本发明涉及抗体纯化领域，具体涉及一种抗体酸性峰纯化的方法。
背景技术：
单克隆抗体在表达过程中，经过多种翻译修饰之后，会导致电荷异质性，体现在等电点不同，产生一系列不同等电点的抗体。经过高分辨率的离子交换柱分析，出现连续性的峰，而非单一的峰。电荷异质性影响到单克隆抗体的稳定性及生物学活性，因此在生产中，电荷异质性成为关键质量属性，需要严格控制。
由于电荷异质性差异非常小，很难通过一步层析就可以将抗体酸性峰降到可以接受的范围内。需要极高分辨率的离子交换填料，再配合其他的层析手段，比如亲和层析柱Protein A等。虽然Protein A层析效果对单克隆抗体的其他杂质如HCP、DNA、轻链等去除效果最佳，但对酸性峰的去除效果不如高分辨率的离子交换填料。配合高分辨率的离子交换填料GE公司的SP Sepharose High Performance，效果并不如意，且成本是非常昂贵的，GE公司的ProteinA通常需要十几万一升，使用寿命较短，另外，亲和填料含有蛋白A成分，使用后蛋白A会脱落引入新的杂质，需要建立检测蛋白A的方法和去除工艺。使用复合填料利用常规的去除方法，由于是满载上样，粒径较大，分辨率本身就不高，去除酸性峰的效果并不理想，给下游杂质的去除整加压力。
另外，使用其他填料的组合，如使用阳离子交换和阴离子交换，在常规方法去除抗体酸性峰的效果也不是很理想。目前，在控制抗体酸性峰的含量在医药纯化领域是一个普遍的难题。
技术实现要素：
本发明根据上述技术背景的不足，本文选用pall公司的MEP填料和弱阳离子作为纯化手段，有效降低酸性峰的含量，减少后续纯化的压力。
具体的，本发明提供了一套可适于抗体酸性峰的纯化工艺，在2～8℃下，包含以下步骤：
(1)使用Pall公司的MEP HyperCel填料，使用电导率由小变大的洗脱液洗脱，收集目标峰洗脱液，其中洗脱液中含有5～10mmol/L的苯丁酸钠；
(2)将步骤(1)中所述目标峰洗脱液进行弱阳离子层析，使用丁酸盐作为缓冲盐洗脱目标峰。
在一些实施方案中，弱阳离子层析的填料为CM Sephadex C-25、TOYOPEARL CM-650(S)、Uni CM-30S。
在弱阳离子的层析过程中，进行洗脱时的缓冲液其丁酸盐的浓度常为150～250mmol/L。
在另一些实施方案中，纯化工艺包含以下步骤：
(1)使用Pall公司的MEP HyperCel填料，上样平衡后，先使用pH6.5的30mmol/L柠檬酸盐缓冲液洗脱，再使用pH7.0的50mmol/L柠檬酸盐缓冲液洗脱，收集目标峰洗脱液，其中柠檬酸盐缓冲液中均含有5～10mmol/L的苯丁酸钠；
(2)将步骤(1)中所述目标峰洗脱液进行弱阳离子层析，平衡后使用pH7.0的200mmol/L丁酸盐缓冲液洗脱目标峰。
在一些实施方案中，丁酸盐为丁酸钠、丁酸钙、吲哚丁酸钾。
本发明的一些实施方案中，抗体是TNFα抗体或其抗原结合部分，如英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、Golimumab都是TNFα类抗体。
本发明有益效果在于：
a.该工艺具有去除酸性峰杂质效果好，产品回收率高等优点，样品可以直接上样，前处理工作较少，工艺简单易行仅通过两步层析，就可将酸性峰控制在11％～14％围内；
b.在低温条件下，通过在洗脱液中添加苯丁酸钠和丁酸盐，能有效对酸性峰进行分离，并且对浊度、宿主细胞等均有较好控制。
具体实施方式
以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。
