技术领域本发明涉及两种亲和力提高的脂肪酸AMP连接酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。
背景技术：
达托霉素是由玫瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus)产生的环脂肽类化合物，这类抗生素的生物合成是通过不依赖于核糖体的非核糖体肽合成酶(Non-ribosomalpeptidesynthetase，NRPS)途径完成的，它在体外对革兰氏阳性微生物具有强大的抗菌活性。达托霉素是从玫瑰孢链霉菌发酵液中分离得来，由13个氨基酸残基组成，正常情况下，玫瑰孢链霉菌发酵产生一组环脂肽类抗生素：A21978C1-3，达托霉素是A21978C1-3的衍生物，在玫瑰孢链霉菌发酵过程中，加入外源性前体癸酸可提高达托霉素在发酵产物中的比重。达托霉素生物合成的起始是通过脂肪酸AMP连接酶和癸酸相结合来启动的。目前国内提高达托霉素产量的研究主要集中在优化达托霉素发酵工艺以及对达托霉素高产菌株的选育工作。国内关于达托霉素发酵工艺的研究已经较为完善。相比较于发酵工艺较为完善的研究，国内对于达托霉素高产菌株的选育工作主要是通过诱变以及抗性筛选来寻找达托霉素高产菌株或者是提高玫瑰孢链霉菌对癸酸的耐受性，通过增加癸酸的添加量来提高达托霉素的产量由于诱变以及抗性筛选面临随机性高，周期较长等问题，因此在基因水平上进行定向改造来提高达托霉素产量成为了近些年的研究热点。对玫瑰孢链霉菌诱变育种与基因的定向改造相结合的方式将成为未来构建达托霉素高产菌株的主要研究方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于玫瑰孢链霉菌脂肪酸AMP连接酶(DptE)的基因dptE进行定点突变，得到亲和力提高的DptE，并将该突变基因取代野生玫瑰孢链霉菌的dptE基因构建重组玫瑰孢链霉菌以提高产物中达托霉素的产量。本发明提供了两种亲和力提高的脂肪酸连接酶突变体，其氨基酸序列是SEQIDNO.4、SEQIDNO.5所示的序列，突变体简称pAL296、pAL302。在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将原有蛋白的氨基酸序列进行计算机模拟进行同源模建，分子对接测定其和癸酸的亲和力，并设计突变。本发明还提供两种表达所述突变体的基因工程菌。在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为大肠杆菌E.coliBL21，表达脂肪酸连接酶突变体。在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以玫瑰孢链霉菌为宿主，表达生产达托霉素。本发明还要求保护编码所述突变体的核苷酸序列，以及所述突变体和基因工程菌在达托霉素生产方面的应用。有益效果：相对于原有的脂肪酸连接酶而言，本发明的突变体pAL296、pAL302产生的达托霉素产量均提高了，本发明的脂肪酸连接酶可在酸性条件下催化癸酸的磷酸化作用，应用于达托霉素的生产方面。附图说明图1是脂肪酸AMP连接酶的核酸电泳图谱。DNA由箭头标出，DNA大小以kb为单位。图2展示利用WesternBlot鉴定分离到的脂肪酸AMP连接酶蛋白。图3展示利用HPLC检测的野生菌达托霉素发酵图。图4展示利用HPLC检测的菌株DCE296达托霉素发酵图。图5展示利用HPLC检测的菌株DCE302达托霉素发酵图。具体实施方式培养基：种子培养基(g/L)：葡萄糖5，糊精15，蛋白胨10，酵母粉10，Ph7.0，115℃灭菌30min。发酵培养基(g/L)：糊精10.62，酵母粉1.59，酪蛋白1.28，L-天冬氨酸1.5，硫酸钾8，Ph6.5，121℃灭菌20min。达托霉素产量测定：每250mL锥形瓶中装入50mL发酵培养基。按3-5％的接种量将种子液转入发酵培养基中，然后置于转速220r/min，28-30℃的摇床中，发酵144h。在发酵培养24h后，于每升发酵液中添加10mL癸酸。发酵结束后，通过高效液相色谱检测达托霉素含量。流动相：0.1％三氟乙酸乙腈溶液∶0.1％三氟乙酸水溶液为41∶59；流速为1mL/min；柱温为30℃；检测紫外波长为223nm，进样量为20μL。实施例1：突变基因的设计采用计算机模拟的方法，使用MOE软件进行同源模建，并将脂肪酸AMP连接酶与癸酸进行分子对接，模拟测定其亲和力大小，将部分活性中心或附近有可能影响亲和力的氨基酸进行替换，测定亲和力大小，选择亲和力提高的位点296和302。实施例2：突变菌株的获得采用PCR扩增和OVERLAPPCR的方法，得到氨基酸序列如SEQNO.4和SEQNO.5所示的脂肪酸AMP连接酶基因，然后将基因连接到pET-22b(+)再转化到大肠杆菌E.coliDH5α中进行扩增，筛选测序正确的转化入大肠杆菌E.coliBL21中，筛选正确的转化子命名为EC296、EC302。实施例3：突变菌株的验证种子培养：将重组菌EC296、EC302从甘油管中取适量接种于LB培养基中(100ug/ml氨苄青霉素)装液量为10ml/50ml，37℃，220rpm摇床过夜培养。摇瓶发酵：将过夜培养的种子液以2％接种量接入LB培养基，培养至OD值0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG进行诱导，18℃诱导18-24h.脂肪酸AMP连接酶的纯化：将重组菌发酵液8000r/min离心20min，取沉淀，用高渗蔗糖溶液低温搅拌20min，12000r/min离心30min，收集上清，沉淀用低渗溶液低温搅拌20min，12000r/min离心30min，收集上清。将两次收集的上清合并，加入终浓度为0.5M的NaCL，加入1％的TritonX-100，4℃搅拌15min，用0.22微米的滤膜过滤。滤液用镍柱进行纯化。酶蛋白的验证：将纯化前后的发酵液进行蛋白电泳和WB测定。实施例4：达托霉素的发酵构建穿梭质粒pAK296、pAK302将其转入玫瑰孢链霉菌替换原有的脂肪酸AMP连接酶基因，得到工程菌株DCE296、DCE302。种子培养：将重组菌DCE296、DCE302取适量接种于种子培养基置于30℃，220rpm培养32-36h即成种子培养液。摇瓶发酵：配制发酵培养基50mL置于250ml广口三角锥形瓶中，取4％种子培养液转接入发酵培养基内，置于30℃，220rpm培养140h，并从42h起在无菌条件下每12h加入20ml癸酸-油酸甲酯溶液至发酵结束。高效液相色谱检测：流动相：0.1％三氟乙酸乙腈溶液∶0.1％三氟乙酸水溶液为41∶59；流速为1mL/min；柱温为30℃；检测紫外波长为223nm，进样量为20μL。菌株DCE296发酵液中达托霉素含量为野生菌的1.4倍、菌株DCE302发酵液中达托霉素含量为野生菌的1.32倍。