本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种口蹄疫抗体检测试剂盒、检测方法及其应用。
背景技术：
口蹄疫(FMD)是猪、牛、羊等偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，易感动物达70多种。临床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱性疹。该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大政治、经济损失。鉴于此，世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类传染病之首。目前，有三分之二的OIE成员国流行FMD，时刻威胁着无FMD国家和地区的家畜安全和畜产品贸易。
口蹄疫的防治一般通过注射疫苗来实现，但由于动物物种差异或个体差异，不同个体的免疫的效果不一致。为了检测免疫效果，需进行口蹄疫抗体的检测。
现有的口蹄疫抗体检测试剂盒检测灵敏度较低、特异性较差，无法满足高通量样本的检测需求。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提供了一种口蹄疫抗体检测试剂盒，其能解决现有检测试剂盒灵敏度较低、特异性较差的技术问题。
其技术方案是这样的，其包括包被板、抗原抗体反应板、抗原、口蹄疫兔抗工作液、羊抗兔IgG-HRP工作液、阳性质控血清、阴性质控血清、样本稀释液、洗液和底物，其特征在于：所述包被板为链霉亲和素包被板，所述抗原为生物素化的口蹄疫病毒抗原。
进一步的，所述链霉亲和素包被板由2～20μg/mL的链霉亲和素，100μl/孔，包被形成。
进一步的，所述口蹄疫兔抗工作液为含有2～10μg/ml口蹄疫兔多抗、1wt％酪蛋白的PBS缓冲液，pH为7.2～7.4。
进一步的，所述羊抗兔IgG-HRP工作液为含有0.5～2.5μg/ml羊抗兔IgG-HRP、1wt％酪蛋白的PBS缓冲液，pH为7.2～7.4。
进一步的，所述阴性质控血清为未感染口蹄疫病毒的偶蹄动物血清，抗体检测效价小于1：8；所述阳性质控血清为阴性质控血清添加20～50μg/mL的口蹄疫多抗制得，抗体检测效价大于1:720。
进一步的，所述样本稀释液为含有1wt％酪蛋白的PBS缓冲液，pH为7.2～7.4。
进一步的，所述洗液为20倍的浓缩洗液，所述20倍的浓缩洗液为含18wt％NaCl、1wt％Tween20和1wt％Proclin300的Tris-HCl缓冲液，pH为7.4～7.6。
进一步的，所述底物包括底物A和底物B；所述底物A为含有1.26wt％N,N-二甲基甲酰胺、5.85mmol/L鲁米诺、9.86mmol/L四苯硼钠和1.06mg/L对乙酰氨基酚的Tris-HCl缓冲液，pH为8.8～9.0；所述底物B为含0.615mg/mL过硼酸钠的Tris-HCl缓冲液，pH为4.8～5.0。
本发明还提供了上述口蹄疫抗体检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
(1)在抗原抗体反应板中，使用样本稀释液对待测血清样本、阳性质控血清、阴性质控血清进行倍比稀释，50μl/孔，所述待测血清样本、阳性质控血清、阴性质控血清的稀释范围分别为(1：4～1：512)、(1：8～1：1024)、(1：2～1：4)，抗原对照设置4孔，分别加入50μl样本稀释液；
(2)加入生物素化的口蹄疫病毒抗原工作液(2μg/ml)，50μl/孔，振荡，37℃温育60分钟；
(3)将反应液转移至链霉亲和素包被板中，50μl/孔，37℃温育30分钟；
(4)洗板，甩干，向链霉亲和素包被板中加入口蹄疫兔抗工作液，50μl/孔，37℃温育30分钟；
(5)洗板，甩干，向链霉亲和素包被板中加入羊抗兔IgG-HRP工作液，50μl/孔，37℃温育30分钟；
(6)洗板，甩干，加入底物A和底物B，50μl/孔，测定相对光强度(RLU)；
