IL-15异源二聚体蛋白及其用途的制作方法

本发明涉及一种IL-15异源二聚体蛋白及其用途，进一步涉及一种IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白复合物，以及其作为治疗剂特别是作为癌症和自身免疫疾病治疗剂的用途。
背景技术：
：白细胞介素15(IL-15)是Grabstein等人于1994年发现的一种约为12-14kD的细胞因子，可在机体正常的免疫应答中发挥作用，如促进T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞的增殖。IL-15属于四个小α螺旋束细胞因子家族(Smallfourα-helixbundlefamilyofcytokines)中的成员。IL-15需通过与其受体结合发挥生物学活性。IL-15受体由三个受体亚基组成：IL-15受体α(IL-15Rα)、IL-2受体β(IL-2Rβ，也称IL-15Rβ或CD122)和γc(也称CD132)。IL-15Rα内含一个Sushi结构域，能与IL-15结合，并且是使结合后的IL-15发挥生物学功能所必需的。近年发现，IL-15与其受体IL-15Rα形成复合物后，可显著增强IL-15的生物学活性。研究显示，IL-15和其可溶性受体IL-15Rα所形成的复合物在刺激记忆性CD8+T淋巴细胞和NT/NKT细胞增殖作用明显地优于IL-15单独作用。IL-15/IL-15Rα复合物刺激记忆性CD8+T细胞增殖和维持其存活的能力较单独的IL-15强10倍以上，其机理可能和顺式递呈相关。由于IL-15在肿瘤免疫治疗领域的良好预期，NIH最先进行了IL-15治疗肿瘤方面的研究，并尝试将其推入临床一期研究。但是IL-15分子量小、体内半衰期段，重复给药剂量不好控制，且容易造成全身性免疫副反应等。所以迫切需要一种提高IL-15体内半衰期、促进或者增强其体内生物学活性发挥的途径。国内外有不少公司或研究机构在从事IL-15免疫治疗方面的相关研究，比如CN100334112C(上海海欣生物技术有限公司)专利所涉及的IL-15-hIgG4Fc同源二聚体蛋白用于抗微生物感染的治疗；如CN1942481A(瑞士豪夫迈-罗氏公司)专利所涉及的IL-15-Fc融合表达系统及其用途；如CN101360827B(法国国立医学与健康研究所)专利所涉及的IL-15Ra(sushi+结构域)-IL-15融合蛋白及其在肿瘤治疗方面的应用。本申请的异源二聚体分子通过增加分子内部相互作用，具有更好的稳定性、延长的体内半衰期及提高的生物学活性。通过本领域内熟知的方法手段可以在本申请的分子设计基础上通过融合或者插入功能多肽的方式产生靶向性免疫细胞因子以及靶向性免疫细胞因子在肿瘤及自身免疫疾病治疗领域的应用。技术实现要素：本发明通过基因工程的方法设计并制备具有体内半衰期延长的，体外活性提高的并有明显抑瘤活性的蛋白分子。本发明提供一种IL-15异源二聚体蛋白，其包括：蛋白(I)和蛋白(∏)；其中蛋白(I)由IL-15或其变体和第一Fc变体重组而成；蛋白(∏)是第二Fc变体，或者由IL-15Rα或其变体和第二Fc变体重组而成；蛋白(I)和蛋白(∏)通过第一Fc变体和第二Fc变体之间的相互作用形成稳定的异源二聚体蛋白。以上所述的”重组而成”指通过基因工程的方法由不同蛋白间重组后表达得到。在本发明一个优选的实施方案中，第一Fc变体和第二Fc变体连接在蛋白IL-15和IL-15Rα的C端。在本发明一个实施方案中，提供一种IL-15异源二聚体蛋白，其中所述的IL-15序列为SEQIDNO：1。在本发明一个优选的实施方案中，提供一种IL-15异源二聚体蛋白，其中所述的蛋白(∏)是第二Fc变体。在本发明一个实施方案中，提供一种IL-15异源二聚体蛋白，其中所述的蛋白(∏)由IL-15Rα或其变体和第二Fc变体重组而成。在本发明一个实施方案中，提供一种IL-15异源二聚体蛋白，其中所述的IL-15Rα变体为IL-15Rα胞外域部分或其功能性片段，所述的功能性片段优选为IL-15Rα胞外域部分65-120个氨基酸的缩短形式，更优选65-102个氨基酸的缩短形式。在本发明一个实施方案中，提供一种IL-15异源二聚体蛋白，其中所述的IL-15Rα变体的序列选自SEQIDNO：2-7。在本发明一个实施方案中，提供一种IL-15异源二聚体蛋白，其中所述的IL-15Rα变体序列选自SEQIDNO：3-7。在本发明一个实施方案中，提供一种IL-15异源二聚体蛋白，其中所述的第一Fc变体和第二Fc变体分别选自Knob修饰的Fc和Hole修饰的Fc，或所述的第一Fc变体和第二Fc变体分别选自Hole修饰的Fc和Knob修饰的Fc。修饰后的第一Fc变体和第二Fc变体通过“Knob/Hole”的作用方式有助于形成异源二聚体蛋白。当第一Fc变体是Knob修饰的Fc时，第二Fc变体是Hole修饰的Fc；或者当第二Fc变体是Knob修饰的Fc时，第一Fc变体是Hole修饰的Fc。在本发明一个实施方案中，提供一种IL-15异源二聚体蛋白，其中所述第一Fc变体的序列选自SEQIDNO：26、SEQIDNO：27、SEQIDNO：28和SEQIDNO：29，和其中所述第二Fc变体的序列选自SEQIDNO：26、SEQIDNO：27、SEQIDNO：28和SEQIDNO：29。蛋白(I)和蛋白(∏)通过如SEQIDNO：26和SEQIDNO：27或SEQIDNO：28和SEQIDNO：29所示的Fc变体以“Knob/Hole”的作用方式形成异源二聚体。如当第一Fc变体序列为SEQIDNO：26时，第二Fc变体序列为SEQIDNO：27；或者当第二Fc变体序列为SEQIDNO：26时，第一Fc变体序列为SEQIDNO：27。在本发明一个实施方案中，提供一种IL-15异源二聚体蛋白，其中所述蛋白(I)的序列选自SEQIDNO：14-17，优选是SEQIDNO：14。在本发明一个实施方案中，提供一种IL-15异源二聚体蛋白，其中所述蛋白(∏)的序列选自SEQIDNO：18-25、34-37，优选选自SEQIDNO：23、34-37，更优选选自SEQIDNO：34-37。在本发明一个实施方案中，提供一种IL-15异源二聚体蛋白，其中所述蛋白(I)的序列选自SEQIDNO：30-31；所述蛋白(∏)的序列选自SEQIDNO：32-33。本发明的IL-15异源二聚体蛋白，选自如下的二聚体蛋白3-17，其中所述的二聚体蛋白3-17分别由相对应的蛋白(I)和蛋白(∏)重组而成：本发明还涉及一种核酸，其编码如上所述的IL-15异源二聚体蛋白。本发明还涉及一种DNA载体，其包括如上所述的核酸。本发明还涉及一种宿主细胞，其转染有本发明所述的DNA载体。本发明还涉及一种制备如上所述的IL-15异源二聚体蛋白的方法，所述方法包括：在足以表达如上所述的IL-15异源二聚体蛋白的条件下，培养本发明所述的宿主细胞；表达并纯化所述的IL-15异源二聚体蛋白。本发明还涉及一种药物组合物，其含有本发明所述的IL-15的异源二聚体蛋白和可药用的赋形剂、稀释或载体。本发明还涉及一种靶向性蛋白分子，其含有根据本发明所述的IL-15异源二聚体蛋白结构。本发明还涉及一种用于刺激或抑制哺乳动物免疫应答的方法，包括：向所述哺乳动物给予有效量的根据本发明所述的IL-15异源二聚体蛋白，或根据本发明所述的药物组合物，或根据本发明所述的靶向性蛋白分子。本发明还涉及根据本发明所述的IL-15异源二聚体蛋白、或根据本发明所述的药物组合物，或根据本发明所述的靶向性蛋白分子，在制备用于治疗IL-15介导的疾病或病症的药物中的用途；其中所述的疾病为传染病、癌症、血液病和自身免疫性疾病。