本发明属于生物领域，具体涉及一种定量检测猪瘟病毒igg抗体竞争elisa试剂盒及其检测方法。
背景技术：
猪瘟(csf)是由猪瘟病毒(csfv)引起的是严重威胁养猪业，可导致各生长阶段猪的死亡，给养猪业造成经济损失。csfv同属还包括有牛病毒性腹泻病毒和羊边界病毒，其中csfv与牛病毒性腹泻病毒血清之间存在交叉反应。csfv是有囊膜的rna病毒，基因组长约12.3kb，含一个开放式阅读框架(orf)，翻译成一条约含3898个氨基酸残基的多聚前体蛋白，其中c、erns(e0)、e1、e2为结构蛋白，e2蛋白是研制csfv血清抗体诊断试剂的首选抗原。
近年来，国内自主研发的用于检测csfv血清抗体的试剂盒在猪瘟防控方面起到了重要作用，但核心技术缺乏直接导致国产诊断试剂与国外同类产品之间存在显著差异，不仅体现在价格上，还存在产品的稳定性差，包括批间和批内的变异系数过大、试剂的保质期较短、操作程序不友好等问题。更为重要的是，出口csfv抗体检测试剂盒的国家都是“灭猪瘟的地区”，这些试剂盒均以抗体定性为判定标准，不适合于我国猪瘟的防控现状。我国采取接种猪瘟弱毒疫苗的免疫防控策略，猪瘟疫苗免疫覆盖率几乎达到100％，需要的是能够评估疫苗免疫过程中抗体消长规律的诊断产品。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种定量检测猪瘟病毒igg抗体竞争elisa试剂盒，以解决现有csfv血清抗体检测elisa试剂盒存在的稳定性差和保质期短等问题。
本发明的另一个目的是提供一种用定量检测猪瘟病毒igg抗体竞争elisa试剂盒进行检测的方法。
本发明技术方案如下：一种定量检测猪瘟病毒igg抗体竞争elisa试剂盒，将特异性鉴定和筛选来自猪瘟病毒疫苗株c-株编码的e2蛋白两个重复的抗原结构域a通过柔性氨基酸接头、半胱氨酸、疏水氨基酸进行融合串联，并在大肠杆菌e.coli中成功获得重组表达蛋白，重组蛋白命名为r2e2，以其作为抗原建立的定量检测抗猪瘟病毒e2蛋白igg抗体竞争elisa试剂盒；试剂盒包括抗原包被板、血清样品稀释液、洗涤液、tmb底物液、终止液；抗原包被板包括预包被r2e2抗原、抗原稳定剂、酶标板、封闭液、标准igg样品；所述抗原为：5`-domaina-tgt-da15-linker-da15-tgt-domaina-3`或氨基酸：5`-domaina-cys-lys5-linker-lys5-cys-domaina-3`。此为优化的抗原组合模式，可以高效的结合血清中的抗csfv病毒的igg抗体；抗原在大肠杆菌中实现可溶性表达，并进行纯化、回收。(制备研制elisa试剂盒的重组抗原
优选的，酶标板所包被抗原的包被浓度为1ng～10ng/ml。获得最佳的抗原包
被量，有助于节约成本，降低非特异性反应的发生。
优选的，抗原稳定剂组成为，体积浓度为0.01％多聚甲醛pbs缓冲液，50μl/孔，室温，作用5min。0.01％多聚甲醛可很好固定r2e2抗原，同时不会影响其与igg抗体的结合能力，确保抗原在保质期内不发生降解，延长试剂盒的保存期限.