(7)判定待测血清的效价：抗原对照的4孔，弃去最高和最低RLU值，计算剩余2孔的平均RLU值，以55％～75％抗原对照平均值为临界值；待检血清RLU值大于临界值的孔为阴性孔，小于等于临界值的孔为阳性孔；若临界值与稀释倍数最高阳性孔的RLU相同，则以待检血清阳性孔的最高稀释倍数作为该血清的抗体效价；若临界值处于2个稀释孔RLU之间，抗体效价取相邻阳性孔和阴性孔稀释倍数的反对数中间值。
进一步的，检测认可标准为：病毒抗原对照RLU值应在8000000至15000000范围内，阳性质控血清抗体效价应大于1:720，阴性质控血清抗体效价应小于1:8。
本发明还提供了上述检测试剂盒在口蹄疫抗体检测中的应用。
实验表明，本发明的上述检测试剂盒相较于现有的口蹄疫抗体检测试剂盒、灵敏度较高、特异性较好，能够满足高通量样本的检测需求。
具体实施方式
主要试剂说明：
口蹄疫病毒抗原，为O型，购自杭州启泰生物技术有限公司，编号为KT01。
羊抗兔IgG-HRP，购自杭州启泰生物技术有限公司，编号为HRP-GRI06。
阴性质控血清，来源于家猪养殖厂，为未感染口蹄疫病毒的猪血清样本。
市售ELISA试剂盒，为瑞士Pronics公司的O型口蹄疫抗体检测试剂盒。
干扰样本S1～S3，来源于家猪养殖厂，为注射加强双价口蹄疫疫苗(包含O型口蹄疫疫苗及亚洲I型口蹄疫疫苗)的猪血清样本。
待测样本1～10，来源于家猪养殖场，为注射O型口蹄疫疫苗的猪血清样本。
生物素化的口蹄疫病毒抗原，制备过程如下：
1.样品准备
1.1Buffer配制
缓冲液A：PB缓冲液，pH 7.4；
缓冲液B：PBS缓冲液，pH 6.0。
1.2抗原配制
取1ml口蹄疫病毒抗原(200μg/mL)，用缓冲液A进行脱盐换液。
1.3NHS-LC-LC-Biotin溶液配制
称取1mg NHS-LC-LC-Biotin，加入200μl缓冲液A溶解，使质量浓度为5mg/ml。
2.标记纯化
2.1标记
取40μl的NHS-LC-LC-Biotin溶液加入到抗原溶液中，混匀，在20℃下反应1h，投料比(质量比)为1：1。
2.2纯化
待反应结束后，将反应溶液进行透析，透析缓冲液为缓冲液B，透析3次，每次3h，每次1000ml；透析环境为4℃，使用磁力搅拌器保证透析速率。
3.检测
利用考马斯亮蓝法测定抗原浓度。
3.1蛋白标准品的准备
取蛋白标准品(BSA)完全溶解于缓冲液B中，使终浓度为0.5mg/ml。
3.2蛋白浓度测定
a.将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl，相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。
b.加适当体积样品到96孔板的样品孔中；
c.各孔加入200μl G250染色液，室温放置3～5min；
d.用酶标仪测定A595nm的吸光度；
e.根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品中的蛋白浓度。
实验布置如表1所示。
表1：
原始数据如表2所示。
表2：
扣除空白值后的数据如表3所示。
表3：
根据表3数据，测得蛋白定量标准曲线为y＝0.0013x+0.0962，R2＝0.970，计算所得生物素化的口蹄疫病毒抗原浓度为117.5μg/ml。
口蹄疫兔多抗，
1.其制备过程下：
免疫原，取灭活的O型口蹄疫病毒与等量的佐剂混合成稳定乳状液，配制时，灭活的O型口蹄疫病毒通过无菌生理盐水稀释；免疫动物，健康雄性新西兰大白兔2只；初免使用弗氏完全佐剂，二免及以后使用弗氏不完全佐剂，免疫剂量为300μg/只，皮下注射，初免2周后进行二免，二免及以后间隔均为2周。
2.兔子免疫效果监测：
参数：口蹄疫抗原100ng/孔包被，兔多抗血清1：100稀释，HRP-GRI06 1:5000稀释。
监测数据如表4所示。
表4：
表4显示，1号兔子在第5周达到平台期，2号兔子在第6周也达到平台期，均可进行血清采集。