所述的癌症选自黑色素瘤、结直肠癌、皮肤癌、淋巴瘤、肾细胞癌、实体瘤、肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌；所述的传染病选自天花病毒感染、HIV感染、细菌感染、真菌感染、HBV感染；所述的血液病选自贫血、急性髓系白血病、骨髓增生异常综合征、T-细胞大颗粒淋巴细胞性白血病；所述的自身免疫性疾病选自多发性硬化症、银屑病、风湿性关节炎、炎性疾病、胃炎、黏膜炎。其中所述的药物为根据本发明所述的IL-15异源二聚体蛋白、或本发明所述的药物组合物与小分子抑制剂或抗体类药物的联合使用；所述的小分子抑制剂优选烷化剂；所述的抗体类药物优选为单克隆抗体药物，更优选为抗CD20、PD1、PDL1、Her2抗体。进一步地，根据本发明所述的药物与治疗有效剂量的选自下列的药物联合应用：替莫唑胺、阿霉素、紫杉醇、顺铂、卡铂、达卡巴嗪、拓扑替康、伊立替康、吉西他滨和贝伐单抗。本发明还涉及根据本发明所述的IL-15异源二聚体蛋白、或根据本发明所述的药物组合物，或根据本发明所述的靶向性蛋白分子，在细胞免疫治疗中的用途，尤其是在DC、CIK、DC-CIK、ECIK、NK、CAS-T、BiAb-T、TCR-T、CAR-T肿瘤免疫细胞治疗中的用途。肿瘤免疫治疗是肿瘤治疗领域一个热点，是继手术、化疗和放疗之后的第四种肿瘤治疗模式。肿瘤免疫学治疗的目的是激发或调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞。它可能是最有效的也是最安全的治疗肿瘤的途径。肿瘤的免疫逃逸机制，是利用肿瘤自身对免疫系统的抑制作用维持或促进肿瘤的生长。肿瘤免疫治疗是为了最大限度的提高患者自身对肿瘤的免疫系统反应，它不但要在体内激活原有的免疫系统反应，更要维持免疫系统反应的持续时间和反应强度，这才是免疫治疗肿瘤的关键。细胞因子免疫疗法是随着高纯度或重组细胞因子的生产而发展起来的。其原理是利用某些细胞因子注射体内后可调节、增强一种或多种免疫细胞的功能，发挥更强的抗肿瘤免疫作用。本发明还涉及一种治疗或预防疾病的方法，在所述疾病中，细胞表达疾病相关抗原，所述方法包括：向患者施予如本发明所述的IL-15异源二聚体蛋白、或如本发明所述的药物组合物，或如本发明所述的靶向性蛋白分子；在表达疾病相关抗原的细胞与表达IL-15Rα的免疫细胞之间形成足以活化所述免疫细胞的特异性结合复合物；以及通过所述免疫细胞杀死所述表达疾病相关抗原的细胞。其中所述表达疾病相关抗原的细胞优选为肿瘤细胞或病毒感染细胞。其中所述的免疫细胞优选为T-细胞、LAK细胞或NK细胞。其中所述的疾病为传染病、癌症、血液病和自身免疫性疾病。所述的癌症选自黑色素瘤、结直肠癌、皮肤癌、淋巴瘤、肾细胞癌、实体瘤；所述的传染病选自天花病毒感染、HIV感染、细菌感染、真菌感染；所述的血液病选自贫血、急性髓系白血病、骨髓增生异常综合征、T-细胞大颗粒淋巴细胞性白血病；所述的自身免疫性疾病选自多发性硬化症、银屑病、风湿性关节炎、炎性疾病、胃炎、黏膜炎。本发明还涉及一种治疗或预防疾病的方法，包括向患者施予如本发明所述的IL-15异源二聚体蛋白、或如本发明所述的药物组合物，或如本发明所述的靶向性蛋白分子，以及联合施用其它药物，如小分子抑制剂或抗体类药物；所述的小分子抑制剂优选烷化剂；所述的抗体类药物优选单克隆抗体药物，更优选抗CD20、PD1、PDL1、Her2抗体。为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。一、术语本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。本发明所述的“异源二聚体蛋白”是指两个不同的单体蛋白质结合而成的蛋白。在本发明中，两个不同的单体蛋白质各自含有Fc片段或Fc变体片段，并通过Fc片段或Fc变体片段相互作用形成异源二聚体蛋白。本发明中第一Fc变体和第二Fc变体之间的“相互作用”指的是Fc变体间作用。“Fc变体”指通过在Fc上合适的位点处存在一个或者多个氨基酸替换、插入或缺失突变引起Fc结构或功能的变化。“Fc变体间作用”指的是经突变设计的Fc变体之间，可以形成空间填充效应、静电导引、氢键作用、疏水作用等。Fc变体间相互作用有助于形成稳定的异源二聚体蛋白。优选的突变设计为“Knob-into-Hole”形式的突变设计。本发明中组成异源二聚体蛋白的“单体蛋白质”(即蛋白(I)、蛋白(∏))可以是融合蛋白或非融合蛋白。本发明所述的“融合蛋白”是指，通过用基因重组方法、化学方法或其它适当方法将两个或多个基因的编码区连接，在同一调控序列控制下表达基因重组所得的蛋白质产物。在本发明的一些实施方案中，蛋白(I)为IL-15或其变体与Fc变体基因重组表达得到的融合蛋白；蛋白(∏)可为IL-15Rα与Fc变体基因重组表达得到的融合蛋白。本发明的融合蛋白中，两个或多个基因的编码区之间可由编码肽接头的序列于一个或数个位置融合。肽接头也可用于构建本发明的融合蛋白。本发明所述的“IL-15”或“IL-15肽段”可以是任何IL-15(白介素15)或其突变体，如人IL-15或非人哺乳动物IL-15或非哺乳动物IL-15。示例性非人哺乳动物如猪、兔、猴、猩猩、鼠等，非哺乳动物如鸡等。；优选人的白介素15成熟分子，见数据库UniProtKB，登录号P40933，49-162aa。术语“IL-15变体”指通过一个或多个氨基酸替换、增加或者缺失突变获得的对IL-15与其受体间亲合力提高或者降低，或其刺激T细胞或者NK细胞活性增加或者降低的突变体分子。本发明中所述的“IL-15Rα”可以是任何物种的IL-15Ra或者其功能性片段，如人IL-15Ra或非人哺乳动物IL-15Ra或非哺乳动物IL-15Ra。示例性非人哺乳动物如猪、兔、猴、猩猩、鼠等，非哺乳动物如鸡等。优选人的IL-15Ra，；更优选人的白介素15受体α胞外域片段，简称IL-15RαECD(SEQIDNO：2)，见数据库UniProtKB，登录号Q13261，31-205aa。术语“IL-15Rα变体”指在IL-15Ra上通过一个或者多个氨基酸缺失、插入或替换突变形成的具有与其配体分子如IL15结合能力的功能性突变体，优选人的IL15Ra分子，更优选人的IL-15Rα胞外域片段的缩短形式，即从胞外域片段C端开始通过一个或多个氨基酸缺失突变所得的具有人白介素15受体α活性的分子，优选保留65-120个氨基酸的缺失突变形式，更优选保留65-102个氨基酸的缺失突变缩短形式，比如IL-15Rα-sushi(77)(SEQIDNO：3)、IL-15Rα-sushi(65)(SEQIDNO：4)。术语“免疫球蛋白Fc区”指的是免疫球蛋白链恒定区，特别是免疫球蛋白重链恒定区的羧基端或其中的一部分，无抗原结合活性，是抗体分子与效应分子和细胞相互作用的部位。例如，免疫球蛋白Fc区可包括重链CH1、CH2、CH3、CH4的两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合。Fc可以来源于不同的种属，优选人的免疫球蛋白。根据重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类，主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-4；IgA-1和IgA-2。“Fc区”优选包括至少一个免疫球蛋白绞链区，以及IgG的CH2和CH3区。更优选包括IgG1的一个CH2结构域，一个CH3结构域和一个免疫球蛋白绞链区，铰链区起始氨基酸位置可以变动。