol木糖每分钟每毫克细胞干重为单位来示出摄取速度。实施例方法菌株和培养基-细菌大肠杆菌sure(stratagene)全培养基lb1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％nacl、ph7.5(参见sambrook和russell,2001)为了选择质粒编码的抗生素抗性，在高压灭菌以后，将40μg/ml氨苄青霉素加入培养基。固体培养基另外含有1.9％琼脂。在37℃下发生培养。-酵母cen.pk2-1cmataleu2-3,112尿嘧啶3-52trpl-289his3-δlmal2-8csuc2(euroscarf,frankfurt)菌株eby.vw4000eby.vw4000(基因型：mataleu2-3,112尿嘧啶3-52trpl-289his3-δlmal2-8csuc2δhxtl-17δgal2stlδ::loxpagtlδ::loxpmph2δ::loxpmph3δ::loxp)(wieczorke等人,1999)菌株乙醇红可获自法国里尔lesaffre。描述于demeke等人(2013)。菌株hdy.guf10衍生自乙醇红的木糖和阿拉伯糖消耗的工业酿酒酵母菌株(dietz2013)。菌株afy10eby.vw4000glklδ::loxphxklδ::loxphxk2δ::loxpylr446wδ::loxppyk2δ::ppgkl-opt.xksl-tpgklptpil-tall-ttallptdh3-tkll-ttkllppfkl-rpel-trpelpfba-rkil-trkilloxp(farwick等人,2014)。菌株afy10xafy10+yep-kanr_optxi(farwick等人,2014)。-合成完全选择培养基sc0.67％酵母氮碱w/o氨基酸和硫酸铵、0.5％硫酸铵、20mm磷酸二氢钾，ph6.3，氨基酸/没有相应氨基酸的核碱溶液，用于所用质粒的营养缺陷型标记，碳源处于各自指定的浓度在合成完全培养基中氨基酸和核碱的浓度(zimmermann,1975)：腺嘌呤(0.08mm)、精氨酸(0.22mm)、组氨酸(0.25mm)、异亮氨酸(0.44mm)、亮氨酸(0.44mm)、赖氨酸(0.35mm)、甲硫氨酸(0.26mm)、苯丙氨酸(0.29mm)、苏氨酸(0.48mm)、色氨酸(0.19mm)、酪氨酸(0.34mm)、尿嘧啶(0.44mm)和缬氨酸(0.49mm)。如所指示的，作为碳源，使用了l-阿拉伯糖、d-葡萄糖、d-半乳糖、d-甘露糖、乙醇和麦芽糖。固体全和选择性培养基另外含有1.9％琼脂。在30℃下发生酵母细胞的培养。质粒质粒参考文献p426h7becker和boles,2003yep181_phxt7-optxi_clossubtil和boles,2012p426h7_gal2_wtp426h7_gal2_ep3.1p426h7-gal2_etoh红p426h7-gal2_guf10p426h7-gal2_n376yp426h7-gal2_n376y+m107kp426h7-gal2_n376y+v239lp426h7-gal2_n376y+m435ip426h7-gal2_n376y+m558sp426h7_gal2-m435ip426h7_gal2-n376fp426h7_gal2-n376f+m435idna的制备-质粒dna自大肠杆菌的分离根据制造商的说明，利用genejettm质粒小量提取试剂盒(miniprepkit)(fisherscientific)来进行质粒dna自大肠杆菌培养物的小规模制备。quiagen质粒大量提取试剂盒(maxikit)用于大规模制备。-质粒和基因组dna自酿酒酵母的分离为了基因组和质粒dna自酵母细胞的分离，通过离心(1min，2000xg)来收获5-10ml固定相培养物，并在1ml无菌ddh2o中洗涤一次。通过涡旋，将细胞沉淀物再悬浮于400μlyp-缓冲液1，然后通过添加400μlyp-缓冲液2、1/3至2/3容积玻璃珠以及在2000rpm下在vxr基本vibrax(ika)上的8分钟的摇动，加以溶解。通过离心(30秒，16000xg)来沉淀细胞碎片并将650μl的上清液转移到新鲜埃彭道夫管(eppendorftube)。添加325μl的冷yp-缓冲液3并涡旋样品，然后在冰上温育10分钟，用于蛋白质和其他污染物的沉淀。离心(10-15分钟，4℃，16000xg)样品，将700μl上清液转移到新鲜埃彭道夫管并添加700μl异丙醇。在剧烈混合以后，在rt下温育样品10分钟以允许dna的沉淀，然后通过离心(≥30分钟，rt，16000xg)对其加以沉淀。用500μl冷(-20℃)70％(v/v)乙醇来洗涤dna颗粒两次，然后在rt和16000xg下进行离心步骤5分钟，接着在rt下干燥10分钟，然后溶解于15-30μl无菌ddh2o，其取决于dna颗粒的大小。-确定dna浓度通过光谱测光法在240-300nm的波长范围内来测量dna浓度。如果通过商e260nm/e280nm确定的dna的纯度是1.8，那么消光e260nm＝1.0则对应于50μgdsdna/ml的dna浓度(sambrook和russell,2001)。-pcr产物的dna纯化借助于公司qiagen的“qiaquickpcr纯化试剂盒”并根据制造商的信息来进行pcr产物的纯化。利用限制性内切核酸酶的dna的消化(限制酶切消化)对于dna的位点特异性切割，使用了来自新英格兰生物实验室(neb)或富酶泰斯(fermentas)的限制性内切核酸酶，并借助于提供的缓冲液以及根据制造商的说明。通常1-3个单位/μgdna用于反应，其被温育2-12小时。此方法用来制备用于重组克隆的载体，以证实正确组装的质粒或特异性地降解来自混合物的某种质粒。聚合酶链反应(pcr)在这项工作中，不同的聚合酶用于不同的pcr实验。为了证实基因组基因缺失或整合，使用了crimsontaq聚合酶(neb)。为了扩增orf(用于测序)，基因，其用于整合盒(用于基因组基因缺失或整合)的重组克隆或扩增，使用了phusion或q5聚合酶(neb)。pcr反应的组成和相应的pcr程序显示在下表中。借助于在neb主页上的tm计算器工具来计算引物对的退火温度。用mastercycler梯度(eppendorf)、pikothermo循环仪(finnzymes)或progenepcr循环仪(techne)来进行所有pcr。