3.最终采集血清的滴度检测(4免后采集血清，第7周)：
参数：口蹄疫抗原100ng/孔包被，兔多抗血清梯度稀释，HRP-GRI06 1:5000稀释使用。
检测结果如表5所示。
表5：
表5显示：两只兔子血清滴度均达到1：100000，该多抗可用于后续试剂盒的研发。
实施例1：
一种口蹄疫抗体检测试剂盒，其包括：
链霉亲和素包被板，由5μg/mL的链霉亲和素，100μl/孔，包被形成；
U型96孔抗原抗体反应板；
生物素化的口蹄疫病毒抗原，工作浓度为2μg/ml(原始浓度为117.5μg/ml，使用样品稀释液稀释得到)；
口蹄疫兔抗工作液，为含有4μg/ml口蹄疫兔多抗、1wt％酪蛋白的PBS缓冲液，pH为7.2；
羊抗兔IgG-HRP工作液，为含有1.0μg/ml羊抗兔IgG-HRP、1wt％酪蛋白的PBS缓冲液，pH为7.4；
阴性质控血清，抗体检测效价小于1：8；
阳性质控血清，为阴性质控血清添加30μg/mL的口蹄疫兔多抗制得，抗体检测效价大于1:720；
样本稀释液，为含有1wt％酪蛋白的PBS缓冲液，pH为7.3；
20倍的浓缩洗液，为含18wt％NaCl、1wt％Tween20和1wt％Proclin300的Tris-HCl缓冲液，pH为7.6；
底物A，为含有1.26wt％N,N-二甲基甲酰胺、5.85mmol/L鲁米诺、9.86mmol/L四苯硼钠和1.06mg/L对乙酰氨基酚的Tris-HCl缓冲液，pH为8.8；
底物B，为含0.615mg/mL过硼酸钠的Tris-HCl缓冲液，pH为5.0。
实施例2：
一种口蹄疫抗体检测试剂盒，其包括：
链霉亲和素包被板，由2μg/mL的链霉亲和素，100μl/孔，包被形成；
U型96孔抗原抗体反应板；
生物素化的口蹄疫病毒抗原，工作浓度为0.5μg/ml(原始浓度为117.5μg/ml，使用样品稀释液稀释得到)；
口蹄疫兔抗工作液，为含有2μg/ml口蹄疫兔多抗、1wt％酪蛋白的PBS缓冲液，pH为7.4；
羊抗兔IgG-HRP工作液，为含有0.5μg/ml羊抗兔IgG-HRP、1wt％酪蛋白的PBS缓冲液，pH为7.2；
阴性质控血清，抗体检测效价小于1：8；
阳性质控血清，为阴性质控血清添加20μg/mL的口蹄疫兔多抗，抗体检测效价大于1:720；
样本稀释液，为含有1wt％酪蛋白的PBS缓冲液，pH为7.4；
20倍的浓缩洗液，为含18wt％NaCl、1wt％Tween20和1wt％Proclin300的Tris-HCl缓冲液，pH为7.5；
底物A，为含有1.26wt％N,N-二甲基甲酰胺、5.85mmol/L鲁米诺、9.86mmol/L四苯硼钠和1.06mg/L对乙酰氨基酚的Tris-HCl缓冲液，pH为8.9；
底物B，为含0.615mg/mL过硼酸钠的Tris-HCl缓冲液，pH为4.8。
实施例3：
一种口蹄疫抗体检测试剂盒，其包括：
链霉亲和素包被板，由20μg/mL的链霉亲和素，100μl/孔，包被形成；
U型96孔抗原抗体反应板；
生物素化的口蹄疫病毒抗原，工作浓度为5μg/ml(原始浓度为117.5μg/ml，使用样品稀释液稀释得到)；
口蹄疫兔抗工作液，为含有10μg/ml口蹄疫兔多抗、1wt％酪蛋白的PBS缓冲液，pH为7.3；
羊抗兔IgG-HRP工作液，为含有2.5μg/ml羊抗兔IgG-HRP、1wt％酪蛋白的PBS缓冲液，pH为7.3；
阴性质控血清，抗体检测效价小于1：8；
阳性质控血清，为阴性质控血清添加50μg/mL的口蹄疫兔多抗，抗体检测效价大于1:720；
样本稀释液，为含有1wt％酪蛋白的PBS缓冲液，pH为7.2；
20倍的浓缩洗液，为含18wt％NaCl、1wt％Tween20和1wt％Proclin300的Tris-HCl缓冲液，pH为7.4；
底物A，为含有1.26wt％N,N-二甲基甲酰胺、5.85mmol/L鲁米诺、9.86mmol/L四苯硼钠和1.06mg/L对乙酰氨基酚的Tris-HCl缓冲液，pH为9.0；