Fc变体的突变设计技术在本领域内已经较为广泛的应用于制备双特异性抗体或者异源二聚的Fc融合蛋白形式。代表性的有Cater等人(ProteinEngineeringvol.9no.7pp.617-621，1996)提出的“Knob-into-Hole”形式；Amgen公司技术人员利用静电导引(ElectrostaticSteering)形成含Fc的异源二聚体形式(US20100286374A1)；JonathanH.Davis等人(ProteinEngineering，Design&Selectionpp.1-8，2010)提出的通过IgG/IgA链交换形成的异源二聚体形式(SEEDbodies)；Genmab公司DuoBody(Science，2007.317(5844))平台技术形成的双特异性分子；Xencor公司的技术人员综合结构计算及Fc氨基酸突变，综合不同作用方式形成异源二聚体蛋白形式(mAbs3：6，546-557；November/December2011)；苏州康宁杰瑞公司的基于电荷网络的Fc改造方法(CN201110459100.7)得到异源二聚体蛋白形式；以及其它基于Fc氨基酸变化或者功能改造手段，达到形成异源二聚体功能蛋白的基因工程方法。本发明所述的Fc变体片段上的Knob/Hole结构指两条Fc片段各自突变，突变后可以通过“Knob-into-Hole”形式进行结合。优选用Cater等人的“knob-into-hole”模型在Fc区上进行位点突变的改造，以使得到的第一Fc变体和第二Fc变体能以“knob-into-hole”的形式结合在一起形成异源二聚体。从特定的免疫球蛋白类别和亚类中选择特定的免疫球蛋白Fc区在本领域技术人员所掌握的范围之内。优选人类抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc区，更优选人抗体IgG1的Fc区。随机任选第一Fc变体或第二Fc变体中一个做knob的突变，另一个做hole的突变。在实施例中，所述的第一Fc变体做knob的突变，如序列SEQIDNO26；所述的第二Fc变体做hole的突变，如序列SEQIDNO27。术语“连接肽(Linker)”在本发明中用于连接IL-15或IL-15Rα与Fc变体，以保证蛋白的正确折叠和稳定性的肽。本发明的“连接肽”优选为(GGGGS)n，其中n可以为0、1、2、3、4、5或者更多，优选n为2-4。如果连接肽序列太短，可能影响两蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰；如果连接肽序列太长，又涉及免疫原性的问题，因为连接肽序列本身就是新的抗原。本发明所述的“异源二聚体蛋白”优选为基因共表达的产物。如在原核细胞在肠杆菌中共表达；或在真核细胞，如293、CHO中共表达。本发明中所述的“共表达”(coexpression)指在一个细胞中多个基因一起表达，同时出现它们的产物。这些基因可以是同时存在而分别或共同地受控表达。在本发明中，优选在一个真核细胞中共表达两种基因。共表达得到的基因表达产物有利于高效、简单地形成复合物；在本发明中，有利于形成异源二聚体蛋白。本发明所述的免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ或λ链。靶向性蛋白分子，指一类蛋白分子，其中含有某个片段或者区域能够和其他蛋白分子相互作用，通过在免疫细胞因子如IL5、IL2等或者含有这类细胞因子的独特分子设计比如本申请的分子设计基础上引入靶向性肽段如抗体片段、ScFv或某类细胞表面分子的结合肽等。例如抗体与抗原相互作用，或者配体与受体相互作用，使得分子进入体内后能够优先通过靶向作用富集于特定的组织、器官或身体部位发挥其生物功能。通过如在本申请分子的游离末端融合某类多肽形成一个新的分子，这种方式在本领域内可以合理的进行衍生设计产生一系列分子。“给予”和“处理”，当应用于动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”，当应用于人、动物或受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。“处理”在应用于人、动物或受试者、或者细胞、组织或器官时，包括IL-15激动剂或IL-15拮抗剂与人或动物、受试者、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。“细胞的处理”还包括IL-15激动剂或IL-15拮抗剂例如在流体相或胶体相中接触IL-15受体的情况，而且包括激动剂或拮抗剂不接触细胞或受体的情况。“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，诸如包含本发明的IL-15异源二聚体蛋白的组合物。所述患者具有一种或多种疾病或症状。已知所述治疗剂对这些疾病或症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病或症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类疾病或症状退化还是抑制这类疾病或症状发展到任何临床可测量的程度。有效缓解任何具体疾病或症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。“免疫病症”或“免疫障碍”包括例如病理性炎症、炎性病症和自身免疫性疾病症或疾病。“免疫病症”还指感染、持续感染和增生性病症，例如癌症、肿瘤和血管发生。“癌性病症”包括例如癌症、癌细胞、肿瘤、血管发生和癌变前病症，例如发育异常。本文使用的“聚合酶链式反应”或“PCR”是指例如美国专利号4，683，195中所述的扩增程序或技术。一般来说，需要获得来自目标区域末端或之外的序列信息，使得可以设计寡核苷酸引物。这些引物的序列与待扩增模板的对应链相同或相似。“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着抗体重链可变区可以但不必须存在；存在时，可以是1个，2个或3个。“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其它化学组分的混合物，以及其它组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。本发明中所述的用重组DNA转化宿主细胞的步骤可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。获得的转化子可以用常规方法培养，以及表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。宿主细胞在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。附图说明图1.给药时间与血清中样本的摩尔浓度的关系。图2.测试例3.肺转移模型中，给药的小鼠肺部转移肿瘤块数量。图中*表示：p＜0.05，vsPBS；**表示：p＜0.01，vsPBS；##表示：p＜0.01，vsIL-15。图3.测试例3.肺转移模型中，给药的小鼠相对肺重量(肺重量/体重)，图中**表示：p＜0.01，vsPBS；#表示：p＜0.05，vsIL-15。图4.不同给药蛋白对HCT-116裸小鼠移植瘤的疗效。图5.不同给药蛋白对HCT-116裸小鼠移植瘤的疗效，第27天的肿瘤重量。图中*表示：p＜0.05，vsblank(空白对照)。