借助于crimsontaq聚合酶的pcr反应的组成使用crimsontaq聚合酶的反应的pcr程序借助于phusion或q5聚合酶的pcr反应的组成借助于phusion或q5聚合酶的反应的pcr程序融合pcr融合pcr用于构建用于重组克隆的hxt7-n370f的orf。在第一步骤中，在使用p426h7_hxt7作为模板的两个单独的q5pcr反应中，扩增hxt7的两个重叠片段。在1.5％琼脂糖凝胶中分开pcr反应并从相应的凝胶片纯化正确的片段。等摩尔量的两个片段(最低20ng)用于q5pcr反应而没有引物。在添加1μl正向和反向引物(来自10μμ原液)以前，运行这种pcr反应6个循环。然后再运行此反应另外的20个循环。易错(error-prone)pcr(eppcr)为了生成gal2的随机诱变orf，使用了genemorphii随机诱变试剂盒(安捷伦科技(agilenttechnologies))。已遵循制造商的协议。已运行pcr反应33个循环。已经变化模板dna的量，以实现不同的突变率(参见下表)。eppcr产物的分析揭示了已经满足所期望的扩增规格。纯化pcr片段并用作用于phusionpcr反应的模板，以延伸具有同源突出端的片段末端。在不同eppcr中使用的模板dna的量用于dna或rna分离的琼脂糖凝胶电泳通过大小并利用浓度范围为0.7至2.0％(w/v)琼脂糖的琼脂糖凝胶来分开在dna或rna样品中的片段(sambrook和russell,2001)。1xtae-缓冲液用于凝胶的制备并作为运行缓冲液。generuler1kbdnaladder(fisherscientific)用于分选(sizing)dna片段。在负载到凝胶上以前，使dna样品与1/5体积的6xdna负载染料混合。使rna样品与相同体积的2xrna负载染料混合，在96℃下温育10分钟，并在负载以前储存在冰上。在高达6-10v/cm下运行凝胶30至45分钟，其取决于电流、凝胶百分比和预期片段大小。在溴化乙锭浴中凝胶的温育以后，通过紫外光(254nm)来可视化dna和rna。来自琼脂糖凝胶的dna纯化和dna提取为了纯化dna(例如，自pcr反应或在限制酶切消化以后)以及为了从琼脂糖凝胶来提取dna，根据制造商的说明，使用了提取ii-试剂盒(extractii-kit)(macherey-nagel)。dna测序通过gatcbiotechag(konstanz，德国)来进行dna样品的测序。样品含有30-100ng/μl(质粒)或10-50ng/μl(pcr产物)的dna。连同dna样品一起，将适宜的引物(10μμ)送到gatcbiotech。大肠杆菌的转化通过电穿孔来转化大肠杆菌细胞，其中按照dower(dower等人,1988)和wirth(wirth,1989)的协议，并利用bio-radgenepulser。将dna(来自大肠杆菌或酵母dna制剂)加入冷冻感受态大肠杆菌细胞，然后在冰上温育和解冻样品10分钟。然后将细胞悬浮液转移到电穿孔比色皿并加以直接脉冲。将bio-radgenepulser设置为2.5kv/cm的电压，200ω的电阻和25μf的电容。在脉冲之后，立即将细胞与1ml的预热soc培养基混合并转移到埃彭道夫管。在含有卡那霉素或氨苄青霉素的选择性lb琼脂平板上平板接种以前，在thermomixer(埃彭道夫(eppendorf))中，在600-800rpm下并在37℃下温育细胞45分钟。如果借助于hxt7编码质粒来转化细胞，则在室温下进行温育4小时而没有摇动或在20-25℃下同时摇动2小时。酿酒酵母的转化为了酿酒酵母的转化，具有较小偏差地使用了来自gietz等人(gietz和schiestl,2007a,gietz和schiestl,2007b)的liac/ss载体dna/peg方法的两种不同的协议。在适宜的培养基中生长液体培养物至od为0.6-1.0。在3000xg下，培养物的离心和对于洗涤步骤被缩短到2分钟。单链载体dna用作10mg/ml溶液，从而允许在转化混合物中的体积分别为54μl或74μl的dna。热激的持续时间是35分钟。在转化以后，将全细胞悬浮液直接平板接种在选择培养基上，或在具有显性选择标记的转化的情况下，转移到5ml的适当的用于再生的液体培养基。在再生以后，沉淀细胞，再悬浮于50-100μl培养基，然后压析出(platedout)。用于转化的dna量是：对于单个质粒为大约500ng；对于借助于多质粒的共转化，各自为≥1000ng；以及对于整合dna盒(例如，对于基因缺失)为≥2000ng和更大。基因的密码子优化已密码子优化一些基因的orf。密码子已经适应了酿酒酵母的密码子使用，如通过糖酵解基因的优选密码子所确定的。描述于wiedemann等人(wiedemann和boles,2008)。通过同源重组(重组克隆)的质粒构建通过在酿酒酵母中的适宜的dna片段(载体骨架和插入片段)的同源重组，体内构建了质粒。为此目的，通过限制酶切消化，在插入的位点处，线性化各自的载体。可选地，通过琼脂糖凝胶电泳和随后的凝胶提取来纯化导致的载体骨架。设计插入片段以具有旁侧序列(>30bp)，其与针对插入的区同源，或在多个插入片段的情况下，彼此同源。插入片段是通过pcr加以扩增并且可以提供有同源序列，其中通过利用具有相应5’端(同源突出端)的引物。用dna片段来转化酿酒酵母，然后在选择性培养基上平板接种转化体。挑取菌落以接种选择性液体培养基。从这些培养物分离dna并用于大肠杆菌的转化，用于质粒分离和增殖。含有促旋酶抑制基因ccdb的质粒对于大多数大肠杆菌菌株是有毒的，所以耐ccdb-菌株大肠杆菌db3.1用于这些质粒。质粒分离自大肠杆菌单菌落培养物并通过分析性限制酶切消化和dna测序加以证实。设置甘油贮存培养物用于正确克隆。通过同源重组的基因组基因缺失或插入对于在酿酒酵母的基因组中的基因缺失，通过同源重组，将标记盒整合进入相应的基因(carter和delneri,2010,güldener等人,1996,sauer,1987)。通过pcr并利用具有5’端的引物来扩增标记盒，其中上述5’端与靶基因同源以使得能够定位插入。上述盒由显性标记基因(kanmx4/g418、hphntl/瑞格霉素b、natnt2/clonnat)组成，其旁侧有启动子(ptef)和终止子(分别为ttef、tcycl和tadhl)以及loxp位点。这些位点允许通过cre重组酶来切除基因组整合标记盒，其清除标记，用于另一轮的基因缺失。在具有缺失盒的酿酒酵母的转化以后，在选择性培养基上平板接种细胞并在相同培养基上影印培养一次。再次划线分离单菌落以获得单克隆，然后将其挑取并在选择性培养基中生长。