一种吡唑啉酮缩呋喃酰肼合铜配合物的制备及生物活性的制作方法

本发明公开一种吡唑啉酮缩呋喃酰肼合铜配合物的制备及应用。

背景技术：

2014年世界卫生组织(WHO)发布报告称，癌症是全球发病和死亡的主要原因，2012年约有1400万新发癌症病例和820万例癌症相关死亡，预计今后二十年新发病例数将增加约70%。目前，化学药物是肿瘤治疗的主要手段之一。1969年，顺铂以其优异抗癌作用，开创了金属配合物作为抗肿瘤药物研究的新领域。随后各种新型抗肿瘤金属配合物相继被合成，如新型铂配合物（卡铂，奥沙利铂等）、有机锡配合物、席夫碱过渡金属配合物等，并逐步投入临床应用。

其中，席夫碱及其配合物在抗菌、抗病毒、抗肿瘤等多方面具有优异的性能。而吡唑啉酮类席夫碱是庞大的席夫碱家族中重要的分支之一。其中4-酰基吡唑啉酮席夫碱金属配合物具有良好的抗菌、抗病毒、抗炎镇痛、抗氧化作用及抗肿瘤等多种生物学活性，并且能够克服传统抗肿瘤药物(如顺铂)引起的耐药性及毒副作用，是具有潜力的新型抗肿瘤药物，是目前配位化学和生物无机化学研究的热点领域。

这些配合物主要通过诱导细胞凋亡而发挥抗癌作用，其功效与其诱导细胞凋亡的能力有着密切联系。当配合物进入细胞中，与细胞中的微量金属元素生成药物-金属-酶的混合配合物从而阻止病毒的复制。与此同时，一些核酸和蛋白质又是很好的配位体，能与从配合物中解离出来的金属离子发生作用，使一些活性的官能团失活，因此具有明显的细胞毒活性。

本发明在4-酰基吡唑啉酮的基础上缩合2-呋喃甲酰肼，合成4-酰基吡唑啉酮席夫碱1-苯基-3-甲基-4-丙酰基-5-吡唑啉酮缩2-呋喃酰肼，以此为配体，合成出一种新型配合物1-苯基-3-甲基-4-丙酰基-5-吡唑啉酮缩2-呋喃酰肼合铜，该配合物具有很好抗肿瘤活性，特别是对人食管癌细胞Eca-109和人宫颈癌细胞Hela的生长具有明显的抑制作用，因此该类配合物将会成为非常具有潜力的一类新药之一。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一类新型配合物1-苯基-3-甲基-4-丙酰基-5-吡唑啉酮缩2-呋喃酰肼合铜的制备及生物活性。使用常规的溶液合成法，得到六核铜配合物晶体。通过光谱法证实该配合物与DNA具有良好的结合作用，其结合方式为插入模式。通过细胞毒活性试验（MTT染色法）说明对两种癌症细胞人食管癌细胞Eca-109和人宫颈癌细胞Hela的生长具有良好的抑制作用，且优于常用抗癌药物顺铂。所以本发明所合成的六核铜配合物具有良好的生物活性，可作为潜在的抗癌药物。

通过X射线单晶衍射仪分析本发明所合成的六核铜配合物，其化学结构为[Cu6L6]。配体H2L为1-苯基-3-甲基-4-丙酰基-5-吡唑啉酮缩2-呋喃酰肼。本发明所述的铜配合物中六个配体由酮式转变为烯醇式，然后各失去两个氢原子，转变为L2⁻后与六个铜（II）离子配位，使所述六核铜配合物具有六元环结构。不对称单元中Cu(II)与一个配体的两个氧原子、一个氮原子以及相邻配体吡唑环上的一个氮原子发生配位，形成CuN2O2的配位环境。

本发明提供的六核铜配合物的制备方法包括如下步骤。

步骤A：将2-呋喃酰肼的乙醇溶液在搅拌下缓慢滴加到等摩尔量的1-苯基-3-甲基-4-丙酰基-5-吡唑啉酮的乙醇溶液中，滴加适量冰醋酸。搅拌回流4h后静置、冷却、抽滤、乙醇淋洗，得黄色配体产物。

步骤B：称取上述配体0.05g于烧杯中，加入10mL甲醇使之溶解，再向其中滴加5mL醋酸铜(0.0295g)的甲醇溶液。室温下搅拌3h，缓慢挥发后析出晶体，过滤洗涤干燥后得目标六核铜配合物的晶体。