图6.不同给药蛋白对HCT-116+PBMCSCID鼠移植瘤的疗效。图7.不同给药蛋白对HCT-116+PBMCSCID鼠移植瘤的疗效，第28天的肿瘤重量。图中*表示：p＜0.05，vsPBMC。图8.小鼠给药二聚体蛋白17、阳性对照(IL-15)和阴性对照(PBS)后小鼠的肺部转移肿瘤斑点数量比较，图中*：p＜0.05，**：p＜0.01，vsPBS。图9.向小鼠给药二聚体蛋白17、阳性对照(IL-15)和阴性对照(PBS)后小鼠的相对肺重量(肺重量/体重)比较。图10.向小鼠给药二聚体蛋白17、阳性对照(IL-15)和阴性对照(PBS)后小鼠的小鼠体重比较。具体实施方式以下结合实施例用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制本发明的范围。本发明实施例或测试例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。参见Sambrook等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室；当代分子生物学方法，Ausubel等著，Greene出版协会，WileyInterscience，NY。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。实施例1.IL-15异源二聚体蛋白的获得本发明提供的异源二聚体蛋白由蛋白(I)和蛋白(∏)结合形成，所述的蛋白(I)是由IL-15或其变体和第一Fc变体重组而成的融合蛋白；所述的蛋白(∏)，可以是第二Fc变体，或者是由IL-15RαECD或其变体和第二Fc变体重组而成的融合蛋白；所述的结合优选第一Fc变体与第二Fc变体以Knob/Hole形式结合。本发明实施例中所用的IL-15指的是人白介素15成熟分子(SEQIDNO：1)或其变体。本发明实施例中所用的IL-15RαECD指人的白介素15受体α胞外域片段(SEQIDNO：2)；其变体优选其缩短形式，如IL-15Rα-sushi(77)(SEQIDNO：3)、IL-15Rα-sushi(65)(SEQIDNO：4)。本发明实施例中所用的Fc片段部分可以为人类抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc片段，优选人IgG1的Fc片段。本发明中第一Fc变体或第二Fc变体，优选进行Knob形式的突变(SEQIDNO：26)，或Hole形式的突变(SEQIDNO：27)。本发明的异源二聚体蛋白中，蛋白(I)和蛋白(∏)之间通过第一Fc变体与第二Fc变体之间的Knob/Hole结构形成二聚体，优选通过第一Fc变体与第二Fc变体之间“Knob-into-Hole”作用方式形成异二聚体。仅含单个IL-15效应分子的二聚体，也可以通过IL-15与第一Fc变体融合，且所述第一Fc变体与相对应第二Fc变体以Knob-into-Hole的作用方式形成，如本发明的异源二聚体蛋白3。本发明将IL-15或其变体通过一个连接肽与第一Fc片段或第一Fc变体融合形成融合蛋白，以及本发明将IL-15RαECD或其变体通过一个连接肽与第二Fc片段或第二Fc变体融合形成融合蛋白，其中各蛋白组分的连接顺序不限；连接肽可以是领域内常用的软性连接肽，优选为(GGGGS)n，其中n选自1-10，优选选自1-5，最优选为2。相关的蛋白序列如下：IL-15(蛋白序列1)：(人白介素15的氨基酸序列，同时也是对照品IL-15序列)IL-15RαECD(蛋白序列2)：(人白介素15受体alpha的胞外域氨基酸序列，同时也用来和Fc融合形成分子H中的IL-15Ra所指部分)IL-15Rα-sushi(77)(蛋白序列3)：(人白介素15受体alpha胞外域中能够保持90％以上结合活性的一个结构域，称为sushi结构域加一小段连接肽，属于缩短形式的IL-15Rα)IL-15Rα-sushi(65)(蛋白序列4)：(人白介素15受体alpha胞外域中能够保持90％以上结合活性的一个结构域，称为sushi结构域属于缩短形式的IL-15Ra)IL15Ra-sushi(73)(蛋白序列5)：IL15Ra-sushi(86)(蛋白序列6)：IL15Ra-sushi(102)(蛋白序列7)：IL-15-Fc(蛋白序列8)：(人白介素15分子通过一个连接肽与人IgG1-Fc序列连接形成的融合蛋白，表达出来为双价的同源二聚体，其中IL-15分子处在蛋白的N端)Fc-IL-15(蛋白序列9)：(人白介素15分子通过一个连接肽与人IgG1-Fc序列连接形成的融合蛋白，表达出来为双价的同源二聚体，其中IL-15分子处在蛋白的C端)IL-15RαECD-Fc(蛋白序列10)：(人白介素15受体alpha胞外域通过一个连接肽与人IgG1-Fc序列连接形成的融合蛋白，表达出来为双价的同源二聚体，其中IL-15Rα-ECD分子处在蛋白的N端)Fc-IL-15RαECD(蛋白序列11)：(人白介素15受体alpha胞外域通过一个连接肽与人IgG1-Fc序列连接形成的融合蛋白，表达出来为双价的同源二聚体，其中IL-15RαECD分子处在蛋白的C端)IL-15Rα-sushi(77)-Fc(蛋白序列12)：(人白介素15受体alpha胞外域中的sushi结构域加一段连接肽组成的sushi(77)片段通过一个连接肽与人IgG1-Fc序列连接形成的融合蛋白，sushi(77)片段位于N端)Fc-IL-15Rα-sushi(77)(蛋白序列13)：(人白介素15受体alpha胞外域中的sushi结构域加一段连接肽组成的sushi+片段通过一个连接肽与人IgG1-Fc序列连接形成的融合蛋白，sushi+片段位于C端)IL-15-Fc-Knob(蛋白序列14)：(上述序列8中的Fc部分进行了氨基酸突变成Knob形式，可以和另外一个融合分子的Hole形式进行配对)IL-15-Fc-Hole(蛋白序列15)：(上述序列8中的Fc部分进行了氨基酸突变成Hole形式，可以和另外一个融合分子的Knob形式进行配对)Fc-Knob-IL-15(蛋白序列16)：(上述序列9中的Fc部分进行了氨基酸突变成Knob形式，可以和另外一个融合分子的Hole形式进行配对)Fc-Hole-IL-15(蛋白序列17)：(上述序列9中的Fc部分进行了氨基酸突变成Hole形式，可以和另外一个融合分子的Knob形式进行配对)IL-15RαECD-Fc-Knob(蛋白序列18)：(上述序列10中的Fc部分进行了氨基酸突变成Knob形式，可以和另外一个融合分子的Hole形式进行配对)IL-15RαECD-Fc-Hole(蛋白序列19)：(上述序列10中的Fc部分进行了氨基酸突变成Hole形式，可以和另外一个融合分子的Knob形式进行配对)Fc-Knob-IL-15RαECD(蛋白序列20)：(上述序列11中的Fc部分进行了氨基酸突变成Knob形式，可以和另外一个融合分子的Hole形式进行配对)Fc-Hole-IL-15RαECD(蛋白序列21)：(上述序列11中的Fc部分进行了氨基酸突变成Hole形式，可以和另外一个融合分子的Knob形式进行配对)IL-15Rα-sushi(77)-Fc-Knob(蛋白序列22)：(蛋白序列12中的Fc部分进行了氨基酸突变成Knob形式，可以和另外一个融合分子的Hole形式进行配对)IL-15Rα-sushi(77)-Fc-Hole(蛋白序列23)：(蛋白序列12中的Fc部分进行了氨基酸突变成Hole形式，可以和另外一个融合分子的Knob形式进行配对)Fc-Knob-IL-15Rα-sushi(77)(蛋白序列24)：(蛋白序列13中的Fc部分进行了氨基酸突变成Knob形式，可以和另外一个融合分子的Hole形式进行配对)Fc-Hole-IL-15Rα-sushi(77)(蛋白序列25)：(蛋白序列13中的Fc部分进行了氨基酸突变成Hole形式，可以和另外一个融合分子的Knob形式进行配对)Fc-Knob(蛋白序列26)：(人IgG1-Fc部分的Knob突变形式，可以与IL-15-Fc-Hole/Fc-IL-15-Hole配对)Fc-Hole(蛋白序列27)：(人IgG1-Fc部分的Hole突变形式，可以与IL-15-Fc-Knob/Fc-IL-15-Knob配对Fc-Knob(M)(蛋白序列28)：另一种方式的Fc突变，可以和Fc-Hole(M)配对形成异源二聚体。