优选的，封闭液组分为质量浓度为0.5-10％蔗糖、质量浓度1.0-8.0％明胶、质量浓度0.1-6.0％的酪蛋白，1×pbst，ph7.2，200μl/孔。目的：封闭液中的明胶、酪蛋白和海藻糖可以结合酶标板中抗原未能吸附的剩余位置，使整个孔底部都被蛋白覆盖，阻断待检测样品中存在的蛋白或者抗体与酶标板中剩余位置发生结合，导致非特异性反应的发生，并且添加的海藻糖是一种耐热保护剂，可以抵抗因温度变化导致包被板子上的抗原包降解，延长包被板的保存期限。
优选的，hrp-igg酶标记抗体在elisa中的工作浓度为1∶10,000～1∶100,000，hrp-igg质量含量为0.425ng/ml～4.25ng/ml。获得最佳的hrp-igg竞争抗体的工作浓度。
优选的，标准igg样品为0μg/ml，15μg/ml，50μg/ml，250μg/ml样品和待检测血清样本，均以50μl/孔加入到对应孔中，同时加入100μl/孔酶标记抗体hrp-igg，37℃孵育60min。用于制备标准曲线，计算样本中的igg质量含量，从而获得样品中抗csfv的igg抗体的质量含量。
优选的，tmb底物液反应体积为100μl/孔，避光室温作用25-30min显色，tmb底物液为底物a和底物b按照1:1混合使用，底物a为5mg/mldmso溶液；底物b为500ml双蒸水溶解13.608gch3coona·3h2o，用1mol/l柠檬酸调ph至6.0，加入1ml30％双氧水，定容至1000ml。tmb在hrp-igg上的hrp在双氧水的催化下显色，颜色的深浅与样品中靶抗体含量有关。
优选的，所述的终止液为1.5mol/lh2so4，50μl/孔。
一种用定量检测猪瘟病毒igg抗体竞争elisa试剂盒进行检测的方法，包括以下步骤：
(1)样品检测，在相应微孔中分别加入50μl的标准品和待测血清标本，然后在所有孔中加入100μl/孔酶结合物hrp-igg；
(2)孵育，加样完成后，用pet封口贴密封微孔板，使用微量振荡器震动30秒或者手工在实验操作台上摇晃60秒混匀，将已密封微孔板放置于37℃孵育60min；
(3)洗涤，孵育完毕后，弃尽微孔内液体，1×pbst洗板5次，洗涤结束后拍干微孔壁内残余液体；
(4)tmb显色，底物a和底物b按1∶1比例混匀，100μl/孔，混合30秒，室温避光静置30min显色；
(5)终止，取出微孔板，此时明显看到各微孔内呈现不均一的蓝色，每孔加入50μl的1.5molh2so4终止液，轻微混匀，此时各微孔内的蓝色渐变为黄色；(6)结果判定，实验结果成立条件为：当0μg标准品od450nm＞1.8，且标准品od450nm吸光度值按照0μg/ml，15μg/ml，50μg/ml，250μg/ml呈递减趋势，判定实验成立。
优选的，结果计算方法为，
(1)百分结合率计算公式：设0μgigg标准品管计数为b0，各标准管或样品管计数为b，b/b0×100％
(2)logit值计算公式：logit＝ln(b/b0)/(1－b/b0)
(3)绘图计算：以标准浓度取log值为横坐标，对应的logit值为纵坐标在普通坐标纸上或以标准浓度为横坐标，对应的b/b0为纵坐标在logit-log坐标纸上画出标准曲线；根据待测样品的b/b0从坐标纸上查出样品的浓度值；如果使用普通坐标纸，查出的数值应取反对数才是最后的浓度值；在log-logit坐标纸上绘图，坐标纸上横轴从左至右第一个1-9表示为第一个10进位，第二个1-9表示为第二个10进位；第三个1-9表示为第三个10进位；坐标纸纵轴为百分比，即各标准吸光值的百分结合率；画一条通过各点的直线，要求尽可能多的点在线上，同时剩余的点均匀分布在直线的两边；样品也同样由吸光值计算百分结合率，再从纵轴上的相应结合率找到直线上的点，此点对应的横坐标浓度即为样品的浓度；
