本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种植物抗旱相关蛋白Tabzip174及其编码基因和应用。
背景技术：
：干旱、盐碱等非生物逆境是植物的生长和发育主要限制因素。据统计，世界干旱、半干旱地区占地球陆地面积的33％，盐碱地占地球陆地面积的7.6％。在我国，干旱地区的耕地面积约为5.7亿亩，盐碱地约为5.54亿亩，每年因干旱、盐碱等逆境对小麦造成的粮食减产达700-800亿公斤。小麦是我国重要的粮食作物之一，在国民经济中占有非常重要的地位。然而，干旱、高盐等逆境胁迫严重影响着小麦的产量和品质，制约着农业生产的快速发展。植物的耐旱、耐盐性大多属于多基因控制的数量性状，利用常规育种方法改良作物的抗逆性受到周期长、优异种质资源缺乏的制约。随着现代分子生物学的发展，利用基因工程技术，从分子水平上深入研究植物与非生物逆境之间的关系，揭示植物对逆境胁迫信号传导及基因表达调控分子机理，为培育作物抗逆新种质提供了理论基础。目前，通过基因工程技术已将许多抗旱，耐盐和耐低温相关的基因(如：合成各类渗透保护剂的酶类基因、转录因子和信号传导有关的蛋白激酶基因)导入到作物中，从而提高作物的抗逆性已有大量的报道。在植物体内，抗氧化系统由许多酶组成，如SOD、过氧化氢酶、过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶。SOD是植物体内清除活性氧的关键酶，植物中已有几种SOD酶基因被克隆出来并在转基因植株中得到了活验证性。植物对干旱、高盐等逆境胁迫的耐性是多基因控制的数量性状，其生理、生化过程是基因相互作用、共同调节的，导入单个功能基因虽然在一定程度上提高了植物的抗逆性，但提高幅度不大，往往不能达到有效增强植物抗逆性的目的。近年来，通过转录因子的结构与功能的分析来鉴定、阐明各种条件下基因表达调控的机理得到了广泛关注。碱性亮氨酸拉链(basicleucinezipper,bZIP)蛋白是真核生物转录因子中分布最广泛、最保守的一类蛋白。研究表明：bZIP蛋白不仅参与种子贮藏基因的表达、光形态的发生以及器官建成的控制，还参与植物对脱落酸、光和发育中各种信号的反应。拟南芥基因组全序列分析，发现了大量的bZIP类转录因子，其数量是酵母、蠕虫和人的4倍多。在豆科植物基因组中，有131种bZIP转录因子被发现并被命名为Gmbzip，在水稻基因组中有89种bZIP转录因子被发现。目前，将bZIP转录因子分为A、B、C、D、E、F、G、H、I和S亚族，共10个亚族。已克隆的A亚族植物bZIP转录因子，包括13个成员，如ABF1、ABF2/AREB1、ABF3、ABF4/AREB2、GBF4、ABI5、AREB3、DPBF2等。Choi等，首次克隆到了拟南芥的ABF/AREBbZIP类转录因子，其成员分别为：ABF1、ABF2/AREB1、ABF3、ABF4/AREB2。其中，ABF1主要参与低温、ABA胁迫应答反应，ABF3主要参与ABA、高盐、低温、热、氧化的胁迫应答反应，ABF2/AREB1，ABF4/AREB2主要参与ABA、干旱、高盐、热、氧化的胁迫应答反应。在拟南芥幼苗中，ABI5对ABA信号和胁迫反应起着关键调控作用，ABA诱导ABI5表达，稳定其蛋白质同时修饰它的磷酸化状态。水稻幼苗中的OsABI5可以和G盒元件结合并激活报道基因的表达，ABI5与水稻中的类似物TRAB1的作用相似，可能是为LEA启动子补充有效的ABI3(在水稻中称为OsVP1)转录催化剂。在后期种子发育中，ABA诱导晚期胚胎发生丰富(LEA)基因的表达，这些基因被认为参与渗透调节物质的积累，ABA也阻碍种子萌芽和幼苗生长，对ABI5突变体显型的分析表明，ABI5调控所有这些进程，它抑制种子萌芽和幼苗生长。由此可见，同一亚族的各个bZIP转录因子成员功能具有差异。技术实现要素：本发明的目的是提供一种植物抗旱相关蛋白Tabzip174。本发明的再一目的是提供编码上述植物抗旱相关蛋白Tabzip174的编码基因。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。本发明的另一目的提供上述植物抗旱相关蛋白Tabzip174的应用。本发明所提供的抗旱相关蛋白Tabzip174，来源于小麦品种京花9号，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本发明的转录因子由340个氨基酸残基组成，是bZIP类转录因子。自SEQIDNO.1的氨基末端第255-275位氨基酸残基是保守的bZIP结构，自SEQIDNO.1的氨基末端第240-245位氨基酸残基为核定位序列。