Fc-Hole(M)(蛋白序列29)：另一种方式的Fc突变，可以和Fc-Knob(M)配对形成异源二聚体。Fc-Knob(M)-IL-15(蛋白序列30)(相比Knob突变位点不同，另外一种异源二聚体突变方式)IL-15-Fc-Knob(M)(蛋白序列31)(相比Knob突变位点不同，另外一种异源二聚体突变方式)Fc-Hole(M)-IL-15Rα-sushi(65)(蛋白序列32)(相比Hole突变位点不同，另外一种异源二聚体突变方式)IL-15Rα-sushi(65)-Fc-Hole(M)(蛋白序列33)(相比Hole突变位点不同，另外一种异源二聚体突变方式)IL-15Rα-sushi(73)-Fc-Hole(蛋白序列34)：(sushi(73)指长度为73个氨基酸的含sushi结构域的缩短形式的IL15Rα)IL-15Rα-sushi(65)-Fc-Hole(蛋白序列35)：(sushi(65)指65个氨基酸长度的sushi结构域)IL-15Rα-sushi(86)-Fc-Hole(蛋白序列36)：(sushi(86)指长度为86个氨基酸的含sushi结构域的缩短形式的IL-15Rα)IL-15Rα-sushi(102)-Fc-Hole(蛋白序列37)：(sushi(102)指长度为102个氨基酸的含sushi结构域的缩短形式的IL-15Rα)实施例2相关载体的构建一、实验材料：真核表达载体pcDNA3.1(+)(Lifetechnologies，货号V790-20)；IL-15(DNA序列1)、IL-15RαECD(DNA序列2)及IgG1Fc(DNA序列3)DNA片段：由基因合成公司合成(金唯智，苏州)；引物DNA片段：由基因合成公司合成(金唯智，苏州)。二、实验方法：用常规的PCR方法，进行片段拼接。1.片段拼接IL-15-Fc片段：以IL-15，连接肽，Fc的顺序，进行overlapPCR，将三个DNA片段拼接成IL-15-Fc片段(DNA序列4，SEQIDNO：42)。IL-15RαECD-Fc片段：以IL-15RαECD，连接肽，Fc的顺序，进行overlapPCR，将三个DNA片段拼接成IL-15RαECD-Fc片段(DNA序列5，SEQIDNO：43)。Fc-IL-15片段：以Fc，连接肽，IL-15的顺序，进行overlapPCR，将三个DNA片段拼接成Fc-IL-15片段(DNA序列6，SEQIDNO：44)。Fc-IL-15RαECD片段：以Fc，连接肽，IL-15RαECD的顺序，进行overlapPCR，将三个DNA片段拼接成Fc-IL-15RαECD片段(DNA序列7，SEQIDNO：45)。IL-15-Fc-Knob片段：以IL-15，连接肽，Fc-Knob的顺序，进行overlapPCR，将三个DNA片段拼接成IL-15-Fc-Knob片段(DNA序列8，SEQIDNO：46)。IL-15-Fc-Hole片段：以IL-15，连接肽，Fc-Hole的顺序，进行overlapPCR，将三个DNA片段拼接成IL-15-Fc-Hole片段(DNA序列9，SEQIDNO：47)。Fc-Knob-IL-15片段：以Fc-Knob，连接肽，IL-15的顺序，进行overlapPCR，将三个DNA片段拼接成Fc-Knob-IL-15片段(DNA序列10，SEQIDNO：48)。Fc-Hole-IL-15片段：以Fc-Hole，连接肽，IL-15的顺序，进行overlapPCR，将三个DNA片段拼接成Fc-Hole-IL-15片段(DNA序列11，SEQIDNO：49)。IL-15RαECD-Fc-Knob片段：以IL-15RαECD，连接肽，Fc-Knob的顺序，进行overlapPCR，将三个DNA片段拼接成IL-15RαECD-Fc-Knob片段(DNA序列12，SEQIDNO：50)。IL-15RαECD-Fc-Hole片段：以IL-15RαECD，连接肽，Fc-Hole的顺序，进行overlapPCR，将三个DNA片段拼接成IL-15RαECD-Fc-Hole片段(DNA序列13，SEQIDNO：51)。Fc-Knob-IL-15RαECD片段：以Fc-Knob，连接肽，IL-15RαECD的顺序，进行overlapPCR，将三个DNA片段拼接成Fc-Knob-IL-15RαECD片段(DNA序列14，SEQIDNO：52)。Fc-Hole-IL-15RαECD片段：以Fc-Hole，连接肽，IL-15RαECD的顺序，进行overlapPCR，将三个DNA片段拼接成Fc-Hole-IL-15RαECD片段(DNA序列15，SEQIDNO：53)。Fc-Knob片段，DNA序列16，SEQIDNO：54。Fc-Hole片段，DNA序列17，SEQIDNO：55。Fc-Knob(M)-IL-15，DNA序列18，编码蛋白序列30前体的核苷酸序列，SEQIDNO：56。IL-15-Fc-Knob(M)，DNA序列19，编码蛋白序列31前体的核苷酸序列，SEQIDNO：57。Fc-Hole(M)-IL-15Rα-sushi(65)，DNA序列20，编码蛋白序列32前体的核苷酸序列，SEQIDNO：58。IL15Rα-sushi(65)-Fc-Hole(M)，DNA序列21，编码蛋白序列33前体的核苷酸序列，SEQIDNO：59。IL-15Rα-sushi(73)-Fc-Hole，DNA序列22，编码蛋白序列34前体的核苷酸序列，SEQIDNO：60。IL-15Rα-sushi(65)-Fc-Hole，DNA序列23，编码蛋白序列35前体的核苷酸序列，SEQIDNO：61。IL-15Rα-sushi(86)-Fc-Hole，DNA序列24，编码蛋白序列36前体的核苷酸序列，SEQIDNO：62。IL-15Rα-sushi(102)-Fc-Hole，DNA序列25，编码蛋白序列37前体的核苷酸序列，SEQIDNO：63。2.引入酶切位点及信号肽序列：利用PCR方法在基因片段的5’端引入限制性内切酶KpnI位点，Kozak序列，信号肽序列。KpnI位点至基因片段之间的序列为(SEQIDNO：38)：(下划线为KpnI酶切位点，斜线部分为信号肽序列)；在这三个片段的3’端分别引入终止密码子TGA和NotI限制性内切酶位点。3.构建表达载体利用KpnI和NotI限制酶位点将上述基因片段分别插入载体pcDNA3.1(+)，构建成表达载体如pcDNA3.1-IL-15-Fc，pcDNA3.1-IL-15RαECD-Fc，pcDNA3.1-Fc，pcDNA3.1-Fc-IL-15，pcDNA3.1-Fc-IL-15RαECD等，得到相应的表达质粒。4.