经紫外吸收光谱实验证实该六核铜配合物在245nm和355nm处均出现强紫外吸收峰，并随着DNA浓度的增加，六核铜配合物的最大吸收峰强度逐渐降低，表现出减色效应，减色率分别为9%和11%，说明配合物与DNA发生了结合作用。

经EB-DNA的荧光淬灭实验证实，当激发波长为520 nm时，DNA-EB体系在波长为602 nm左右具有较强的荧光发射光谱，随着配合物的逐步加入，DNA-EB体系的荧光强度有明显的下降，说明六核铜配合物能把EB与DNA的结合位点夺走，代替EB与DNA结合，证实了配合物以插入方式与DNA发生结合。由经典的stern-volmer方程定量计算六核铜配合物对HS-DNA的猝灭常数Kq为：2.6×10⁵ M^-1。根据方程KEB[EB]=kapp[complex]，KEB=1.0×10⁷ M^-1，[EB]=7 μM，计算该六核铜配合物的表观键合常数Kapp为5.7×10⁶ M^-1。小于经典键合常数10⁷ M^-1，说明六核铜配合物与HS-DNA的结合能力较强。

经细胞毒活性试验（MTT染色法）实验表明所述六核铜配合物对两种癌细胞人食管癌细胞Eca-109和人宫颈癌细胞Hela的生长具有良好的抑制作用（对人食管癌细胞Eca-109的IC50值为1.93 ± 0.07，人宫颈癌细胞Hela的IC50值为1.27 ± 0.03），且明显优于常用抗癌药物顺铂（对人食管癌细胞Eca-109的IC50值为72.35 ± 0.20，人宫颈癌细胞Hela的IC50值为15.16 ± 0.07），可作为潜在的抗癌药物。

总之，本发明提供的六核铜配合物以插入方式对DNA有良好结合效果，并且对两种癌细胞人食管癌细胞Eca-109和人宫颈癌细胞Hela的生长具有良好的抑制作用（对人食管癌细胞Eca-109的IC50值为1.93 ± 0.07，人宫颈癌细胞Hela的IC50值为1.27 ± 0.03）。所以本发明所合成的六核铜配合物具有良好的生物活性，可作为潜在的抗癌药物。

附图说明

图1为铜配合物晶体结构图。

图2为加入不同量的HS-DNA后，铜配合物的紫外吸收光谱变化示意图。

图3为铜配合物EB竞争结合HS-DNA的荧光淬灭实验结果图。

图4 为铜配合物对两种癌细胞的细胞毒活性。

具体实施方式

下面结合附图所示实施例，对本发明作进一步详述。

实施例1：配体L的合成。

将2-呋喃酰肼的乙醇溶液在搅拌下缓慢滴加到等摩尔量的1-苯基-3-甲基-4-丙酰基-5-吡唑啉酮的乙醇溶液中，滴加适量冰醋酸。搅拌回流4h后静置、冷却、抽滤、乙醇淋洗，得黄色产物。C18H18N4O3（分子量：338.37）。元素分析实验值（理论值%）：C 63.84（63.70）；H 5.32（5.58）；N 16.55（16.34）。结果与理论值基本一致。

实施例2：铜配合物的合成。

称取上述配体0.05 g于烧杯中，加入10 mL甲醇使之溶解，再向其中滴加5 mL醋酸铜(0.0295 g)的甲醇溶液。室温下搅拌3h，缓慢挥发后析出晶体，过滤洗涤干燥后得目标产物，收集晶体。C108H96N24O18Cu6（分子量：2399.33）。元素分析实验值（理论值%）：C 53.94（54.01）；H 3.88（4.01）；N 13.89（14.03）。结果与理论值基本一致。

通过X射线单晶衍射仪分析（图1）说明，本发明所合成的六核铜配合物的化学结构式为[Cu6L6]。其中配体H2L为1-苯基-3-甲基-4-丙酰基-5-吡唑啉酮缩2-呋喃酰肼。本发明所述的铜配合物中六个配体由酮式转变为烯醇式，然后各失去两个氢原子，转变为L2⁻后与六个铜（II）离子配位，使所述六核铜配合物具有六元环结构。不对称单元中Cu(II)与一个配体的两个氧原子、一个氮原子以及相邻配体吡唑环上的一个氮原子发生配位，形成CuN2O2的配位环境。