SEQIDNO.1：为了使蛋白Tabzip174便于纯化，可在由SEQIDNO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL根据本发明所公开的SEQIDNO.1序列，本发明的转录因子Tabzip174可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。根据本发明的Tabzip174编码基因具有如SEQIDNO.2所示核苷酸序列。Tabzip174的表达受干旱、盐、脱落酸和低温胁迫的诱导。SEQIDNO.2含有Tabzip174基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有Tabzip174基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用Tabzip174构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。本发明的另一个目的是提供一种培育耐逆植物的方法。本发明所提供的培育耐逆植物的方法，是将上述任一种含有Tabzip174基因的重组表达载体导入植物细胞中，得到耐逆植物。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的bZIP转录因子Tabzip174的编码基因导入植物细胞，可获得对干旱和盐等非生物逆境胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、小麦、小麦、拟南芥、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。所述植物耐逆性具体可为对非生物胁迫的耐逆性，如对或盐胁迫的耐逆性。本发明以抗旱、耐盐性较强的小麦为实验材料，得到了抗逆相关的bZIP转录因子Tabzip174蛋白及其编码基因，并将Tabzip174基因导入拟南芥，显著提高了植物的抗旱性。本发明的抗旱相关蛋白及其编码基因对改良、增强拟南芥抗逆性，提高产量、加速抗逆分子育种进程，以及有效节省水资源具有十分重要的理论和实际意义。下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。附图说明图1为抗旱相关蛋白Tabzip174编码基因的cDNA克隆，以小麦cDNA为模板，1-5:小麦Tabzip174cDNA片段；M:DL2000marker(100，250，500，750，1000，2000bp)。图2为荧光定量PCR分析Tabzip174在干旱(PEG)、盐(NaCl)、低温(Cold)、脱落酸(ABA)胁迫处理下的表达特征。图3为转基因拟南芥萌发及根长鉴定。A.pBI35S-Tabzip174转基因拟南芥在含有5％PEG培养基上的萌发率统计(OE-2，-4，-5为3个转基因株系)；B.pBI35S-Tabzip174转基因拟南芥5％PEG培养基上根长表型；C.pBI35S-Tabzip174转基因拟南芥根长统计分析。图4为转基因拟南芥盆栽抗旱鉴定。A.pBI35S-Tabzip174转基因拟南芥和对照干旱处理复水后生长表型情况(OE-2，-4，-5，-8为4个转基因株系)；B.pBI35S-Tabzip174转基因拟南芥和对照存活率统计分析。具体实施方式以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。实施例1：小麦抗旱、耐盐相关Tabzip174基因的cDNA克隆。对生长45天左右的小麦幼苗进行干旱处理5小时，用Trizol提取小麦总RNA。应用5’RACE试剂盒(5’RACESystemforRapidAmplificationofcDNAEndsKit)(GIBCOBRL,CAT.NO.18374-058)和3’RACE试剂盒(3’RACESystemforRapidAmplificationofcDNAEndsKit)(GIBCOBRL,CAT.NO.18373-019)获得Tabzip174基因。用Trizol提取小麦幼苗的总RNA，用superscriptII(invitrogen)反转录酶反转录获得到cDNA。根据Tabzip174基因编码区序列设计引物P1和P2。以反转录得到的cDNA为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增。