基因定点突变定点突变过程采用KOD试剂盒(TOYOBOCat.KOD-201)25μL体系：2.5μL10×KODbuffer，2.5μL2mMdNTPs，1μL引物1(10μM)，1μL引物2(10μM)，0.5μLKODplus，1μL25mMMgSO4，16μLddH2O。合成程序为94℃2分钟，94℃30秒钟，55℃30秒钟，68℃11分钟，扩增25循环后，再68℃11分钟以结束PCR扩增程序。在PCR产物中直接加入DpnI(NEBCat.R0176L)1μL消化5小时后，用DH5a感受态细胞转化，挑单克隆测序，得到目的质粒。本发明实施例涉及的蛋白3由含DNA序列8(SEQIDNO：46)和DNA序列17(SEQIDNO：55)的表达载体表达所得；蛋白7由含DNA序列8(SEQIDNO：46)和DNA序列13(SEQIDNO：51)的表达载体表达所得。其他实施例的表达由组成蛋白的DNA序列的表达载体共表达所得。三、构建表达质粒的核苷酸序列以下序列为构建载体所用的DNA序列，下划单横线部分为信号肽DNA序列，下划虚线部分为肽接头DNA序列，下划双横线部分为Fc进行Knob/Hole突变的DNA序列。DNA序列1：(IL-15，人白介素15的核苷酸序列)DNA序列2：(IL-15RαECD，人白介素15受体alpha的胞外域核苷酸序列)DNA序列3：(Fc，人IgG的Fc核苷酸序列)DNA序列4：(IL-15-Fc，编码蛋白序列5前体的核苷酸序列)DNA序列5：(IL-15RαECD-Fc，编码蛋白序列7前体的核苷酸序列)DNA序列6：(Fc-IL-15，编码蛋白序列6前体的核苷酸序列)DNA序列7：(Fc-IL-15RαECD，编码蛋白序列8前体的核苷酸序列)DNA序列8：(IL-15-Fc-Knob，编码蛋白序列11前体的核苷酸序列)DNA序列9：(IL-15-Fc-Hole，编码蛋白序列12前体的核苷酸序列)DNA序列10：(Fc-Knob-IL-15，编码蛋白序列13前体的核苷酸序列)DNA序列11：(Fc-Hole-IL-15，编码蛋白序列14前体的核苷酸序列)DNA序列12：(IL-15RαECD-Fc-Knob，编码蛋白序列15前体的核苷酸序列)DNA序列13：(IL-15RαECD-Fc-Hole，编码蛋白序列16前体的核苷酸序列)DNA序列14：(Fc-Knob-IL-15RαECD，编码蛋白序列17前体的核苷酸序列)DNA序列15：(Fc-Hole-IL-15RαECD，编码蛋白序列18前体的核苷酸序列)DNA序列16：(Fc-Knob，编码蛋白序列23前体的核苷酸序列)DNA序列17：(Fc-Hole，编码蛋白序列24前体的核苷酸序列)DNA序列18：(Fc-Knob(M)-IL-15，编码蛋白序列30前体的核苷酸序列)：DNA序列19：(IL-15-Fc-Knob(M)，编码蛋白序列31前体的核苷酸序列)：DNA序列20：(Fc-Hole(M)-IL-15Rα-sushi(65)，编码蛋白序列32前体的核苷酸序列)：DNA序列21：(IL15Rα-sushi(65)-Fc-Hole(M)，编码蛋白序列33前体的核苷酸序列)：DNA序列22：(IL-15Rα-sushi(73)-Fc-Hole，编码蛋白序列34前体的核苷酸序列)：DNA序列23：(IL-15Rα-sushi(65)-Fc-Hole，编码蛋白序列35前体的核苷酸序列)：DNA序列24：(IL-15Rα-sushi(86)-Fc-Hole，编码蛋白序列36前体的核苷酸序列)：DNA序列25：(IL-15Rα-sushi(102)-Fc-Hole，编码蛋白序列37前体的核苷酸序列)：实施例3、蛋白的表达使用FreeStyle293细胞(GIBCO，Cat#R79007)瞬时转染表达IL-15蛋白。FreeStyle293细胞悬浮培养在Freestyle293expressionmedium(GIBCO，Cat#12338018)，添加终浓度为1％的UltraLowIgGFetalBovineSerum(超低免疫球蛋白胎牛血清，GIBCO，Cat#16250078)。准备实施例1中相关的表达质粒和转染试剂PEI(Polysciences，Cat#239662)，质粒量为100ug/100ml细胞，质粒和PEI的质量比为1∶2。转染当天细胞密度为1×106/ml。1L的FreeStyle293待转染细胞，取50mlOpti-MEM(GIBCO，Cat#11058021)培养基与质粒混匀，静置5min，过滤；另取50mlOpti-MEM培养基与PEI混匀，静置5min，过滤。将质粒和PEI进行混匀，静置15min。将质粒和PEI混合物缓慢加入细胞中，置入37℃，8％CO2，130rpm摇床培养箱中培养。5天后离心收集上清进行蛋白纯化。实施例4、蛋白的纯化(1)IL-15异源二聚体蛋白亲和层析法：细胞培养液经过高速离心后取上清，利用GE的ProteinA层析柱进行亲和层析。层析使用平衡缓冲液为1×PBS(pH7.4)，细胞上清上样结合后利用PBS洗涤至紫外线回到基线，然后利用洗脱缓冲液0.1M甘氨酸(pH3.0)洗脱目的蛋白，利用Tris调节pH至中性保存；(2)IL-15异源二聚体蛋白离子交换层析：将亲和层析所得产物调节pH至低于或者高于pI1-2个pH单位，适当稀释以控制样本电导在5ms/cm以下。利用合适的对应pH缓冲液如磷酸缓冲液、醋酸缓冲液等条件，利用本领域内常规的离子交换层析方法如阴离子交换或者阳离子交换进行对应pH条件下NaCl梯度洗脱，根据SDS-PAGE选择目的蛋白所在的收集管合并保存。(3)IL-15异源二聚体蛋白体积排阻层析：将离子交换所得产物超滤浓缩后进行体积排阻层析，如利用GE的Superdex200凝胶进行分离，以去除可能的聚体及其它成分，获得高纯度的目的产物。所得蛋白纯度分析可以通过SDS-PAGE及SEC-HPLC检测进行分析。蛋白浓度通过紫外分光光度法测定。所得的蛋白序列如实施例1中所述，具体各异源二聚体蛋白由1个或2个选自上述序列的蛋白序列组成，优选经Knob/Hole形式进行配对形成的异源二聚体，经细胞共表达后，分子纯化而得；也可以由未经突变的Fc链区组成双价蛋白。优选实施例如分子3通过融合蛋白IL-15-Fc-Knob和Fc-Hole配对形成(共表达后分子纯化所得)，实施例中的分子7通过融合蛋白IL-15-Fc-Knob和IL-15RαECD-Fc-Hole配对形成(共表达后分子纯化所得)。本发明的非限制性二聚体蛋白的实施如下表1：表1.各二聚体蛋白设计编号蛋白(I)蛋白(∏)1IL-15-Fc(SEQIDNo.8)IL-15-Fc(SEQIDNo.8)2Fc-IL-15(SEQIDNo.9)Fc-IL-15(SEQIDNo.9)3IL-15-Fc-Knob(SEQIDNo.14)Fc-Hole(SEQIDNo.27)4IL-15-Fc-Hole(SEQIDNo.15)Fc-Knob(SEQIDNo.26)5Fc-Knob-IL-15(SEQIDNo.16)Fc-Hole(SEQIDNo.27)6Fc-Hole-IL-15(SEQIDNo.17)Fc-Knob(SEQIDNo.26)7IL-15-Fc-Knob(SEQIDNo.14)IL-15RαECD-Fc-Hole(SEQIDNo.19)8IL-15-Fc-Hole(SEQIDNo.15)IL-15RαECD-Fc-Knob(SEQIDNo.18)9Fc-Knob-IL-15(SEQIDNo.16)Fc-Hole-IL-15RαECD(SEQIDNo.21)10Fc-Hole-IL-15(SEQIDNo.17)Fc-Knob-IL-15RαECD(SEQIDNo