实施例中所用的原料或耗材均可以通过商业途径或公知方法制备获得。实施方案中用到的层析系统为GE公司的AKTA purifer，色谱柱为Pall LRC15X080-200V01柱。实施方案中用到的色谱基质MEP-HyperCel为Pall公司的一款复合填料，具有疏水和离子交换两种机制，填料由4巯基乙基吡啶偶联刚性纤维素组成。CM Sephadex C-25(CM葡聚糖凝胶C-25)为弱阳离子交换机制，填料为羧甲基交联葡聚糖，TOYOPEARL CM-650(S)为TOSOH公司生产，填料为羧甲基交联聚甲基丙烯酸，Uni CM-30S为弱阳离子交换机制，填料为羧甲基交联聚丙烯酸酯。
本发明实施例中使用的是CHO细胞表达的阿达木单抗(adalimumab)的发酵液，将发酵罐下来的料液离心过滤后进行色谱纯化实验。本发明以下实施例是采用两步离心法，第一次离心用4000g/min，离心10min，将CHO细胞及大颗粒离心除去，收集上清液；第二次用8000g/min去除细胞碎片及细小颗粒，收集上清液。将离心后的料液板式过滤，经过浊度计检测料液浊度为6NTU，符合要求后用于以下实验。
实施例1
复合填料层析
a.准备：取料液(抗体浓度为2.18mg/ml)400ml，使用GE公司的层析系统AKTA purifer，选用Pall LRC15X080-200V01柱，内含25ml MEP HyperCel填料。样品和柱子始终保持在4℃。
b.平衡：平衡缓冲液为150mmol/LPBS(pH7.3)，保持流速为4.5ml/min。
c.上样：每毫升填料上样量为35mg抗体，上样体积约400ml。
d.冲洗：用150mmol/LPBS(pH7.3)的平衡缓冲液去冲洗至基线平稳。
e.洗脱：分两步洗脱，洗脱缓冲液一为：30mmol/L柠檬酸盐+10mmol/L苯丁酸钠(pH6.5)，洗脱出一个峰为酸性峰杂质舍弃。待平衡后，用洗脱缓冲液二：50mmol/L柠檬酸盐+10mmol/L苯丁酸钠(pH7.0)进行洗脱，分离出来一个高大的峰，收集第二个峰，大约得到40ml。
检测酸性峰的方法参考文献《离子交换色谱对抗VEGFR2单抗的电荷异质性分析》中的检测方法，使用高分辨率的离子交换柱对目的抗体进行检测。
计算抗体的收率为93.54％，检测酸性峰的含量为20.71％。
弱阳离子GE CM Sephadex C-25层析
a.准备：加水稀释，加入约1.2倍的水，用丁酸调节pH至7.0，将稀释后的料液用不锈钢板式过滤器Millipore过0.20μm的滤膜，得到90ml样品(抗体浓度为9.10mg/ml)。样品和柱子始终保持在4℃。使用GE公司的层析系统AKTA purifer，选用Pall LRC15X080-200V01柱，内含27ml GE公司的CM Sephadex C-25(Capto SP ImpRes)填料。
b.平衡：平衡缓冲液为60mmol/LPBS(pH7.0)，保持流速为4ml/min。
c.上样：每毫升填料上样量为30mg抗体，上样体积约90ml。
d.冲洗：用50mmol/L丁酸盐缓冲液(pH7.0)的冲洗缓冲液去冲洗至基线平稳。
e.洗脱：用200mmol/L丁酸盐缓冲液(pH7.0)进行洗脱，洗脱出一个峰，对该峰进行分段收集，半峰高之前的峰不收集，半峰高后开始收集，收集至200mAu开始停止。
检测方法同上，计算抗体的收率为75.31％，检测酸性峰的含量为13.72％。
实施例2
复合填料层析
a.准备：取料液(抗体浓度为2.5mg/ml)350ml，使用GE公司的层析系统AKTA purifer，选用Pall LRC15X080-200V01柱，内含25ml MEP HyperCel填料。样品和柱子始终保持在4℃。
b.平衡：平衡缓冲液为150mmol/LPBS(pH7.3)，保持流速为4.2ml/min。
c.上样：每毫升填料上样量为35mg抗体，上样体积约350ml。
d.冲洗：用150mmol/LPBS(pH7.3)的平衡缓冲液去冲洗至基线平稳。