从这些培养物分离dna并通过具有不同引物组合的pcr来证实正确整合。命名用于证实的引物，如下表所示。设置甘油贮存培养物用于正确克隆。通过pcr，用于基因组整合的证实的引物的命名为了回收标记，在半乳糖可诱导的gal1-启动子(psh47或pnatcre)的控制下，借助于编码cre重组酶的质粒来转化细胞。在重组酶的简要诱导以后，通过影印培养，选择丢失显性标记的细胞。因为在hxt0菌株中重组酶的全表达是致命的，所以在非诱导条件下重组酶的基础表达用于这些菌株。pcr再次控制盒的去除(参见上文)。因此完成用于基因的过度表达的基因盒的整合。在这些盒内，仅显性标记旁侧有loxp位点并且被切除，盒的其余部分则留在基因组中。引物列表用于细胞培养和发酵实验的方法细胞密度的分光光度法测定通过测量在600nm处的光密度(od600)来用分光光度法量化在液体培养物中的细胞浓度。将细胞培养物的样品或其稀释度放入聚苯乙烯(ps)比色皿，然后用ultrospec2100pro分光光度计(gehealthcare,usa)在600nm处进行分析。甘油贮存培养物对于具体菌株和含有质粒的大肠杆菌的长时间存放，制备了甘油贮存培养物。为此目的，使酿酒酵母的固定培养物或大肠杆菌的生长培养物与50％(v/v)甘油1:1混合，然后存储在-80℃下。半固体琼脂培养选择半固体琼脂培养法来扩大质粒cdna文库(在大肠杆菌中)。通过这种方法，可以最小化在液体培养物中的生长期间可能发生的代表性偏差。在30℃下进行温育以帮助稳定不稳定的克隆(hanahan等人,1991,sassone-corsi,1991)。在生命科技万维网站(lifetechnologieswebsite)处可以找到上述协议。简而言之，将2x浓缩的lb培养基与3g/lseaprep琼脂糖混合，同时搅拌，高压灭菌，然后冷却到37℃。将抗生素和4·105至6·105(每450ml培养基)加入培养并混合2分钟。然后在0℃的冰浴中温育瓶1小时，然后轻轻转移到30℃，进行40-45小时的温育(无扰动)。在生长以后，可以通过在10400xg.下的离心从半固体琼脂沉淀细胞。连续稀释点测定(滴落试验)为了便于比较在不同的生长条件下不同酿酒酵母菌株的生长，进行了连续稀释点测定。在适当的培养基中，在液体培养物中生长细胞到指数期，通过离心(2000xg，2分钟)收集，用无菌水洗涤两次，然后再悬浮于od600为1.0的没有碳源的选择性培养基中。从此细胞悬浮液，在选择性培养基中制备十倍连续稀释(四个稀释步骤)。将6μl的每个细胞悬浮液点样在培养基的平板上以被检查并允许干燥。在30℃下温育平板。需氧分批发酵通常在30℃下，在旋转摇荡器(150-180rpm)上，在大小不等的摇瓶(体积5-10x培养物体积)中，进行需氧分批发酵。作为系列需氧分批发酵来进行进化工程(详情参见下文)。厌氧分批发酵对于厌氧分批发酵，用橡胶塞和发酵锁来密封摇瓶。烧瓶的容积匹配100ml的培养物体积。在30℃下，用磁搅拌器，在120rpm下，连续搅拌培养物。在这项工作中，在od600＝10下进行发酵。为此目的，收获生长细胞并设为在50ml没有碳源的发酵培养基中od600为20。为了开始实验，将该细胞悬浮液加入制备的烧瓶，其含有补充有2x浓缩碳源的50ml发酵培养基。通过插入的无菌针和注射器来获取用于确定细胞浓度和用于hplc分析的样品。在发酵罐中的厌氧发酵一些使用工业酿酒酵母菌株的发酵是在inforsmultifors发酵罐(2x1.41)中进行，其具有800ml的工作容积并配备有温度、ph、o2和co2传感器。使发酵罐填充有530ml浓缩发酵培养基(没有碳源和补充物)，然后高压灭菌。在发酵开始之前，将250ml浓缩碳源溶液、100μl/l止泡剂204和其它补充物(维生素、微量元素和抗生素)加入浓缩培养基。用氮气来吹扫发酵罐以最初产生厌氧条件。在实验期间对顶部空间施加氮气的进料(0.4l/min)以保持厌氧条件。冷却气体出口以凝结并返回蒸气，然后沿管道通过洗气瓶。在300rpm下搅拌培养物，并通过2mkoh或2mh2po4的自动添加，将温度保持为35℃并且将ph保持为5.0。当达到所有设置参数并且不变时，添加细胞的接种物(在20ml发酵培养基中)。在发酵期间，获取样品，用于细胞干重测定和hplc分析。iris5.2软件(infors)用于操作发酵罐并监测实验。细胞干质量的测定为了确定细胞干质量，通过预洗和干燥的(如下所述)过滤器(硝酸纤维素，孔径为0.45μm)来真空过滤5-10ml的液体培养物，随后用ddh2o洗涤两次。在微波炉中在120-150w下干燥过滤器15分钟，然后让其在干燥器进一步冷却和干燥另外15分钟。在过滤之前以及在干燥以后称量过滤器以测量细胞干重。描述的方法改编自ask等人(ask等人,2013)。进化工程作为连续需氧分批发酵来进行进化工程。在选择性sce2中首先接种转化体以获得生物质，然后生长于选择性sc和sm培养基，其含有20g/l木糖，以使菌株适应于木糖利用。在这些初步培养以后，将细胞转换到含有10g/l木糖和增加浓度的葡萄糖的培养基，以施加进化压力。当它们达到晚指数至早固定相时，通过离心(2000xg，2分钟)来收获细胞并转移到新鲜培养基至0.2的od600。每次葡萄糖浓度增加，可以看到适应或当前葡萄糖浓度没有负面地影响生长。向所有培养基(液体和固体)，添加g418以选择afy10菌株本底。另外含有0.5g/l2-脱氧-d-葡萄糖(2-dog)以抑制hxk0表型hxk0菌株的抑制突变体的形成，但不抑制野生型菌株的形成的液体培养基是耐2-dog(subtil和boles,2012)。通过在葡萄糖培养基平板上划线分离培养样品以及还通过hplc分析，已证实了葡萄糖消耗的缺乏。通过hplc的代谢物分析为了代谢物的分析，将无细胞样品(5-10分钟，4℃，16000xg)与1/9容积的50％(w/v)5-磺基水杨酸混合，然后离心(5-10分钟，4℃，16000xg)。在配备有hyperrezxp糖类h+8μm柱和折射率检测器(thermoshodexri-101)的thermoscientific的uhplc+系统(dionexultimate3000)中分析上清液。在65℃的柱温度下进行分离，其中5mm硫酸作为流动速率为0.6ml/min的流动相。chromeleon6.80软件用来控制系统和分析数据。分析了五种标准物(d-葡萄糖、d-木糖、木糖醇、乙酸酯、甘油和乙醇，浓度为0.01-3％(w/v)的混合物)，用于不同化合物的量化。糖摄取测定如由bisson等人(bisson和fraenkel,1983)所描述的并按照walsh等人(walsh等人,1994)的改进，进行糖摄取测定。