引物P1和P2的序列如下：P1：5’-ATGGAGATGCCGGGAGGGAG-3’，P2：5’-CCATGGACCCGTCAGTGTTC-3’。对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为1.0-1.1kb左右的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收该片段。将该回收片段与pGEM-TEasy(Promega)连接，参照Cohen等的方法(ProcNatlAcadSci，69:2110)，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-TEasy载体上的氨卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的Tabzip174基因的开放阅读框(ORF)为SEQIDNo.2的自5’末端第1至1020位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是SEQIDNo.1的蛋白质。将含序列SEQIDNo.2所示Tabzip174基因的重组载体命名为pTE-Tabzip174，其cDNA克隆结果如图1所示。Tabzip174基因的序列在Genabnk上进行比对，该基因与拟南芥中bZIP类转录因子具有较高同源性，而在小麦中未发现同源蛋白基因，证明Tabzip174基因是一个新的基因。实施例2：用Tabzip174基因培育抗旱转基因植物1、35S-Tabzip174重组表达载体的构建以小麦的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用含有SmaI和XbaI接头序列的特异引物进行PCR扩增；然后SmaI和XbaI双酶切PCR产物，回收，将酶切产物正向插入载体pBI121的CaMV35S启动子之后的SmaI和XbaI酶切位点之间，得到重组载体35S-Tabzip174。引物序列如下：Tabzip174[SmaI]5’–GCGCCCGGGATGGAGATGCCGGGAGGGAG-3’Tabzip174[XbaI]5’–TGCTCTAGCCATGGACCCGTCAGTGTTC-3’2、转基因拟南芥的获得和鉴定1)转基因拟南芥的获得将上述构建的重组表达载体35S-Tabzip174分别用冻融法转化根癌农杆菌C58C1，再用叶盘法分别将整合有35S-Tabzip174的根癌农杆菌C58C1转化拟南芥，用含100mg/L卡那霉素的MS培养基进行2轮筛选，每轮筛选10-15天，得到阳性转基因植株。将筛选得到的阳性转基因植株用PCR做进一步鉴定筛选，PCR所用的一对引物为P3和P4。P3(上游引物):5’-CCGCCGCCGCCGCTGCAGCC-3’，P4(下游引物):5’-ACGAGAGATCCCCGCCCTCC-3’。对35S-Tabzip174转基因拟南芥进行PCR鉴定，阳性转基因植株经PCR扩增可获得460bp左右条带，结果获得转35S-Tabzip174拟南芥25株。同时将pBI121空载体导入拟南芥，方法同上，作为对照，获得15个株系的转空载体拟南芥(筛选获得的转基因拟南芥用T0代表示)。2)转Tabzip174基因植株耐旱性鉴定将T0代转35S-Tabzip174基因拟南芥植株及对照植株的3周龄苗的根系分别移入5％PEG的培养基中进行干旱胁迫处理30天，观察表型并拍照。荧光定量PCR分析Tabzip174在干旱(PEG)、盐(NaCl)、低温(Cold)、脱落酸(ABA)胁迫处理下的表达特征，如图2所示。转基因拟南芥培养基耐旱鉴定如图3所示，A.pBI35S-Tabzip174转基因拟南芥在含有5％PEG培养基上的萌发率统计(OE-2，-4，-5为3个转基因株系)；B.pBI35S-Tabzip174转基因拟南芥5％PEG培养基上根长表型；C.pBI35S-Tabzip174转基因拟南芥根长统计分析。转基因拟南芥盆栽耐旱鉴定如图4所示，A.pBI35S-Tabzip174转基因拟南芥和对照干旱处理复水后生长表型情况(OE-2，-4，-5，-8为4个转基因株系)；B.pBI35S-Tabzip174转基因拟南芥和对照存活率统计分析。结果表明：35S-Tabzip174转基因植株在干旱胁迫条件下也能够正常生长，根系发达，叶片颜色深绿，存活率较高；所有空载体转基因植株叶片均萎蔫或失绿、发白而导致死亡。转基因拟南芥耐旱性鉴定结果证明Tabzip174基因可以提高植物的耐旱性。当前第1页1 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