(4)血清样品反应的结论为：
4.1当弱毒疫苗免疫个体igg抗体质量含量≥100μg/ml，免疫合格；
4.2当弱毒疫苗免疫个体igg抗体质量含量在20μg/ml～50μg/ml免疫不合格，建议加强免疫后再进行igg抗体检测；
4.3当弱毒疫苗免疫个体igg抗体质量含量≤20μg/ml，免疫失败。
本发明定量检测抗猪瘟病毒e2蛋白igg抗体竞争elisa试剂盒，可对猪瘟疫苗免疫产生的抗e2蛋白igg抗体进行定量检测。更为关键的是，本试剂盒的检测结果能够反应接种疫苗过程中，机体抗csfv血清igg抗体变化规律，为养猪户csf防控提供科学合理的技术支持。
研究表明，重组r2e2与完整csf病毒抗原具有相似的结合猪瘟血清抗体功能，酶标板所包被抗原在间接elisa试验中证实与牛病毒性腹泻阳性血清无交叉反应，为csfv血清抗体特异性抗原。同时，将重组r2e2抗原制备的兔抗高免血清中的igg，通过碘酸钠法标记上辣根过氧化物酶(hrp)，以其作为竞争抗体，研制可定量检测csf病毒igg抗体竞争elisa试剂盒。田间血清样品检测结果证实，本发明所涉及方法可定量检测csf疫苗免疫后血清中igg的含量，为制定合理的猪瘟疫苗免疫计划提供可靠检测方法。
附图说明
图1是一种定量检测猪瘟病毒igg抗体竞争elisa试剂盒的实验原理图。
具体实施方式
下面对本发明做进一步说明，但不以任何方式限制本发明。
采用人工基因合成方式获得融合e2抗原表位基因序列。csfv疫苗株e2基因抗原结构域a区段(domaina:766aa～866aa)；两个重复抗原结构域区段用柔性接头(linker)序列(ggtggcggaggatccggtggcggaggatcc，编码氨基酸ggggsggggs)连接；linker的5`和3`端各添加15个连续的a(da15，编码亲水性5个赖氨酸，lys)和1个半胱氨酸(cys)，确保两个结构域独自发挥功能。其中cys和lys的组合可显著提高水溶性蛋白表达效率，融合基因模式为：5`-domaina-tgt-da15-linker-da15-tgt-domaina-3`(氨基酸表示为：5`-domaina-cys-lys5-linker-lys5-cys-domaina-3`)。将人工合成目的核苷酸序列酶切，与pgex6p-1表达载体连接，重组质粒命名为r2e2，转化bl21(star)感受态细胞，iptg诱导表达和亲和层析纯化重组融合蛋白，作为检测方法的包被抗原。
1、重组r2e2抗原的制备
1.1基因合成：以猪瘟兔化弱毒疫苗株的e2基因作为亲本基因，截取e2基因抗原结构域a区段(766aa～866aa)，两端加ecori和xhoi限制性酶切位点，将设计好基因组合5`-domaina-tgt-da15-linker-da15-tgt-domaina序列送上海捷瑞生物工程有限公司进行基因合成。
1.2重组表达载体的构建和鉴定
(lb液体和固体培养基，抗性/浓度，amp+/100μg/ml)
将r2e2片段从克隆载体上酶切、回收、纯化，与pgex6p-1载体按照载体和目的片段摩尔比≈1∶3混合后用t4dna连接酶16℃连接过夜，转化dh5a感受态细胞，在lb平板培养12～18h。挑取单克隆，增菌后提取质粒进行酶切鉴定和pcr鉴定，鉴定得到的阳性重组质粒转化表达菌株bl21(star)感受态细胞，重组质粒命名为r2e2。
1.3r2e2蛋白重组表达和鉴定
1)挑取5个单克隆菌株，接种到5个5mllb液体培养基试管中，220r/min，37℃过夜振荡培养；然后分别从5管中取50μl菌液转接新的lb液体培养基试管中，220r/min，培养2.5h至od600≈0.5～0.6，在其中的4个管中加入iptg的终浓度分别为0.3mol/l、0.4mol/l、0.5mol/l、1.0mol/l,剩余1管作为诱导对照，37℃200r/min振荡诱导培养5h。