e.洗脱：分两步洗脱，洗脱缓冲液一为：30mmol/L柠檬酸盐+8mmol/L苯丁酸钠(pH6.5)，洗脱出一个峰为酸性峰杂质舍弃。待平衡后，用洗脱缓冲液二：50mmol/L柠檬酸盐+8mmol/L苯丁酸钠(pH7.0)进行洗脱，分离出来一个高大的峰，收集第二个峰，大约得到38ml。
检测酸性峰的方法参考文献《离子交换色谱对抗VEGFR2单抗的电荷异质性分析》中的检测方法，使用高分辨率的离子交换柱对目的抗体进行检测。
计算抗体的回收率达到91.37％，经检测酸性峰的含量达到19.72％。
弱阳离子GE CM Sephadex C-25层析
a.前处理：加水稀释，加入约1.2倍的水，用丁酸调节pH至7.0，将稀释后的料液用不锈钢板式过滤器Millipore过0.20μm的滤膜，得到90ml样品(抗体浓度为8.75mg/ml)。使用GE公司的层析系统AKTA purifer，选用Pall LRC15X080-200V01柱，内含27ml GE公司的CM Sephadex C-25(Capto SP ImpRes)填料。样品和柱子始终保持在4℃。
b.平衡：平衡缓冲液为60mmol/LPBS(pH7.0)，保持流速为4ml/min。
c.上样：每毫升填料上样量为29mg抗体，上样体积约90ml。
d.冲洗：用50mmol/L丁酸盐缓冲液(pH7.0)的冲洗缓冲液去冲洗至基线平稳。
e.洗脱：用200mmol/L丁酸盐缓冲液(pH7.0)进行洗脱，洗脱出一个峰，对该峰进行分段收集，半峰高之前的峰不收集，半峰高后开始收集，收集至200mAu开始停止。
检测方法同上，计算抗体的收率为75.31％，检测酸性峰的含量为12.44％。
实施例3
复合填料层析
a.准备：取料液380ml，抗体浓度为2.24mg/ml，使用GE公司的层析系统AKTA purifer，选用Pall LRC15X080-200V01柱，内含25ml MEP填料。样品和柱子始终保持在4℃。
b.平衡：平衡缓冲液为150mmol/LPBS(pH7.3)，保持流速为4.5ml/min。
c.上样：每毫升填料上样量为34mg抗体，上样体积约380ml。
d.冲洗：用150mmol/LPBS(pH7.3)的平衡缓冲液去冲洗至基线平稳。
e.洗脱：分两步洗脱，洗脱缓冲液一为：30mmol/L柠檬酸盐+5mmol/L苯丁酸钠(pH6.5)，洗脱出一个峰为酸性峰杂质舍弃。待平衡后，用洗脱缓冲液二：50mmol/L柠檬酸盐+5mmol/L苯丁酸钠(pH7.0)进行洗脱，分离出来一个高大的峰，收集第二个峰，大约得到40ml。
检测酸性峰的方法参考文献《离子交换色谱对抗VEGFR2单抗的电荷异质性分析》中的检测方法，使用高分辨率的离子交换柱对目的抗体进行检测。
计算抗体的收率为92.88％，检测酸性峰的含量为19.04％。
弱阳离子GE CM Sephadex C-25层析
a.准备：加水稀释，加入约1.2倍的水，用丁酸调节pH至7.0，将稀释后的料液用不锈钢板式过滤器Millipore过0.20μm的滤膜，得到88ml样品(抗体浓度为8.90mg/ml)。使用GE公司的层析系统AKTA purifer，选用Pall LRC15X080-200V01柱，内含27mlGE公司的CM Sephadex C-25填料。样品和柱子始终保持在4℃。
b.平衡：平衡缓冲液为60mmol/LPBS(pH7.0)，保持流速为4ml/min。
c.上样：每毫升填料上样量为29mg抗体，上样体积约88ml。
d.冲洗：用50mmol/L丁酸盐缓冲液(pH7.0)的冲洗缓冲液去冲洗至基线平稳。
e.洗脱：用200mmol/L丁酸盐缓冲液(pH7.0)进行洗脱，洗脱出一个峰，对该峰进行分段收集，半峰高之前的峰不收集，半峰高后开始收集，收集至200mAu开始停止。
检测方法同上，计算抗体的收率为73.84％，检测酸性峰的含量为11.89％。