.20)llIL-15-Fc-Knob(SEQIDNo.14)IL-15Rα-sushi(77)-Fc-Hole(SEQIDNo.23)12Fc-Knob(M)-IL-15(SEQIDNo.30)Fc-Hole(M)-IL-15Rα-sushi(65)(SEQIDNo.32)13IL-15-Fc-Knob(M)(SEQIDNo.31)IL-15Rα-sushi(65)-Fc-Hole(M)(SEQIDNo.33)14IL-15-Fc-Knob(SEQIDNo.14)IL-15Rα-sushi(73)-Fc-Hole(SEQIDNo.34)15IL-15-Fc-Knob(SEQIDNo.14)IL-15Rα-sushi(65)-Fc-Hole(SEQIDNo.35)16IL-15-Fc-Knob(SEQIDNo.14)IL-15Rα-sushi(86)-Fc-Hole(SEQIDNo.36)17IL-15-Fc-Knob(SEQIDNo.14)IL-15Rα-sushi(102)-Fc-Hole(SEQIDNo.37)表1显示了本发明中涉及的具体的17种二聚体蛋白，分别为二聚体蛋白1-17，其分别由表中相应的蛋白(I)和蛋白(II)重组而成。测试例测试例1.体外增殖实验检测新鲜人外周血单个核细胞(PBMC)在IL-15、本发明的二聚体蛋白1-17作用下的增殖试验。新鲜PBMC培养在含有10％FBS的RPMI1640培养基中，实验时离心重悬后调整细胞的密度为5×105个/ml，96孔板中每孔加入90ul，样本用PBS按一定倍数稀释成不同浓度梯度，96孔板中每孔加入10μl，37℃，5％CO2培养箱中培养48小时，取50μl用LuminescentCellViabilityAssay试剂盒检测细胞增殖。结果见表2：表2.体外增殖实验检测结果样本PBMC相对活性IL-15(对照)1001792463367513871100818392610111113921221013206141243151338161024172677实施例实验结果：人PBMC增殖实验，结果显示本发明的异源二聚体蛋白蛋白药物3、7、11及14-17增殖效果要明显优于IL-15对照，其增殖效果也明显优于同源二聚体1和2。并且Fc变体在融合蛋白C端的效果好于Fc变体在融合蛋白N端的效果。另外形式的变体分子异源二聚体蛋白12和13增殖效果也优于IL-15对照。测试例2.IL-15异源二聚体体内PK检测一、实验目的评价IL-15异源二聚体蛋白3和7在小鼠体内的药代动力学变化。二、材料与实验方法1、受试化合物即加样样本IL-15，IL-15的异源二聚体蛋白3和7。2、受试动物C57BL/6小鼠，SPF，15-16g，♂，购自上海西普尔·必凯实验动物有限责任公司。3、动物试验方法27只C57BL/6小鼠，分为3组，每组9只，每笼3只，每个时间点采3只，循环采血。腹腔注射2μgIL-15、10μg二聚体蛋白3和20μg二聚体蛋白7(IL-15、二聚体蛋白3和二聚体蛋白7等摩尔，均为0.15nmol)。给药后30min、1、2、4、8、24、48、72、120h取血，每个点眼眶取血50-100μl。取血清进行人IL-15ELISA检测。三、实验结果与讨论IL-15、二聚体蛋白3和二聚体蛋白7等摩尔给药后，IL-15在30分钟内达到最大值，然后随时间被快速代谢，到24小时被全部代谢。二聚体蛋白3在给药后2小时达到最大值，随后随着时间被缓慢代谢，直到120小时被全部代谢。二聚体蛋白7也是在给药后2小时达到最大值，随后随时间被缓慢代谢，到120小时仍能检测到较大浓度的蛋白。PK实验(图1)显示，二聚体蛋白3和二聚体蛋白7给药后血清中最大蛋白摩尔浓度小于IL-15，但在血清中的保留时间超过IL-15，具有明显的长效作用。IL-15体内药效检测本实施例在肺转移模型、裸鼠荷瘤模型和重度联合免疫缺陷NOD-SCID鼠三种模型中，检测IL-15二聚体蛋白3和二聚体蛋白7的药效结果。结果见以下测试例。测试例3.肺转移模型一、实验目的利用B16F10细胞建立小鼠肺转移模型，评价IL-15药物给药后对肿瘤转移和生长的影响。二、材料与实验方法1、受试蛋白IL-15二聚体蛋白3和二聚体蛋白7。2、受试动物C57BL/6小鼠，SPF，10-16g，♂，购自上海西普尔·必凯实验动物有限责任公司。3、动物试验方法给药方案：32只C57BL/6小鼠，分为4组，每组8只。通过尾静脉注射1.5×105个B16F10细胞，在第1、2、10天腹腔注射PBS、2μgIL-15、11μg二聚体蛋白3和14μg二聚体蛋白7(IL-15、二聚体蛋白3和二聚体蛋白7等摩尔，均为0.16nmol)。在第21天处死小鼠，取出肺部，称重，观察肺部黑色肿瘤块，拍照，固定在中性甲醛中，计数黑色肿瘤块数量。三、实验结果给药方案中，PBS组小鼠肺部有大量转移生长的黑色素瘤(175±23)；IL-15组肺部有大量的黑色素瘤块(157±20)，约为PBS组的90％；二聚体蛋白3给药组肺部可见少量转移的黑色素瘤块(26±6)，约为PBS组的15％；二聚体蛋白7给药组肺部可见较多转移的黑色素瘤块(83±28)，约为PBS组的49％，PBS组肺部肿瘤块数量明显高于二聚体蛋白3和二聚体蛋白7组，与IL-15组相比没有显著差别。IL-15组肺部肿瘤块数量明显高于二聚体蛋白3组。二聚体蛋白7组的肺部肿瘤块数量明显高于二聚体蛋白3组，如图2所示。PBS组肺部相对重量明显高于二聚体蛋白3和二聚体蛋白7给药组，但与IL-15组相比没有显著差别。IL-15组肺部相对重量明显高于二聚体蛋白3和二聚体蛋白7组，如图3所示。综上所述，在B16F10小鼠模型中，3种蛋白的药效为二聚体蛋白3＞二聚体蛋白7＞IL-15。测试例4.裸鼠荷瘤模型一、实验目的利用HCT-116(人结肠癌)细胞建立裸鼠荷瘤模型，评价IL-15药物给药后对肿瘤生长的影响。二、材料与实验方法1、受试蛋白IL-15二聚体蛋白3和二聚体蛋白7。2、受试动物BALB/cA-nude裸小鼠，SPF，16-20g，♀，购自上海西普尔·必凯实验动物有限责任公司。3、动物试验方法(1)裸小鼠实验室环境适应10天。(2)肿瘤细胞移植裸小鼠右肋部皮下接种HCT-116细胞(5×106/只)，肿瘤生长20天，长至100+15mm3后将动物随机分组(d0)，每组6只。(3)给药剂量及方法腹腔注射给药，每2天给药一次，每周给药3次，IL-15为2μg/只，二聚体蛋白3为10μg/只，二聚体蛋白7为20μg/只(IL-15、二聚体蛋白3和二聚体蛋白7为等摩尔，均为0.15nmol)。(4)移植瘤体积及裸小鼠体重测定每周测2-3次瘤体积(图4)，称体重，记录数据。第27天处死，取瘤。(5)数据统计使用Excel统计软件：平均值以avg计算；SD值以STDEV计算；SEM值以STDEV/SQRT计算；组间差异P值以TTEST计算。肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×L长×L短2相对体积(RTV)＝VT/V0抑瘤率(％)＝(CRTV-TRTV)/CRTV(％)其中V0、VT分别为实验开始时及实验结束时的肿瘤体积。CRTV、TRTV分别为实验结束时的空白对照组(Blank)及实验组的相对肿瘤体积。三、实验结果IL-15蛋白对HCT-116肿瘤的生长抑制作用如表3和图4所示，IL-15、3和7等摩尔连续给药27天，每2天给药一次后，IL-15、二聚体蛋白3、二聚体蛋白7组均能抑制HCT-16细胞移植瘤生长，抑制率分别为32％、45％、20％，但由于个体差异较大，与空白对照组相比没有显著性。