技术领域本发明属于分子生物学领域，具体涉及检测人线粒体12SrRNA基因961insC，T1095C、C1494T，A1555G4个常见突变的试剂盒及其应用。
背景技术：
听力下降是人类最常见的感觉缺陷，据估计全世界大约有7000万人因为听力残疾而导致言语交流障碍，其中约一半有遗传学基础，涉及常染色体显性、常染色体隐性、X连锁及线粒体遗传等多种遗传方式，线粒体遗传约占2％。近十余年来关于线粒体聋的研究有了突飞猛进的发展，遗传学家和耳科学家发现线粒体突变也是非综合症性耳聋的原因之一，并且已经明确了几个与耳聋有关的线粒体突变。第一个导致NSHL的线粒体突变mtDNAA1555G1993年由Prezant等描述。NSHL经常发生在mtDNA12S-rRNA和tRNA上，12SrRNA似乎和药物性耳聋关系更为密切。在这些位点中961insC，T1095C、C1494T，A1555G位于编码12SrRNA的基因上，其中A1555G是引起母系遗传性耳聋的最常见的突变。12SrRNA听力损失常表现为药物性耳聋或双侧对称、逐渐加重的非综合征性耳聋。因此我们设计了应用PCR-DHPLC(变性高压液相色谱，DenaturingHighPerformanceLiquidChromatography,)法来同时检测这四个突变位点。迄今为止，用于筛查疾病相关基因突变的方法有很多种。它们包括：单链构象多态性(SSCP)，构象敏感性凝胶电泳(CSGE)，变性梯度凝胶电泳(DGGE)，双相基因扫描(TDGS)，直接DNA测序，基因芯片分析技术等。DHPLC是一种新型的高通量的DNA序列突变及多态性分析技术，用离子对反向高压液相色谱分离检测异源双链有更高的准确性和敏感性。PE-DHPLC扩增包含有突变位点的DNA片段后，紧邻突变位点上方或下方的引物退火，在dNTPs或ddNTPs存在时，引物可以延伸1个或数个碱基，根据延伸产物波形的不同能辨别不同的基因型。该技术最早由Kuppuswamy等1991年报道。PE-DHPLC原理利用不同的DNA链与色谱柱之间的吸附力差异来分离不同的DNA分子。在两个DNA分子没有长度差异时，如果碱基组成不同，他们与色谱柱的吸附力就有差异，吸附力有差异的DNA分子洗脱时间不同。利用这一原理，可将两个长度一样的DNA分子置高温变性，后置于低温复性。若两个DNA分子序列相同，复性后只产生一条双链DNA分子，经色谱分析只产生一个单独的峰；若两个DNA分子序列不同，复性后会产生同源双链(homoduplex)及异源双链(heteroduplex)等不同的DNA分子，这些DNA分子与色谱柱的吸附力不同，洗脱时间不同，根据DNA片段大小和片断单链的组成顺序从柱上洗脱下来，以峰的形式被记录下来，第一个峰为掺入的引物峰，然后是引物延伸产物峰，根据峰的个数和对称性，确定基因型。DHPLC基因突变筛查，就是利用离子对反向液相色谱技术，通过独特的DNA分离基质，对特定的PCR反应产物进行分离。在待测样品部分变性和乙晴冲洗梯度呈线性增加的情况下，带有突变序列的异源双链，与同源双链(野生型或阴性对照)相比，它们的柱保留时间相对较短。因此，带有突变序列的样品呈现出异源和同源双链混合物的峰型特点，而不含突变序列的样品则只有同源双链的峰型。出现与野生型或阴性对照不同的DHPLC冲洗结果，说明检测样品含有突变序列。因为遗传性耳聋有大量的疾病相关位点需要进行基因突变筛查，DHPLC技术也是一种理想的方法。PE-DHPLC法最多可以同时检测8种突变，4种突变的检测是完全变性DHPLC最佳检测数量。进一步tRNA上的7472insC、A7445G、T7510C和T7511C突变也可以使用我们建立的这种方法检测。我们检测的这四个突变位于mtDNA12SrRNA上而且相距不远，初步结果显示PE-DHPLC法波峰图清晰易分辨，加入的4种ddNTPs可以使PE反应终止，使四种突变的基因型获得良好的确认，而且结果也容易解释。我们摸索的以PCR为基础的PE-DHPLC方法同时可以检测四个突变，该方法的优点是加样和分析的自动化，引物延伸后不需要进行纯化过程，是比较简便的突变检测方法，而且多个突变可以复合在一起，降低了实验成本(每个突变检测成本约4-5元RMB)。使用DHPLC检测的难度在哪，包括引物设计的难度在哪？检测的难度在于同时检测4个不同的突变，不同引物之间可能会发生相互作用，影响检测结果的精准度，对于引物设计的要求很高，为使PE反应进行需要为引物人工加上的碱基。另外引物3′末端的延伸碱基可能会影响TaqDNA聚合酶的延伸效率，需要反复摸索反应条件。
技术实现要素：