2)sds-page鉴定重组r2e2蛋白：收集菌体，超声，10000r/min离心3min，在上清和沉淀中分别加入100μltris(ph6.8)，100℃煮5min，10000r/min离心15min。配制12％的sds-page蛋白质电泳凝胶，每个样品加10μl，加入标准蛋白分子量marker6μl，80v浓缩胶，120v分离胶，胶块考马斯亮蓝染色，脱色后观察到r2e2蛋白实现可溶性表达。
3)westernblotting：结果表明，重组r2e2融合蛋白可以被猪瘟阳性血清识别，具有良好的特异性。
4)间接elisa实验血清抗体检测比较重组r2e2与csfv抗原结合活性
将浓度为3.85μg/ml纯化r2e2重组蛋白包被96孔板；同时以灭活的csfv疫苗抗原(细胞源)包被elisa板作为阳性对照。
按照间接elisa操作模式，以5份(s1～s5)已知csf抗体阳性血清(p)和已知无猪瘟特异性抗体的1份阴性血清(n)作为第一抗体，以2份牛源牛病毒性腹泻(bvdv)抗体阳性血清(b1,b2)和1份阴性牛血清(b0)作为交叉反应样品，上述样品均作1∶50稀释与两种抗原相互作用,血清作2孔重复，重复测3次，取平均值计算p/n值。以辣根过氧化物酶(hrp)标记兔抗猪igg为第二抗体，tmb为底物，酶标仪吸光度od450nm波长读结果，计算结果见表1。
表1：重组r2e2抗原和猪瘟全病毒抗原活性比较
验证重组抗原r2e2的方法，依据间接elisa血清抗体检测方法判断公式：阳性血清判定标准：阳性血清od450值/阴性血清od450nm值〉2.1(即p/n>2.1)，该血清样品即为阳性。表1所描述的p/n值结果说明，重组r2e2抗原和csfv疫苗抗原具有相近的与阳性血清反应的能力，重组r2e2抗原可以替换全病毒抗原用于研制csfv血清抗体的检测方法。根据表1计算bvdv血清样品与r2e2抗原和csfv疫苗抗原检测结果发现，因为r2e2是由串联csfv特异性抗原表位组成，与bvdv阳性血清无交叉反应；反之，因csfv完整抗原e2蛋白上存在与bvdv血清抗体交叉反应的抗原表位，所以导致结果呈阳性。综上，利用串联2个重复csfv特异想抗原表位的r2e2蛋白作为检测抗原，不但可以用于csfv血清抗体检测，还可以消除与bvdv阳性血清的交叉反应。
2、兔抗r2e2抗原高免血清、igg纯化、标准品制备及hrp标记igg
2.1兔抗r2e2抗原高免血清制备
选用4kg左右健康清洁级新西兰白兔3只，首免用弗氏完全佐剂乳化抗原，120μg/只背部皮下和后肢肌肉多点免疫。加强免疫用弗式不完全佐剂乳化30μg抗原/只，每2～3周加强免疫一次，直到琼脂糖扩散实验达到1∶64时(使用抗原为猪瘟疫苗毒抗原)，即可收集血清用于igg抗体纯化。
2.2igg抗体的纯化(硫酸铵沉淀法)
(a)血清准备：取20ml兔血清，加生理盐水20ml，逐滴加入(nh4)2so4饱和溶液10ml至20％(nh4)2so4溶液，边加边搅拌充分混合，静置30min。
(b)除纤维蛋白：4℃，3000r/min，离心20min，弃去沉淀，既得除去纤维蛋白的血清。
(c)(nh4)2so4沉淀igg：在步骤(b)处理后的上清液中再加(nh4)2so4饱和溶液30ml，使成50％(nh4)2so4溶液，充分混合，静置30min，而后3000r/min，4℃离心20min，弃上清。
(d)溶解沉淀：加20ml生理盐水溶解沉淀，加入保存于4℃的(nh4)2so4饱和溶液10ml，使成33％(nh4)2so4，充分混合，静置30min。4℃，3000r/min，离心20min，弃上清，以除去白蛋白。重复此步骤，2-3次。用10ml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋，在常水中透析过夜，然后在生理盐水中于4℃透析24h，过程中换液数次。离心去除杂蛋白，上清液即为粗提igg。