实施例3：实施例2得到的六核铜配合物的相关测试和试验。

一、两个单核铜配合物的紫外吸收光谱变化试验。

向参比池和样品池中分别加入同体积的空白Tris-HCl缓冲液（缓冲溶液用超纯水配制，称取0.6057 g Tris溶解在50 mL超纯水中，之后用0.1 mol/L HCl溶液定容至250 mL，调节pH值为7.2）和配合物溶液（50μM）。逐次往参比池和样品池中加入相同体积的HS-DNA溶液（HS-DNA粉末购买于北京索莱宝科技有限公司），测定配合物紫外-可见光谱的变化规律。

实验结果：如图2所示，六核铜配合物在245 nm和355 nm处均出现强紫外吸收峰。当样品池中DNA浓度的逐渐增加后，六核铜配合物的最大吸收峰强度逐渐降低，表现出减色效应，减色率分别为9%和11%，说明配合物与DNA发生了结合作用。

二、EB-DNA的荧光淬灭变化试验。

先测试不含配合物的DNA-EB体系的荧光光谱，之后逐次向DNA-EB体系中加入50μL配合物溶液，振荡5 min后测定荧光猝灭光谱的变化规律。由经典的stern-volmer方程F0 / F=1+Kq[Q]来探讨其猝灭机理，F0和F分别是加入配合物前后DNA-EB体系的荧光强度，[Q]是配合物的浓度，Kq是配合物与DNA的结合常数，可以由拟合直线的斜率求得。根据方程KEB[EB]=kapp[complex]，KEB=1.0×10⁷ M^-1，[EB]=7 μM，计算该六核铜配合物的表观键合常数Kapp。

实验结果：由图3可以看出激发波长为520 nm时，DNA-EB体系在波长为602 nm左右具有较强的荧光发射光谱，随着配合物的逐步加入，DNA-EB体系的荧光强度有明显的下降，说明六核铜配合物能把EB与DNA的结合位点夺走，代替EB与DNA结合，证实了配合物与DNA的作用方式是插入模式。由经典的stern-volmer方程定量计算其与DNA的结合能力，六核铜配合物对HS-DNA的猝灭常数Kq为：2.6×10⁵ M^-1。根据方程KEB[EB]=kapp[complex]，KEB=1.0×10⁷ M^-1，[EB]=7 μM，计算该六核铜配合物的表观键合常数Kapp为5.7×10⁶ M^-1。小于经典键合常数10⁷ M^-1。说明此六核铜配合物与HS-DNA的结合能力较强。

三、化合物对两种癌细胞的细胞毒活性实验。

MTT：3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐是一种染料，能检测细胞生长情况。其原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，测定甲瓒的吸光度来表征细胞数。其基本步骤如下：将细胞接种于96孔板中培养，每孔2×10⁴个细胞，每个梯度6个复孔。在37℃，5％CO2下孵育24h后，不同浓度药物加入相应孔板中继续作用肿瘤细胞24h，同时设置对照孔(细胞、培养液、DMSO)。24h后每孔加入MTT（0.5mg／mL）10μL，继续培养4h，小心吸弃上层清液，加DMSO(100μL／孔)，轻微震荡，室温反应30min，用酶标仪检测570nm处的吸光度值。

实验结果：以人食管癌Eca-109细胞和人宫颈癌Hela细胞为实验模型，使用噻唑蓝(MTT)染色法对配合物的体外抗肿瘤活性进行初步筛选。以公式细胞抑制率（%）=（1-A570样品-A570对照）×100%，及分析软件GraphPad Prism 5.0进行数据处理和曲线拟合，得到细胞50%抑制率时所对应药物(配合物)浓度，也就是配合物对肿瘤细胞的IC50值（如图4：对人食管癌细胞Eca-109的IC50值为1.93 ± 0.07，人宫颈癌细胞Hela的IC50值为1.27 ± 0.03），且明显优于常用抗癌药物顺铂（对人食管癌细胞Eca-109的IC50值为72.35 ± 0.20，人宫颈癌细胞Hela的IC50值为15.16 ± 0.07），说明该配合物对人食管癌Eca-109细胞和人宫颈癌Hela细胞均有明显的抑制作用，进一步表明此六核铜配合物对两种细胞均具有较好的抗癌活性，可作为潜在的抗癌药物。