针对现有技术中的不足，本发明的发明人进行了深入研究，提供一种检测人线粒体12SrRNA基因961insC，T1095C、C1494T，A1555G4个常见突变的试剂盒及其应用。本发明的一个目的在于提供检测人线粒体12SrRNA基因突变的试剂盒，所述的试剂盒包括如下引物PCR上、下游引物为上游5′-AAGCATCAAGCACGCAGCAAT-3′753-773,下游5′-TGGTAGTAAGGTGGAGTGGGTTTG-3′；在本发明的一个优选实施方式中，所述的试剂盒还包括还包括Taq酶、ThermoSequenaseDNAPolymerase、dNTPs、ddNTPs(AmershamBiosciences)，TEAA(trithylamoniumacetate)，(Transgenomic)；acetonitrile(Fisher)。ExonucleaseI(USB)，AlkalinePhosphatase(Shrimp)(RocheDiagnostics)。本发明另一方面还涉及上述试剂盒在DHPLC检测中的应用，所述的检测优选是非诊断目的的。本发明另一方面还涉及上述试剂盒在同时检测人线粒体12SrRNA基因961insC，T1095C、C1494T，A1555G4个常见突变中的应用。优选的，所述的检测是非诊断目的的。进一步的，所述的检测是通过DHPLC方法进行。本发明另一方面还涉及上述试剂盒在制备诊断听力下降的检测试剂中的应用。从临床治疗的角度来看，对已知聋病基因突变的检测对于耳聋的病因学诊断和预防至关重要，本发明的检测方法自动化程度高、快速、准确、结果直观，可以在不到5个小时内同时检测mtDNA12SrRNA的4种突变，极大地提高检测的效率。这种新的方法为聋病突变的检测提供了有力的工具。附图说明图1扩增包含4个突变位点的靶基因序列的PCR图。图2四种突变的DHPLC图，上图说明阴性对照仅有引物峰，下图是包含四种不同突变的峰图。具体实施方式在本发明中，所述的“份数”均表示“重量份”，除非特别声明；所述的“比例”均表示“质量比”，除非特别声明。1、主要试剂PCR引物由北京奥科生物技术公司合成，延伸引物(表1)、Taq酶、ThermoSequenaseDNAPolymerase、dNTPs、ddNTPs(AmershamBiosciences)，TEAA(trithylamoniumacetate)，(Transgenomic)；acetonitrile(Fisher)。ExonucleaseI(USB)，AlkalinePhosphatase(Shrimp)(RocheDiagnostics)4例外周血DNA样本，包含四种不同突变的DNA样本被用来证明PE-DHPLC方法的可行性，4例正常对照(无耳聋及全身系统疾病)。正常和突变DNA序列均经测序验证。2、引物PCR上、下游引物为上游5′-AAGCATCAAGCACGCAGCAAT-3′753-773,下游5′-TGGTAGTAAGGTGGAGTGGGTTTG-3′1708-1685，扩增片段长度为975bp，包含了961insC、T1095C、C1494T、A1555G突变位点。3、四个引物及延伸产物碱基W(Wild)野生型M(Mutation)突变型2、PCR方法对目标片段进行扩增，反应体系为20μl，，反应体系50μl体系。反应体系中加入100ng的基因组DNA，10×Buffer(含MgCl215mmol/L)缓冲液5μl，10×dNTP(15mmol/L)5μl，正反向引物2pmol/μl各2.5μl，加Taq酶(北京泰格美科技有限公司)1μl，加双蒸水至50μl。PCR反应在德国WhatmanBiometra公司Tgradient热循环仪上完成。PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30秒，58℃复性30秒，72℃延伸30秒，30个循环，反应终止后再72℃延伸5min。PCR产物4℃保存。取4μlPCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(含溴化乙啶0.5μg/ml)检测产物。(AppliedBio9700)(一)扩增包含4个突变位点的靶基因序列(二)PCR产物纯化与多重PE反应1、PCR产物纯化。PCR产物中加入新鲜配制ExonucleaseI和AlkalinePhosphatase(Shrimp)混合液(ShrimpAlkalinePhosphatase和ExonucleaseI按照10：1的比例混合)2μl37℃孵育25min清除多余的引物和脱氧核苷酸，随后PCR仪94℃5min使酶失活。2、多重PE反应多重PE反应在20ul反应体系中进行，阴性对照仅加入3μlddH2O。反应条件为96℃变性1min，随后96℃5s、65℃15s进行50个循环。多重PE反应体系3、DHPLC分析在美国Transgenomic公司的WAVEDNAFragmentAnalysisSystem上进行。5μl的PE产物以0.9ml/min的流动相流量注入样本，引物延伸反应在70℃变性条件进行，以每分钟0.9mL的流速将结合在检测柱上的延伸产物洗脱下来(表1.4.6)。吸光值经系统处理后，信号被输送到监视屏上形成DHPLC色谱曲线，即DHPLC峰型图。引物延伸反应在70℃变性条件进行BufferA-0.1MTEAA,BufferB-0.1MTEAA/25％acetonitrile图1显示包含四种突变的PCR扩增图。图2是四种突变的DHPLC图，阴性对照只有引物峰，而突变者则有引物峰和突变峰两个峰。以上所述实施例只是本发明的较佳实例，而没有限制本发明的实施范围。因此，凡是根据本发明内容的实质所作出的等效修改，都应属于在本发明的保护范围内。