(e)获取高纯度igg：过deae－纤维素层析柱。以0.01mol/lpbs(ph7.4)和0.03mol/lnacl洗脱，收集洗脱液，即为高纯度igg抗体。
(f)igg纯度鉴定--免疫电泳鉴定：孔内加待测样品，电泳后，在槽内加抗igg血清，琼脂扩散24h，观察结果。出现一条弧形的沉淀线，且沉淀线位于γ—球蛋白区，证明igg纯度符合实验预期。
(g)igg的定量及保存
用紫外吸收法定量纯化后igg含量。根据公式(mg/ml)＝1.55×a280—0.75×a260计算含量。分装纯品igg1mg/ml，冻干后4℃保存。
2.3用于定量igg标准品的制备。
将纯品igg用0.1molpbs(ph7.2)稀释成0μg/ml，15μg/ml，50μg/ml，250μg/ml等4个浓度，作为竞争elisa定量血清样品中igg抗体含量的标准品。
2.4制备hrp-igg竞争抗体
称取5mghrp溶解于1ml蒸馏水中，加入0.2ml新配的0.1mnaio4溶液，室温下避光搅拌20min。将上述溶液装入透析袋，在1mm的醋酸钠(ph4.4)缓冲液4℃过夜透析。加20μl0.2m碳酸盐(ph9.5)缓冲液，调hrp溶液ph值到9.0～9.5。立即在1ml0.01m碳酸盐缓冲液中再次加入5mgigg，室温避光轻轻搅拌2小时。加0.1ml新配的4mg/mlnabh4液，混匀，置4℃2h。将上述液装入透析袋中，对0.15mpbs(ph7.4)透析，4℃过夜。在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，4℃沉淀1h。3000rpm/min,离心30min，弃上清。沉淀物用半饱和(nh4)2so4洗二次，沉淀物溶于0.15m的pbs(ph7.4)中。将上述溶液装入透析袋中，对0.15m的pbs(ph7.4)缓冲液透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm/min,离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，加入40％甘油于-20℃保存。
利用公式计算hrp-igg量：igg量(mg/ml)＝(od280nm-od403nm×0.3)×0.62将定量的酶标记抗体，1ml/瓶分装标定好效价的hrp-igg抗体，标签上注明批次、效价、制备时间和数量，置于-70℃保存备用。
2.5hrp-igg竞争抗体工作浓度滴定
用棋盘滴定法滴定“2.4”hrp标记igg抗体在elisa中工作浓度，确定工作浓度为1∶100,000(hrp-igg质量含量为4.25ng/ml)。
3、一种定量检测猪瘟病毒igg抗体竞争elisa方法的建立
3.1r2e2抗原包被和固定
1)抗原包被
用50mmol/l碳酸盐缓冲液(ph9.6)将纯化r2e2抗原稀释成4.26ng/ml,100μl/孔加入酶标板中，封口膜密封，置室温孵育24h。弃去孔内液体，300μl/孔1×pbst(ph7.2)洗涤液洗涤3次，最后一次拍干。
2)抗原固定
加入50μl/孔抗原稳定缓冲液(体积浓度为0.01％多聚甲醛，0.01mpbs，ph7.2)，室温作用5min，用1×pbst洗涤5次，拍干。
3)封闭抗原预包被板
加入200μl/孔封闭液(0.8％蔗糖、质量浓度1.25％明胶、质量浓度0.8％酪蛋白，1×pbst，ph7.2)室温作用30min，1×pbst洗涤3次后拍干，彻底干燥微孔板后，加入干燥剂和抽真空密封，即为抗原包被板。
3.2样品检测
1)加样