在选择性yepe中生长菌株eby.vw4000的转化体至od为1.1-1.6，通过离心收获并在冰冷的摄取-缓冲液洗涤两次(rt，3分钟，3000xg)。从此往后，将细胞保持在冰上。将细胞颗粒再悬浮于冰冷的摄取-缓冲液至60mgww/ml的浓度，并等分到110μl。在30℃下，在水浴中温育一个细胞悬浮液等分试样和一个糖溶液4-5分钟。将100μl细胞悬浮液移液到糖溶液(50μl)，通过移液加以简短混合，然后温育5(d-[u-14c]-葡萄糖)或20秒(d-[l-14c]-木糖)。通过将100μl混合物转入10ml冰冷的淬灭缓冲液，其被立即过滤通过durapore膜过滤器(0.22μm孔径，millipore)，来停止摄取反应。用10ml冰冷的淬灭缓冲液洗涤过滤器两次，转移到含有4ml闪烁混合物的闪烁管(rotiszintecoplus,roth)并充分摇动。除此过滤样品(cpm过滤器)以外，将每个反应的10μl直接转移到含有4ml闪烁混合物的闪烁管，用于确定在反应中的总计数(cpm总)。为了确定非特异性地结合于细胞表面或过滤器(cpm空白)的糖的值，在10ml冰冷的淬灭缓冲液中混合33,3μl糖溶液和66,6μl细胞悬浮液的几个样品，然后如上所述进行处理。用wallac1409液体闪烁计数器来分析所有小瓶的放射性。2m、500mm或20mm葡萄糖或木糖(在h2o中)的储备溶液用来制备用于测定的糖溶液(三倍的所期望的浓度，在摄取反应中(s，底物浓度)，50μl等分试样)。在0.2、1、5、25和100mm(对于葡萄糖)以及1、5、25、66、100、200和500mm(对于木糖)的糖浓度下测量摄取。在25、66和100mm木糖(具有另外的25和100mm未标记葡萄糖)下，测量葡萄糖对木糖摄取的抑制。糖溶液含有0.135至0.608μci的d-[u-14c]-葡萄糖(290-300mci/mmol)或d-[l-14c]-木糖(55mci/mmol)(americanradiolabeledchemicalsinc.,st.louis,mo,usa)。摄取测定的数据用于以下计算：在一定的糖浓度下(s，以mm为单位)，在温育期间(t，以秒为单位)，摄取的糖的量(a糖，以nmol为单位)：a糖＝((cpm样品-cpm空白)/(cpm总·10))·s·100μl计算的转运速度(以nmol·min-1·mgww-1为单位)每毫克细胞(m，以mgww为单位)：v＝(a糖·60s)/(t·m)借助于三次独立测量的值，用prism5(graphpadsoftware,inc.)，并通过非线性回归分析和整体曲线拟合，计算km(米氏常数)、v最大(最大初始摄取速度)和ki(竞争性抑制的抑制常数)。生物信息学方法dna序列获自酵母属基因组数据库(saccharomycesgenomedatabase)(sgd,(cherry等人,2012))。利用具有标准设置的praline多对齐服务器((simossis和heringa,2005))加以phobius跨膜结构预测(等人,2004)，进行转运蛋白的序列比对。系统树计算自praline对齐并借助于clustalw2种系发生(larkin等人,2007)以及借助于phylodendron软件(http://iubio.bio.indiana.edu/soft/molbio/java/apps/trees)加以可视化。利用sias(http://imed.med.ucm.es/tools/sias.html)，在蛋白质序列之间的相似性和同一性计算自praline对齐。借助于aline软件(bond和schuttelkopf,2009)来产生用于序列比对的图。实施例1n376y利用易错pcr(eppcr)来产生gal2的突变体，然后在afy10x中加以筛查，如在farwick等人(2014)中描述的。这种方法是比进化工程实验更快并且更经常地产生多个突变/orf，其可能具有独特的组合效应。不利地，在增加数目的突变中，可能会有更多的沉默突变，其可能会恶化在每个克隆中相关突变的识别。在借助于短扩增引物的eppcr中扩增gal2orf，从而施加各种突变率，然后在第二pcr中再次扩增用于重组克隆的纯化片段。直接在筛查菌株afy10x中，功能质粒体内组装自pcr片段和线性化p426h7载体。将转化体平板接种在选择性sce2平板上并随后筛查。通过影印培养，测试菌落，在含1％木糖和增加量的葡萄糖(高达5％)培养基上改善生长。选择七个克隆并在sce2尿嘧啶-亮氨酸-+g418+2-dog中生长以及在平板上划线分离的这些培养物的样品用于比较以及以获得单菌落。证实了这些七个克隆的五个生长在木糖葡萄糖培养基上。如描述的(用ecori来消化酵母dna)，成功分离了两个克隆的质粒并加以测序。测序揭示了多种氨基酸突变，如从表1中可以看出。表1eppcr筛选的两个克隆的分析实施例2m4352.1gal2_ep3.1突变的研究基于gal2_n376y的功能的测试，可以确定并不仅是n376y负责gal2_n376y的性能。因此，应单独研究gal2_ep3.1的进一步突变。n376y负责对于葡萄糖和半乳糖的降低的亲和力。因此，问题是何种氨基酸负责木糖的改善的摄取。为此，在载体p426_gal2_n376y中进行替代m107k、v239l、m435i和l558s，然后将这种载体转化进入筛查菌株eby.vw4000和afy10，以借助于生长测试来测试它们的性能。预计，一个或多个氨基酸交换确定了在gal2_ep3.1的木糖上的改善的生长。位置m435i是仅检查的位置，其位于跨膜结构域(tm10)中。其它位置是位于环中或位于c端。除此之外，突变n376y还可以存在于跨膜结构域(tm8)中，而此突变位于靠近糖结合区。然而，m435i位于靠近上膜水平。2.2测试ep3.1突变的功能测试了筛查菌株eby.vw4000和afy10(具有载体，其含有各自突变gal2-序列)的生长行为。因此，在基于半乳糖、以及葡萄糖(具有不同浓度)的eby.vw4000中测试了构建体。突变体均没有显示出显著生长。由于所有的构建体均得到n376y突变，所以认为，降低对于己糖的亲和力的效应不受另外突变的影响(图1)。在基于木糖培养基的afy10中测试构建体，从而还选择0.2％的浓度来测试转运蛋白的木糖亲和力。此外，借助于含有木糖和葡萄糖的培养基，测试了葡萄糖的竞争性抑制。观测到，基于2％木糖以及基于1％木糖和4％葡萄糖，gal2_n376y+m435i显示出如同gal2_ep3.1的类似的生长。