底物B，为含0.615mg/mL过硼酸钠的Tris-HCl缓冲液，pH为4.9。
实施例4：
实施例1的试剂盒的使用方法：
(1)在抗原抗体反应板中，使用样本稀释液对待测血清样本、阳性质控血清、阴性质控血清进行倍比稀释，50μl/孔，所述待测血清样本、阳性质控血清、阴性质控血清的稀释范围分别为(1：4～1：512)、(1：8～1：1024)、(1：2～1：4)，抗原对照设置4孔，分别加入50μl样本稀释液；
样品布局以及稀释倍数如表6所示。
表6：
S1～S10为待测血清样品，S2～S10的稀释倍数分布与S1相同。
(2)加入2μg/ml的生物素化的口蹄疫病毒抗原，50μl/孔，封板，振荡，37℃温育60分钟。
添加口蹄疫病毒抗原后的稀释倍数如表7所示。
表7：
(3)将反应液转移至链霉亲和素包被板中，50μl/孔，封板，37℃温育30分钟；
(4)洗板5次，甩干，向链霉亲和素包被板中加入口蹄疫兔抗工作液，50μl/孔，封板，37℃温育30分钟；
(5)洗板5次，甩干，向链霉亲和素包被板中加入羊抗兔IgG-HRP工作液，50μl/孔，封板，37℃温育30分钟；
(6)洗板5次，甩干，加入底物A和底物B，50μl/孔，5分钟内使用化学发光免疫分析仪测定相对光强度(RLU)；
(7)结果判定：
A、检测认可标准为：病毒抗原对照RLU值应在8000000至15000000范围内，阳性质控血清抗体效价应大于1:720，阴性质控血清抗体效价应小于1:8
B、血清抗体效价的判定：抗原对照的4孔，弃去最高和最低RLU值，计算剩余2孔的平均RLU值，以65％抗原对照平均值为临界值；待检血清RLU值大于临界值的孔为阴性孔，小于等于临界值的孔为阳性孔；若临界值与稀释倍数最高阳性孔的RLU相同，则以待检血清阳性孔的最高稀释倍数作为该血清的抗体效价；若临界值处于2个稀释孔RLU之间，抗体效价取相邻阳性孔和阴性孔稀释倍数的反对数中间值。
抗体效价计算对照如表8所示。
表8
此外，实施例2的试剂盒的使用方法采用75％抗原对照平均值为临界值；实施例3的试剂盒的使用方法采用55％抗原对照平均值为临界值。
实验例1：灵敏度实验。
按实施例4的方法，平行测定20孔阴性质控血清1:4稀释度时的相对发光强度RLU，计算RLU的标准差(SD)与RLU平均值(M)，(M-2SD)对应的RLU对抗原对照平均RLU的抑制率作为衡量试剂盒灵敏度的指标。
灵敏度实验布局如表9所示。
表9：
灵敏度实验结果如表10所示。
表10：
表10显示，本试剂盒阴性质控血清1:4稀释度时的抑制率为7.49％，低于通用技术指标IC15(抑制率15％)的要求；而市售ELISA试剂盒的抑制率为25.37％，灵敏度较本试剂盒低。实验例2：特异性实验。
干扰样本说明：S1～S3为三份来自于不同猪个体的血清样本，抗体效价明显高于常规免疫猪血清效价，同时血清的基质效应及其他干扰因素也更显著。
按实施例2的方法，同时测定3份干扰样本的效价，观察不同稀释度与相对发光强度RLU的曲线变化趋势，以此判定试剂盒的特异性。
特异性试验布局如表11所示。
表11：
特异性实验结果如表12所示。
表12：
表12显示，随着干扰样本稀释度的升高，市售ELISA试剂盒检测的OD值有较明显的先下降后上升的趋势，而本发明试剂盒RLU值下降阶段不明显，抗干扰能力明显强于ELISA试剂盒，且检测血清效价较ELISA试剂盒高一个梯度等级，检测灵敏度高。
实验例3：稳定性实验。
市售ELISA试剂盒的有效期为6个月，取有效期满3个月内的市售ELISA试剂盒和本发明试剂盒，同时检测阴阳性质控血清，以此判定试剂盒的稳定性。
稳定性试验布局如表13所示。
表13：
稳定性实验结果如表14所示。
表14：
表14显示，随着试剂盒储藏时间的延长，市售ELISA试剂盒与本发明试剂盒在6个月的有效期内，检测阴阳性质控血清效价稳定，检测数据真实有效。
此外，经检测，实施例2、3相应试剂盒检测待测样本效价与实施例1相同，表明本申请的上述试剂盒及其检测方法具有较高的准确性和稳定性。
表15：
待测样本1～10为来自于不同猪个体的血清样本。