在相应微孔中分别加入50μl的标准品(建议：纵向加样：0μg/ml，15μg/ml，50μg/ml，250μg/ml)和待测血清标本，然后在所有孔中加入100μl/孔酶结合物(hrp-igg)。
2)孵育
加样完成后，用pet封口贴密封微孔板，使用微量振荡器震动30秒或者手工在实验操作台上向左右轻轻平行摇晃60秒混匀。将已密封微孔板放置于37℃孵育60min。
3)洗涤
孵育完毕后，弃尽微孔内液体，1×pbst洗板5次。洗涤结束后用吸水纸拍干微孔壁内残余液体，并将微孔板外部液体与指纹擦拭干净。
4)tmb显色
底物a和底物b按1∶1比例混匀(底物溶液a：tmb浓度为5mg/mldmso溶液；底物b：500ml双蒸水溶解13.608gch3coona·3h2o，用1mol/l柠檬酸调ph至6.0，加入1ml30％双氧水，定容至1000ml)，100μl/孔，自动或手动混合30秒，室温避光静置30min显色。
5)终止
取出微孔板，此时可以明显看到各微孔内呈现不均一的蓝色，每孔加入50μl的1.5molh2so4终止液，轻微混匀。此时各微孔内的蓝色渐变为黄色。
6)测量
将已终止反应的微孔板置于酶标仪读数槽内，使用检测波长450nm与参考波长630nm的双波长测量读取各孔的吸光度值。数据读取应在30min内完成。
3.3结果判定
1)实验成立条件
当0μg标准品od450nm＞1.8，并且标准品od450nm吸光度值按照0μg/ml，15μg/ml，50μg/ml，250μg/ml呈递减趋势，判定实验成立。
2)结果计算
●百分结合率计算公式：设s0(0μg/ml)管计数为b0，各标准管或样品管计数为b。b/b0×100％
●logit值计算公式：logit＝ln(b/b0)/(1－b/b0)
●手工绘图计算：以标准浓度取log值为横坐标，对应的logit值为纵坐标在普通坐标纸上或以标准浓度为横坐标，对应的b/b0为纵坐标在logit-log坐标纸上画出标准曲线(理想化时是一条直线)。根据待测样品的b/b0可以从坐标纸上查出样品的浓度值。如果使用普通坐标纸，查出的数值应取反对数才是最后的浓度值。在log-logit坐标纸上绘图，坐标纸上横轴从左至右第一个1-9表示为第一个10进位，第二个1-9表示为第二个10进位。第三个1-9表示为第三个10进位。坐标纸纵轴为百分比，即各标准吸光值的百分结合率。画一条通过各点的直线，要求尽可能多的点在线上，同时剩余的点均匀分布在直线的两边。样品也同样由吸光值计算百分结合率，再从纵轴上的相应结合率找到直线上的点，此点对应的横坐标浓度即为样品的浓度。
3)结果判定
◆当弱毒疫苗免疫个体igg抗体质量含量≥25μg/ml，免疫合格；
◆当弱毒疫苗免疫个体igg抗体质量含量在15μg/ml～25μg/ml免疫不合格，建议加强免疫后再进行igg抗体检测；
◆当弱毒疫苗免疫个体igg抗体质量含量＜15μg/ml，免疫失败。
4、田间猪血清样品检测实例
用本发明所涉及elisa检测试剂抽检猪瘟疫苗免疫首免21天时的37份育肥猪血清样品的抗e2蛋白的igg抗体。依据本试剂盒检测结果发现，4份igg抗体含量在15μg/ml～25μg/ml之间，属于疫苗免疫不合格范畴，占被检血清样品总数的10.81％；igg抗体含量大于25μg/ml免疫合格样品有33份样品，占样品总数89.19％，没有检测到抗e2抗体igg质量含量＜15μg/ml的样品(表2)。本检测结果符合我国猪瘟疫苗的免疫实际情况。我国2016年之前，我国采取猪瘟疫苗强制免疫计划，猪瘟疫苗免疫覆盖率几乎达到100％，抗体合格率在85％以上，已经有效控制了猪瘟对猪只健康的危害。猪瘟防疫已经植根于是每个养猪户的防疫计划中，即使国家相关部门不强制进行疫苗接种，养猪户也会对所有猪定期进行疫苗免疫，预防猪瘟发生。
表2定量检测猪瘟病毒igg抗体竞争elisa试剂盒田间检测实例