当然，gal2_n376y+m435i似乎具有更高的木糖亲和力，因为观测到，相比于gal2_ep3.1，基于0.2％木糖以及0.2％木糖和2％葡萄糖，更好的生长。除此之外，野生型显示基于低木糖浓度而没有葡萄糖的最好生长。具有其它ep3.1突变的突变体不能基于木糖进行生长(图2)。2.3gal2_n376y+m435i的生长和发酵为了研究，相比于野生型和易错突变体，突变体的生长差异和木糖消耗，进行了在液体培养基中的厌氧生长试验。为此目的，用具有各自的gal2序列和yepl81_phxt7-opt.xi_clos的载体来共转化afy10细胞，并接种于sce-尿嘧啶-亮氨酸+g418以在含有0.6％木糖或含有0.6％木糖和2％葡萄糖的30mlsc-尿嘧啶-亮氨酸中具有0.6的od600。在五天期间定期测量od600，确定生长速率μ并检查样品的代谢物，从而为此1:5稀释样品。结果表明，在0.6％木糖中以及在0.6％木糖和2％葡萄糖中，具有gal2_n376y+m435i的转化体分别具有0.014h-1和0.015h-1的生长速率，相比于仅具有0.006至0.007h-1的生长速率的野生型和易错突变体，具有最好的生长。在两种使用的培养基中gal2_n376y+m435i的性能是相似的，其表明没有由葡萄糖引起的损害。含有gal2_wt的转化体显示出最大的差异，这是因为基于没有葡萄糖的培养基，它可以好得多地生长(od600趋向：0,86[xyl]和0,52[xyl+glu])。可以通过葡萄糖对木糖摄取的竞争性抑制来解释这种效应。针对两种培养基，gal2_ep3.1没有显示出显著差异。当然，在含有0.6％木糖的培养基中，这种突变体的生长是低于野生型的生长，但在含有2％葡萄糖的培养基中显示比野生型更好的生长。此外，转化体的生长一般是低的，这是因为afy10的长生成时间，以及木糖作为碳源，其浓度非常低并且需要时间来适应新培养基。此外，测量了一些代谢物，尤其是木糖和葡萄糖的浓度。如预期的，在含有0.6％木糖和2％葡萄糖的培养基中，葡萄糖的浓度没有改变(数据未示出)，这是由于afy10不能代谢葡萄糖。在不同菌株的上清液中木糖浓度的降低与生长行为相关。因此，对于gal2_n376y+m435i，可以观测到木糖的最高消耗量，因为它显示最高生长速率。在发酵期间，木糖浓度降低到0.35％分别地0.37％。含有gal2_wt和gal2_ep3.1的转化体消耗较少木糖，其类似于它们的生长行为。由于葡萄糖抑制，在含有2％葡萄糖的培养基中的gal2_wt消耗很少木糖，而木糖浓度仅降低到0.53％(图3)。实施例3m435/n3763.1在位置n376处，m435i与各种氨基酸的组合在实施例2中，表明基于葡萄糖-木糖混合物，氨基酸m435与异亮氨酸的交换可以显著改善含有gal2_n376y突变的菌株的生长。为了证明单独m435是否对糖摄取具有影响，进行了连续稀释滴落试验。可以表明，基于低木糖浓度(2g/l)，具有gal2_n376f交换的菌株的生长是好于具有gal2_n376y+m435i的菌株的生长。为了找出单独m435i以及连同n376f一起的效应，构建了相应突变体。为了确定各种突变体的动力学性能，借助于放射性标记木糖，进行了糖摄取测量。3.2利用己糖、木糖和糖混合物，具有gal2_m435i的突变体的生长为了查看仅m435i的交换对葡萄糖和半乳糖的摄取的影响，将交换引入野生型gal2并通过使用菌株eby.vw4000的连续稀释滴落试验加以表征。如从图4中可以看出，m435i交换对半乳糖的摄取没有影响。葡萄糖的摄取被大大减少。与2g/l以及还有20g/l葡萄糖一样，在具有m435i突变的情况下，生长慢得多。为了测试m435i对木糖的摄取的影响，将gal2_m435i连同构建体yep181_phxt7-optxi_clos一起转化进入感受态afy10细胞并进行滴落试验。由于m435i的交换，还降低了木糖的摄取。在2g/l木糖的情况下，不能看到生长以及基于20g/l木糖则仅看到缓慢生长。基于木糖-葡萄糖混合物，则看不到生长(图5)。这些结果表明，m435i仅连同其它突变，例如在位置n376处的突变一起才改善生长。3.3借助于木糖和糖混合物，具有gal2_n376f+m435i的突变体的生长为了表征均通过测序得到证实的不同构建体，将它们连同载体yep181_phxt7-optxi_clos一起转化进入感受态afy10细胞并进行滴落试验。比较具有n376y+m435i的细胞与其它菌株的生长，显而易见的是，基于木糖的高浓度，它们生长更快(图6)。与20g/l木糖以及还有10g/l木糖加上40g/l葡萄糖一样，n376y+m435i菌株显示最好的生长。基于低木糖浓度，含有n376f+m435i组合的细胞生长最好。m435i的另外的突变似乎改善n376f，但只有一点点。3.4n376/m435i转运蛋白变体的动力学性能借助于糖摄取测定来表征gal2_n376f、n376f+m435i、n376y和n376y+m435i的木糖摄取。在菌株eby.vw4000中转化相关质粒。在scm-尿嘧啶中培养细胞直到它们达到指数生长期(od600～0,6)。然后收获细胞，浓缩至相同od600(od60035-40)，分成不同的等分试样并存储在冰上。借助于不同浓度的放射性标记木糖，进行三个摄取测定(一式三份)。收集数据，然后按照michaelismenten并借助于graphpadprism加以拟合(图7和8)。相比与野生型gal2，突变n376y导致摄取活性的强烈减小。然而，n376y+m435i显示大大改善的木糖摄取率，甚至显著高于野生型。令人惊讶地并且与生长测定相反(图6)，相比与野生型和相比与单独的n376f突变体，n376f+m435i似乎具有降低的摄取率。依据拟合数据，确定了km-值和最大摄取率v最大(表2)。表2.依据摄取测定，针对gal2_变体n376f、n376y、n376y+m435i、n376f+m435i和gal2wt，计算km和v最大，并具有标准偏差，其中按照michaelis-menten图并借助于graphpadprism。v最大标准偏差km标准偏差n376y11.922.777370.4176.7n376y+m435i99.6128.76711.4314.1n376f25.862.458108.935.73n376f+m435i13.812.280110.848.94gal2wt63.4311.58617.4176.2从表2中可以看出，另外的m435i突变强烈增加了n376y的v最大，甚至比在野生型中还要高得多。