给药过程中没有出现小鼠死亡，各组小鼠给药期间体重没有明显下降，提示目前给药剂量没有明显的毒副作用。给药第27天剥离各组小鼠肿瘤称取重量，如图5所示，图中*表示：与空白结照Blank相比p＜0.05，即二聚体蛋白3组与Blank组相比肿瘤重量显著降低，IL-15和二聚体蛋白7组肿瘤重量与Blank组相当。综上所述，在HCT-116裸鼠模型中，3种蛋白的抑瘤效果为二聚体蛋白3＞IL-15＞二聚体蛋白7。表3.给药蛋白对HCT-116裸小鼠移植瘤的疗效测试例5.重度联合免疫缺陷NOD-SCID鼠一、实验目的采用HCT-116细胞和人外周血单核细胞(PBMC)在体外混合，接种重度联合免疫缺陷NOD-SCID鼠，评价IL-15给药后对肿瘤生长的影响。Nod-SCID小鼠理论上自身缺乏T细胞和NK细胞，所以用IL-15给药后可以激活人的PBMC细胞(包括T和NK细胞)杀死肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞生长。Nod-SCID小鼠模型更接近人的免疫系统杀死肿瘤细胞。二、材料与实验方法1、受试蛋白IL-15购自近岸蛋白质科技有限公司；IL-15二聚体蛋白3和7。2、受试动物NODSCID雌性小鼠购自北京维通利华(批号：11400700006527)，6-8周龄，体重20g左右，每个药物组5只。3、动物试验方法(1)SCID鼠实验室环境适应10天。(2)PBMC细胞分离无菌转移6ml淋巴细胞分离液(LymphocyteSeparationMedium，LSM)到15ml离心管中(之前轻轻颠倒瓶子使LSM充分混合)；将用肝素抗凝处理的静脉血4ml与同体积生理盐水混合，仔细将稀释血液8ml加入离心管中的LSM(室温，缓慢加入，在血液和LSM中形成一个明显的分层，不要将稀释血液混合入LSM中)；室温下400g离心15-30分钟，离心可以沉淀红细胞和多核白细胞同时可以在LSM上形成一层单核淋巴细胞；吸出淋巴细胞上方4-6cm的血浆；吸取淋巴细胞层以及它下面一半的LSM转移到另外的一个离心管。加入等体积的平衡盐缓冲液PBS，室温1000rpm离心10分钟；用PBS缓冲液或RPMI-1640培养基清洗细胞，用RPMI-1640培养基重悬细胞；37℃培养3-4小时，收集悬浮细胞，计数。(3)肿瘤细胞移植将HCT-116细胞和PBMC细胞按照4∶1比例混合均匀，SCID鼠右肋部皮下接种混合细胞细胞(HCT-116细胞：5×106/只，PBMC：1.25×106/只)，肿瘤生长28天。(4)给药剂量及方法接种HCT-116+PBMC细胞后第二天开始腹腔注射给药，每2天给药一次，连续给药10次，IL-15为2μg/只，3为10μg/只，7为20μg/只(IL-15、3和7为等摩尔，均为0.15nmol)。(5)移植瘤体积及裸小鼠体重测定从第12天开始每2-3天瘤体积，称体重，记录数据。第28天处死，取瘤。(6)数据统计使用Excel统计软件：平均值以avg计算；SD值以STDEV计算；SEM值以STDEV/SQRT计算；组间差异P值以TTEST计算。肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×L长×L短2抑瘤率(％)＝(VT-V0)/VT(％)其中V0、VT分别为实验开始时及实验结束时的肿瘤体积。三、实验结果接种细胞后第二天开始IL-15、二聚体蛋白3和二聚体蛋白7等摩尔连续给药20天，每2天给药1次。IL-15蛋白对HCT-116+PBMC肿瘤生长的抑制作用如表4和图6所示，第1周各组均没有发现肿瘤。从第12天(D12)开始，各组均出现肿瘤，且IL-15、二聚体蛋白3、二聚体蛋白7组肿瘤体积小于PBMC组。到第28天(D28)，IL-15、二聚体蛋白3组能明显抑制HCT-16细胞移植瘤生长，抑制率分别为42％、41％；二聚体蛋白7组抑制率为27％，但与PBMC组相比没有显著性。给药过程中没有出现小鼠死亡，各组小鼠给药期间体重没有明显下降，提示目前给药剂量没有明显的毒副作用。给药第28天剥离各组小鼠肿瘤称取重量，如图7所示，二聚体蛋白3组与PBMC组相比肿瘤重量显著降低；IL-15组肿瘤重量比PBMC组降低，但没有显著性；二聚体蛋白7组肿瘤重量与PBMC组相当。综上所述，在HCT-116+PBMCSCID鼠模型中，3种蛋白的抑瘤效果为3≥IL-15＞7。表4.给药蛋白对HCT-116+PBMCSCID鼠移植瘤的疗效表中*表示：p＜0.05，vsPBMC。测试例6体外Mo7e细胞增殖实验1.主要实验材料Mo7e(人巨核细胞白血病细胞株)购自于协和医学院；IL-15购自Novoprotein，货号C016，IL-15类似物(二聚体蛋白11-17)来自内部制备；CellCountingKit-8(CCK-8)，购自WST，货号EX660；GM-CSF购自NOVOProtein，货号CC79。2.实验方法1)Mo7e用改良型RPMI-1640培养基(含2.05mML-谷氨酰胺，10％FBS和15ng/mlGM-CSF)在37℃(5％CO2)细胞培养箱中培养；2)将培养状态良好的Mo7e细胞150×g，室温离心5min，弃上清；3)细胞沉淀用无GM-CSF的培养基洗涤两遍后计数；4)调整细胞浓度铺96孔板，细胞数量2×104/孔，体积90μl(无GM-CSF)，置于细胞培养箱中静置培养；5)IL-15及其类似物(二聚体蛋白11-17)分别用PBS作四倍倍比稀释，在96孔板细胞培养2小时后加入细胞培养体系中，10μl/孔，每个受试物浓度做三重复并设空白对照孔(只加PBS)；6)细胞培养板在培养箱中继续培养3天；7)所有检测孔中加入10ulCCK-8，培养箱中孵育3h；8)检测450nm下的吸光度(OD450)。样品EC50(nM)相对活性IL-15(对照)100.0011951.5712186.9613400.38142526.19152496.47162988.73172060.19在Mo7e增殖实验中待测分子二聚体蛋白11-17均明显优于IL15对照分子。测试例7小鼠肺转移模型1.动物试验方法32只C57BL/6小鼠(SPF，上海西普尔·必凯实验动物有限责任公司)，通过尾静脉注射1.5×105个B16F10细胞(中科院上海生命科学研究院细胞资源中心，货号TCM36)，分为4组，每组8只。在第1天腹腔注射PBS、2μgIL-15，4.2μg、12.5μg二聚体蛋白17，每2-3天称重一次，在第14天每组各处死1只，观察肺转移情况。在第16天处死全部小鼠，取出肺部，称重，观察肺部黑色肿瘤斑点，拍照，固定在甲醇中，计数黑色肿瘤斑点数量。2.实验结果PBS组小鼠肺部有大量转移生长的黑色素瘤(73±43)。IL-15给药组肺部可见大量转移的黑色素瘤斑点(65±29)，为PBS组的90％。二聚体蛋白17-4.2μg给药组肺部可见部分转移的黑色素瘤斑点(32±24)，为PBS组的44％；二聚体蛋白17-12.5μg给药组肺部可见少数转移的黑色素瘤斑点(14±14)，为PBS组的19％。在本次的B16F10小鼠模型中，二聚体蛋白17的药效明显优于IL-15，如图8表示各组试验小鼠的肺部转移肿瘤斑点数量，与PBS组相比，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。PBS组肺部相对重量高于二聚体蛋白17给药组，如图9所示。二聚体蛋白17-12.5ug剂量组小鼠在给药后第5天体重略有降低，然后逐渐恢复，如图10所示。综上，二聚体蛋白17能够抑制B16F10细胞在小鼠体内的肺部转移，并且具有剂量效应。当前第1页1 2 3