在n376f的情况下，m345i降低了v最大。n376f和n376f+m435i的km-值看起来很相似。由于高标准偏差，不能得出结论：n376f+m435i具有比单独n376f更高的亲和力。更快生长(图6)将表明这种情况。似乎是，至少体内，在低木糖浓度(2g/l)下，另外的m345i突变会改善具有n376f的细胞的生长(图6)。在前面的描述中、在权利要求中和/或在附图中描述的特点可以单独地和以其任何组合是以它们的不同形式用于实现本发明的材料。参考文献becker,j.andboles,e.(2003)amodifiedsaccharomycescerevisiaestrainthatconsumesl-arabinoseandproducesethanol.applenvironmicrobiol69(7),4144-50.bratd,bolese,wiedemannb(2009)functionalexpressionofabacterialxyloseisomeraseinsaccharomycescerevisiae.applenvironmicrobiol.75:2304-11.bruders(2011)analyseeinesunbekanntenglukosetransportersinsaccharomycescerevisiaeundentwicklungeinesxylose-transporterscreeningsystems.diplomathesis(goethefrankfurt).demekemm,dietzh,liy,foulquié-morenomr,mutturis,deprezs,denabtt,boninibm,lideng,dumortierf,verplaetsea,bolese,theveleinjm(2013)developmentofad-xylosefermentingandinhibitortolerantindustrialsaccharomycescerevisiaestrainwithhighperformanceinlignocellulosehydrolysatesusingmetabolicandevolutionaryengineering.biotechnolbiofuels.6:89.dien,b.s.,kurtzman,c.p.,saha,b.c.andbothast,r.j.(1996)screeningforl-arabinosefermentingyeasts.applbiochembiotechnol57-58,233-42.dietzh(2013)konstruktionundcharakterisierungvonpentosefermentierendenphdthesis.goetheuniversityfrankfurt,germanyfarwicka,bruders,schadewegv,orebm,bolese.engineeringofyeasthexosetransporterstotransportd-xylosewithoutinhibitionbyd-glucose.procnatlacadsciusa.2014apr8；111(14):5159-64.hahn-hagerdal,b.,wahlbom,c.f.,gardonyi,m.,vanzyl,w.h.,corderootero,r.r.andjonsson,l.j.(2001)metabolicengineeringofsaccharomycescerevisiaeforxyloseutilization.advbiochemengbiotechnol73,53-84.horakjandwolfdh(1997)cataboliteinactivationofthegalactosetransporterintheyeastsaccharomycescerevisiae:ubiquitination,endocytosis,anddegradationinthevacuole.jbacteriol179(5):1541-1549.jeppsonm,bengtssono,frankek,leeh,hahn-hagerdalb,gorwa-grauslundmf.(2006)theexpressionofapichiastipitisxylosereductasemutantwithhigherk(m)fornadphincreasesethanolproductionfromxyloseinrecombinantsaccharomycescerevisiae.biotechnolbioeng.93(4):665-73.jinys,jeffriestw.(2004)stoichiometricnetworkconstraintsonxylosemetabolismbyrecombinantsaccharomycescerevisiae.metabeng.6(3):229-38.katahiras,mizuikea,fukudah,kondoa.(2006)ethanolfermentationfromlignocellulosichydrolysatebyarecombinantxylose-andcellooligosaccharide-assimiliatingyeaststrain.applmicrobiolbiotechnol.72(6):1136-43.kotter,p.andciriacy,m.(1993)xylosefermentationbysacharomycescerevisiae.applmicrobiolbiotechnol38,776-783.kou,s.c.,christensen,m.s.andcirillo,v.p.(1970)galactosetransportinsaccharomycescerevisiae.ii.characteristicsofgalactoseuptakeandexchangeingalactokinaselesscells.jbacteriol103(3),671-8.kuyper,m.,toirkens,m.j.,diderich,j.a.,winkler,a.a.,vandijken,j.p.andpronk,j.t.(2005b)evolutionaryengineeringofmixed-sugarutilizationbyaxylose-fermentingsaccharomycescerevisiaestrain.femsyeastres5(10),925-34.kuyper,m.,winkler,a.a.,vandijken,j.p.andpronk,j.t.(2004)minimalmetabolicengineeringofsaccharomycescerevisiaeforefficientanaerobicxylosefermentation:aproofofprinciple.femsyeastres4(6),655-64.lucas,c.anduden,n.v.(1986)transportofhemicellulosemonomersinthexylose-fermentingyeastcandidashehatae.applmicrobiolbiotechnol23,491-495.pitkanenjp,rintalae,aristidoua,ruohonenl,penttilam.(2005)xylosechemostatisolatesofsaccharomycescerevisiaeshowalteredmetaboliteandenzymelevelscomparedwithxylose,glucose,andethanolmetabolismoftheoriginalstrain.applmicrobiolbiotechnol.67(6):827-37.reifenbergere,boleseandciriacym(1997)kineticcharacterizationofindividualhexosetransportersofsaccharomycescerevisiaeandtheirrelationtothetriggeringmechanismsofglucoserepression.eurjbiochem245(2):324-333.richard,p.,putkonen,m.,vaananen,r.,londesborough,j.andpenttila,m.(2002)themissinglinkinthefungall-arabinosecatabolicpathway,identificationofthel-xylulosereductasegene.biochemistry41(20),6432-7.sambrookj.andrusselld.w.(2001)molecularcloning.alaboratorymanual.newyork:coldspringharbor.subtiltandbolese(2012)competitionbetweenpentosesandglucoseduringuptakeandcatabolisminrecombinantsaccharomycescerevisiae.biotechnolbiofuels5(1):14.wieczorke,r.,krampe,s.,weierstall,t.,freidel,k.,hollenberg,c.p.andboles,e.(1999)concurrentknock-outofatleast20transportergenesisrequiredtoblockuptakeofhexosesinsaccharaomycescerevisiae.febslett464(3),123-8.wiedemannb.,bolese.(2008)codon-optimizedbacterialgenesimprovel-arabinosefermentationinrecombinantsaccharomycescerevisiae.applenvironmicrobiol.74(7):2043-50。序列表<110>法兰克福大学<120>gal2转运蛋白的变体及它们的用途<130>u30598wo<150>ep14189927.8<151>2014-10-22<160>17<170>patentin版本3.5<210>1<211>574<212>prt<213>酿酒酵母<400>1metalavalglugluasnasnmetprovalvalserglnglnprogln151015alaglygluaspvalileserserleuserlysaspserhisleuser202530alaglnserglnlystyrserasnaspgluleulysalaglygluser354045glyprogluglyserglnservalproilegluileprolyslyspro505560metserglutyrvalthrvalserleuleucysleucysvalalaphe65707580glyglyphemetpheglytrpaspthrglythrileserglypheval859095valglnthrasppheleuargargpheglymetlyshislysaspgly100105110thrhistyrleuserasnvalargthrglyleuilevalalailephe115120125asnileglycysalapheglyglyileileleuserlysglyglyasp130135140mettyrglyarglyslysglyleuserilevalvalservaltyrile145150155160valglyileileileglnilealaserileasnlystrptyrglntyr165170175pheileglyargileileserglyleuglyvalglyglyilealaval180185190leucysprometleuilesergluilealaprolyshisleuarggly195200205thrleuvalsercystyrglnleumetilethralaglyilepheleu210215220glytyrcysthrasntyrglythrlyssertyrserasnservalgln225230235240trpargvalproleuglyleucysphealatrpserleuphemetile245250255glyalaleuthrleuvalprogluserproargtyrleucysgluval260265270asnlysvalgluaspalalysleuserilealalysserasnlysval275280285serprogluaspproalavalglnalagluleuaspleuilemetala290295300glyileglualaglulysleualaglyasnalasertrpglygluleu305310315320pheserthrlysthrlysvalpheglnargleuleumetglyvalphe325330335valglnmetpheglnglnleuthrglyasnasntyrphephetyrtyr340345350glythrvalilephelysservalglyleuaspaspserphegluthr355360365serilevalileglyvalvalasnphealaserthrphepheserleu370375380trpthrvalgluasnleuglyargarglyscysleuleuleuglyala385390395400alathrmetmetalacysmetvaliletyralaservalglyvalthr405410415argleutyrprohisglylysserglnproserserlysglyalagly420425430asncysmetilevalphethrcysphetyrilephecystyralathr435440445thrtrpalaprovalalatrpvalilethralagluserpheproleu450455460argvallysserlyscysmetalaleualaseralaserasntrpval465470475480trpglypheleuilealaphephethrpropheilethrseralaile485490495asnphetyrtyrglytyrvalphemetglycysleuvalalametphe500505510phetyrvalphephephevalprogluthrlysglyleuserleuglu515520525gluileglngluleutrpglugluglyvalleuprotrplysserglu530535540glytrpileproserserargargglyasnasntyraspleugluasp545550555560leuglnhisaspasplysprotrptyrlysalametleuglu565570<210>2<211>32<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>2ggtgccggtaactgtatcattgtctttacctg32<210>3<211>33<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>3acaggtaaagacaatgatacagttaccggcacc33<210>4<211>59<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>4aacacaaaaacaaaaagtttttttaattttaatcaaaaaatggcagttgaggagaacaa59<210>5<211>60<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>5gaatgtaagcgtgacataactaattacatgactcgagttattctagcatggccttgtacc60<210>6<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>6gtcattggtgtagtctactttgcctccactttctttag38<210>7<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>7gaaagtggaggcaaagtagactacaccaatgacaatgg38<210>8<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>8ttattttttctactacggtgccgttattttcaagtcag38<210>9<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>9gacttgaaaataacggcaccgtagtagaaaaaataattg39<210>10<211>36<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>10gtctgaatatgttaccatttccttgctttgtttgtg36<210>11<211>36<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>11aaacaaagcaaggaaatggtaacatattcagacatg36<210>12<211>36<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>12ttgagaaggtttggtaagaaacataaggatggtacc36<210>13<211>41<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>13accatccttatgtttcttaccaaaccttctcaaaaagtctg41<210>14<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>14agctattcgaactcacttcaatggagagttccattagg38<210>15<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>15tggaactctccattgaagtgagttcgaatagctctttg38<210>16<211>37<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>16ggtaataattacgattcagaggatttacaacatgacg37<210>17<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>17atgttgtaaatcctctgaatcgtaattattacctcttc38当前第1页12